2017, Vol. 38
2. 广东药科大学基础学院生物化学与分子生物学教研室, 广州 510006
2. Department of Biochemistry and Molecular Biology, School of Basic Courses, Guangdong Pharmaceutical University, Guangzhou 510006, Guangdong, China
2型糖尿病 (type 2 diabetes mellitus，T2DM) 是一种以高血糖为主要特征的内分泌代谢性疾病，胰岛素分泌异常和胰岛素抵抗是其主要的病理机制[1]。随着高血糖的持续和胰岛素抵抗的加剧，胰岛素分泌功能会进一步衰退[2]，主要表现为β细胞分泌胰岛素的功能下降和β细胞数量的减少[3~5]。因此，增加胰岛β细胞的数量和保护胰岛β细胞的功能已成为降糖药物研发的有价值的发展方向之一[6]。目前研究发现多种中药可以通过修复与保护胰岛β细胞，达到对T2DM的治疗效果[7~9]。黄芪多糖 (Astragalus polysaccharides，APS) 是豆科植物黄芪Astragalus membranaceus (Fisch.) Bge.的有效活性成分，是治疗T2DM的传统中药，具有改善消化系统功能、调节机体免疫、改善糖脂代谢等作用[10]。研究表明，APS治疗T2DM能够有效降低血糖[2, 11]，但是其降糖机制并未完全阐明。本研究拟从APS对胰岛β细胞功能和数量的影响来探讨APS治疗T2DM大鼠的作用机制。
1 材料和方法 1.1 实验动物SPF级SD雄性大鼠由广州中医药大学动物中心提供，动物生产许可证号：SCXK (粤)2013-0020；SD大鼠在广东药科大学实验动物中心喂养，动物使用许可证号：SYXK (粤)2012-012。
1.2 T2DM大鼠模型的构建及药物干预SPF级SD雄性大鼠24只，体质量180~200 g，饲养于广东药科大学实验动物中心，室温26 ℃，相对湿度60%，每日光照12 h，自由摄食、饮水。适应性饲养1周后，随机将大鼠分为T2DM模型组 (16只) 和正常对照组 (NC组，8只)。T2DM模型组大鼠给以高脂饲料 (基础饲料58%、猪油18%、蔗糖20%、蛋黄3%，由广东省医学实验动物中心提供) 喂养，喂养8周后，禁食12 h，一次性腹腔注射30 mg/kg链脲佐菌素 (streptozotocin，STZ；临用前用柠檬酸缓冲溶液配制成pH为4.2~4.5、浓度为1%的STZ溶液)。NC组大鼠以普通饲料喂养8周后，一次性腹腔注射等体积的柠檬酸缓冲液。1周后，尾部采血，用血糖仪检测T2DM模型组大鼠禁食12 h的空腹血糖 (fasting blood glucose，FBG)。FBG≥11.1 mmol/L并伴有“三多一少”症状的大鼠即为建模成功的T2DM模型大鼠。随后，将T2DM模型大鼠随机分为APS治疗组和T2DM组，每组8只，分别以APS[700 mg/(kg·d)，西安瑞林生物技术公司，采用超声波提取法提取APS，利用紫外分光光度法检测APS含量为70%]和等体积的蒸馏水灌胃8周 (1次/d)。药物干预期间，NC组大鼠继续给予正常饲料喂养，T2DM组和APS治疗组大鼠继续给予高脂饲料喂养。
1.3 检测指标 1.3.1 血清中生化指标的测定采用全自动生化分析仪检测实验大鼠血清中FBG、三酰甘油 (triglyceride，TG)、总胆固醇 (total cholesterol，TC)、高密度脂蛋白胆固醇 (high density lipoprotein cholesterol，HDL-C)、低密度脂蛋白胆固醇 (low density lipoprotein cholesterol，LDL-C) 的水平；采用酶联免疫吸附试验 (enzyme linked immunosorbent assay，ELISA) 测定空腹胰岛素 (fasting insulin，FINS) 水平，按Insulin Human ELISA Kit (Abcam，USA) 说明书操作，并用胰岛素分泌指数HOMA-β来评价大鼠胰岛β细胞的功能，HOMA-β=20×FINS/(FBG-3.5)。
1.3.2 胰腺病理组织学检查和免疫组织化学染色药物干预8周后，禁食12 h，处死大鼠后取胰腺，生理盐水冲洗后用滤纸拭干，浸泡于10%中性甲醛溶液中固定，Leica EG1160石蜡包埋机 (德国) 包埋，连续切取2~3 μm厚的切片。
苏木精-伊红 (Hematoxylin-Eosin，H-E) 染色：切片脱蜡至水后，H-E染色、乙醇分化、氨水返蓝后脱水封片。
