2017, Vol. 38
肺泡巨噬细胞 (alveolar macrophage，AM) 是由单核细胞迁移至肺组织中发育而成，是呼吸道防御致病微生物的第一道防线。作为一种重要的炎性细胞，AM主要通过分泌炎性因子、趋化因子在急性呼吸窘迫综合征 (acute respiratory distress syndrome, ARDS) 中发挥其炎性效应[1]。
MicroRNA (miRNA) 是一类长度约为22个核苷酸的非编码单链小分子RNA，主要通过结合靶基因的3′-UTR抑制下游基因的转录，是基因表达的重要调控者，可以调控细胞生理过程的各个方面[2-3]。有研究表明，miRNA可以调节免疫、免疫细胞的增殖和分化及抗体生成，是炎性介质发挥炎性作用的关键因子[4-5]。作为miRNA的一员，miRNA-142-3p (miR-142-3p) 在炎性疾病的发生、发展中也起到了重要作用，IPA、Targetscan等网站预测miR-142-3p可调控高迁移率族蛋白B1(high-mobility group box 1, HMGB1)。HMGB1是一种新发现的晚期炎性细胞因子，能刺激其他炎症因子如白介素 (IL)-1β、IL-6和IL-8等的释放，在炎症反应中具有重要作用。研究发现，在非小细胞肺癌及神经母细胞瘤中，HMGB1受miR-142-3p的调控[6-7]；Kanaan等[8]在脂多糖 (lipopolysaccharide, LPS) 诱导的小鼠腹膜炎模型中发现，HMGB1表达与miR-142-3p呈负相关；而在ARDS的发生和发展中，有关miR-142-3p与HMGB1调控关系的研究尚未见报道。本研究通过LPS体外诱导大鼠AM产生炎症反应，在细胞内导入miR-142-3p拟似物 (miR-142-3p mimic) 上调miR-142-3p的表达，采用实时定量PCR (qPCR) 及酶联免疫吸附测定 (ELISA) 等方法检测miR-142-3p的表达量和HMGB1的含量，进一步研究LPS体外诱导的大鼠AM的炎症反应模型中miR-142-3p对HMGB1表达的调控及其分子机制。
1 材料和方法 1.1 实验材料大鼠AM NR8383细胞 (中国科学院上海细胞库)，F12K细胞培养液、Lipofectamine 2000、DMEM培养液 (Life Technology)，胰酶 (碧云天生物技术研究所)，D-PBS (Life Science Products)，胎牛血清 (FBS，Gibco)，LPS (Sigma)，平底6孔、24孔细胞培养板 (Corning)，鼠HMGB1 ELISA试剂盒 (上海信然生物有限公司)，qPCR试剂 (Promega)，miR-142-3p mimic (上海锐博生物有限公司，序列：5′-UGU AGU GUU UCC UAC UUU AUG GA-3′, 编号MIMAT0000848)，抗HMGB1抗体、抗β-actin抗体 (Abcam)。
1.2 LPS体外诱导大鼠AM炎症反应使用F12K完全培养液培养大鼠AM NR8383细胞，收集对数生长期细胞，将细胞以1×106/mL的密度接种于6孔板，每孔2 mL，37 ℃、5%CO2培养箱中培养1 h。分别用100 ng/mL的LPS刺激细胞0、6、24、48 h后收集上清液和细胞。每组设3个复孔。
1.3 qPCR检测细胞中miR-142-3p和HMGB1的表达细胞经相应处理后，PBS漂洗3次，按QIAGEN试剂盒说明书抽提细胞miRNA，并按反转录试剂盒 (天晶生物) 说明书进行RNA反转录；反转录产物行qPCR扩增，U6作为内参，测定各基因的相对表达量。miR-142-3p上游引物为：5′-TGT AGT GTT TCC TAC TTT ATG GA-3′，下游引物为：5′-CCA GTG CAG GGT CCG AGG T-3′；HMGB1上游引物为：5′-GCC TCC TTC GGC CTT CTT CT-3′，下游引物为：5′-TCA GCT TGG CGG CCT TCT TT-3′；U6上游引物为：5′-CTC GCT TCG GCA GCA CA-3′, 下游引物为：5′-AAC GCT TCA CGA ATT TGC GT-3′。
1.4 ELISA法测定上清液中HMGB1的含量细胞经相应处理后，收集细胞培养液，离心取上清，按照HMGB1 ELISA试剂盒说明书检测上清液中HMGB1的含量。
1.5 蛋白质印迹法检测细胞中HMGB1蛋白的表达细胞经相应的处理后，PBS漂洗3次，按文献[9]所述方法操作，多功能成像系统成像、拍照，使用Quantity One软件进行结果分析。
1.6 细胞转染miR-142-3p mimic取对数生长期细胞，用F12K完全培养液调整细胞密度为2×106/mL，接种于24孔板中，每孔0.5 mL。37 ℃培养箱中孵育1 h，将lipo2000混合液 (lipofectamine 2000 2 μL + OMEM 48 μL) 和mimic混合液 (miR-142-3p mimic 2.5 μL + OMEM 47.5 μL、miR-142-3p mimic 0 μL + OMEM 47.5 μL) 混合均匀后加入到24孔板中，每孔50 μL，37 ℃培养箱中孵育24 h，用100 ng/mL的LPS刺激细胞0、6、24、48 h后分别收集上清液和细胞。
1.7 qPCR检测AM中肿瘤坏死因子α (tumor necrosis factor α，TNF-α)、IL-6、IL-1β和巨噬细胞炎症蛋白2β(macrophage inflammatory protein-2β，MIP-2β) mRNA的表达按照1.3项下方法测定各炎症因子的表达水平。TNF-α上游引物为：5′-ACC AGC AGA TGG GCT GTA CC-3′，下游引物为：5′-TGG GCT CAT ACC AGG GCT TG-3′；IL-6上游引物为：5′-GCC ACT CAC CTC TTC AGA ACG-3′，下游引物为：5′-CAG TGC CTC TTT GCT GCT TTC-3′；IL-1β上游引物为：5′-GGG AAG AAT CTA TAC CTG TCC-3′，下游引物为：5′-TGC TCT GCT TGA GAG GTG CT-3′；MIP-2β上游引物为：5′-CCA CTC GCC AGC TCC TCA AT-3′，下游引物为：5′-CCC TGT ACC CTG ATG GTT GGT-3′。
1.8 统计学处理应用SPSS 21.0软件进行数据分析，实验重复3次。所有计量资料以x±s表示，两组间比较采用t检验。检验水准 (α) 为0.05。
2 结果 2.1 LPS诱导miR-142-3p及HMGB1的表达与0 h时相比，LPS刺激后6、24、48 h时miR-142-3p在AM NR8383细胞中的表达均升高；在