免疫组织化学染色：切片脱蜡至水后，按Super SensitiveTM IHC Detection System Kit (Bioworld，USA) 试剂盒说明书操作。具体操作如下：加内源性过氧化氢酶阻断剂室温孵育10 min，PBS冲洗后加封闭剂封闭5 min，PBS冲洗后加抗胰岛素抗体 (1:500，Abcam，USA)4 ℃孵育过夜。次日取出室温平衡30 min，PBS冲洗后，加抗体放大剂室温孵育10 min，PBS冲洗后，加高敏酶标抗小鼠/兔IgG聚合物室温孵育10 min，PBS冲洗，DAB显色后，苏木精复染，乙醇分化、氨水返蓝后脱水封片。
使用Olymplus BX51生物显微镜在100倍和200倍的视野下观察各组大鼠的胰腺组织病理学特征，并计数胰岛β细胞 (棕褐色的胰岛素免疫反应阳性细胞即为β细胞)，每例均对整张组织切片中的所有胰岛β细胞进行计数。
1.4 统计学处理实验数据采用GraPhad Prism 5.0统计软件 (GraphPad Software，Inc.) 进行分析，组内比较采用配对t检验，组间比较采用非配对t检验，检验水准 (α) 为0.05。大鼠胰腺组织免疫组化实验结果采用Image-Pro Plus 6.0专业图像分析软件 (Media Cybernetics，美国) 进行分析。
2 结果 2.1 T2DM大鼠模型的构建和APS的降糖效果STZ注射前，各组大鼠的FBG为3.6~5.8 mmol/L，组间差异无统计学意义；STZ注射后1周，T2DM模型大鼠的FBG均＞11 mmol/L，并伴有“三多一少”症状。测定APS干预8周后各组大鼠的FBG，结果如表 1所示。与NC组比较，T2DM组大鼠的FBG升高 (P < 0.05)；与T2DM组比较，APS治疗组大鼠的FBG降低 (P < 0.05)。
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表 1 各组大鼠的FBG、TG、TC、HDL-C、LDL-C、FINS和HOMA-β水平 Tab 1 Levels of FBG, TG, TC, HDL-C, LDL-C, FINS and HOMA-β of rats in three groups |
2.2 APS对T2DM大鼠脂代谢的影响
由表 1可知，与NC组比较，T2DM组大鼠的TG和LDL-C升高，HDL-C降低 (P < 0.05)；与T2DM组比较，APS治疗组大鼠的TG和LDL-C均降低 (P < 0.05)。
2.3 APS对T2DM大鼠FINS水平和HOMA-β值的影响由表 1可知，与NC组比较，T2DM组大鼠的FINS和HOMA-β值均降低 (P < 0.05)；与T2DM组比较，APS治疗组大鼠的FINS和HOMA-β值均升高 (P < 0.05)。
2.4 APS对T2DM大鼠胰腺组织的影响 2.4.1 大鼠胰腺组织病理学变化本实验采用H-E染色法观察大鼠胰腺组织的病理学变化，结果如图 1所示。(1) NC组 (图 1A、1B)：镜下胰岛细胞着色较浅、细胞核蓝色着染，胰腺外分泌腺粉红色着染；胰岛呈圆形或椭圆形团状，散在分布于胰腺外分泌腺中；胰岛界限清楚，胰岛细胞胞质丰富，胰岛细胞未见变性。(2) T2DM组 (图 1C、1D)：与NC组比较，T2DM组大鼠胰岛呈不规则状，散在分布于胰腺外分泌腺中；胰岛数目显著减少，胰岛体积显著缩小，结构不清，8只大鼠胰岛内细胞数量均减少并伴有颗粒脱失、空泡变性。(3) APS治疗组 (图 1E、1F)：与T2DM组比较，APS治疗组大鼠的胰岛体积增大，胰岛内细胞数量增多，颗粒脱失和空泡变性现象有所改善。
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图 1 各组大鼠胰腺组织苏木精-伊红染色 Fig 1 Hematoxylin-eosin (H-E) staining of pancreatic tissue of rats in three groups A, B: NC group; C, D: T2DM group; E, F: APS treatment group. NC: Normal control; T2DM: Type 2 diabetes mellitus; APS: Astragalus polysaccharides. Islets are indicated by the black arrows. Original magnification: ×100 (A, C, E), ×200 (B, D, F) |
2.4.2 大鼠胰岛β细胞数量变化
本实验采用免疫组织化学染色法观察并计数胰岛β细胞，结果见图 2。(1) NC组 (图 2A、2B)：低倍镜下可见胰岛多数呈圆形或椭圆形，胰岛内有大量β细胞，且占据胰岛的绝大部分，排列紧密；高倍镜下可见胰岛β细胞胞质内阳性反应产物呈颗粒状，即胰岛素分泌颗粒，胰岛素分泌颗粒在胞质内存在丰富、着色深。(2) T2DM组 (图 2C、2D)：与NC组比较，低倍镜下可见T2DM组大鼠的胰岛形状多不规则，边缘不整齐，胰岛内β细胞数量显著减少，胰岛内常出现较大的空隙；高倍镜下可见胰岛β细胞胞质内胰岛素分泌颗粒减少甚至缺失，颗粒着色浅、分布不均匀。(3) APS治疗组 (图 2E、2F)：与T2DM组比较，低倍镜下可见APS治疗组大鼠胰岛β细胞数量增加，散在分布在胰岛中央；高倍镜下可见胰岛β细胞胞质内胰岛素分泌颗粒显著增多，颗粒着色深，分布较集中。
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图 2 各组大鼠胰岛β细胞免疫组化染色 Fig 2 Immunohistochemical staining of pancreatic islet β cells of rats in three groups A, B: NC group; C, D: T2DM group; E, F: APS treatment group. NC: Normal control; T2DM: Type 2 diabetes mellitus; APS: Astragalus polysaccharides. Islets are indicated by the black arrows. Original magnification: ×100 (A, C, E), ×200 (B, D, F) |
3 讨论
黄芪始载于《神农本草经》，被列为上品，味甘，微温；归肺，脾经，有补气升阳、固表止汗之效。研究发现，黄芪是古代治疗消渴的高频用药之一，在消渴病 (糖尿病属于中医学“消渴”范畴) 的治疗中发挥重要作用[12]。APS是黄芪中一种有较强生物活性的大分子化合物，具有增强免疫[13]、降血糖[14]、抗炎[15]等多种药理作用，研究表明APS对T2DM及其并发症有明显的治疗效果，能够有效地降低T2DM患者的血糖，但目前APS治疗T2DM的作用机制还不明确。
本实验发现，APS可以降低T2DM大鼠的FBG、TG和LDL-C，升高FINS和HOMA-β值，改善T2DM大鼠胰岛组织的病理学形态，增加胰岛β细胞的数量，提示APS可能通过改善T2DM大鼠糖脂代谢紊乱、保护胰岛β细胞功能，从而延缓T2DM病程的发展。
T2DM是因胰岛素分泌和功能异常而引起的糖类、脂肪等代谢紊乱的一种慢性疾病。刘洪凤等[16]研究APS对高脂饮食 (碳水化合物50%，蛋白质13%，脂肪30%，其他成分7%) 联合STZ诱导的T2DM大鼠血脂的影响发现，APS能降低T2DM大鼠血清中TG、胆固醇、低密度脂蛋白的含量，同时能升高高密度脂蛋白的含量。但也有研究发现APS只能降低单纯STZ诱导的T2DM大鼠的TG或TC，而对LDL-C和HDL-C没有影响[17~18]。本实验发现，APS可以降低高脂饮食 (基础饲料58%、猪油18%、蔗糖20%、蛋黄3%) 联合STZ诱导的T2DM大鼠血清中TG和LDL-C的含量，升高HDL-C的含量，但对TC没有影响。本研究与其他研究结果不一致的原因可能与T2DM大鼠的造模方式、高脂饲料的配方及喂养时间等有关。
目前对APS治疗T2DM的机制研究主要集中在改善胰岛素抵抗和增加胰岛素分泌两方面。裴文丽[19]研究发现，T2DM大鼠建模成功后血清FINS水平增加，而APS可以降低T2DM大鼠血清的FINS水平，改善胰岛素抵抗。胡琛琛等[20]和Wu等[21]研究也发现，APS对T2DM大鼠血清FINS水平没有影响，但可以显著增加T2DM大鼠胰岛素敏感性。还有研究发现T2DM大鼠建模成功后血清中FINS的水平降低，APS有增加T2DM大鼠血清FINS水平的趋势，还可以增加胰岛素敏感性[22~23]。Li等[13]也发现，APS可以增加1型糖尿病小鼠的血清FINS水平，增加胰岛素敏感性。本实验发现T2DM大鼠建模成功后血清FINS水平降低，APS可以增加T2DM大鼠的血清FINS水平、升高HOMA-β值，但对T2DM大鼠的胰岛素敏感性没有影响。本实验用H-E染色法观察胰腺组织病理学变化，发现APS可以部分修复胰岛细胞的病理形态，改善颗粒脱失和空泡变性现象；另外采用免疫组化法观察并检测胰岛β细胞的数量还发现APS可以增加β细胞的数量。由此推测APS增加T2DM大鼠的血清中FINS水平可能是通过保护胰岛β细胞的功能、促进胰岛β细胞增生或者抑制胰岛β细胞凋亡来实现的。陈玉涛和薛承锐[24]从分子生物学角度探讨了APS的降糖机制，发现APS可以上调慢性胰腺炎大鼠胰腺Kir6.2的表达，促进胰岛素的分泌。李琳等[25]研究也发现APS可以使胰岛MIN6细胞的增殖活性升高、细胞凋亡率下降和胰岛素分泌功能升高。
综上所述，APS能够明显改善T2DM大鼠的糖脂代谢，其机制可能是通过对T2DM大鼠胰岛β细胞的保护作用进而促进FINS的分泌来实现的。本研究结果为APS治疗T2DM的可行性提供了新证据，同时为APS治疗T2DM的机制研究提供了新方向，但APS改善胰岛β细胞的分子机制还有待进一步的研究。
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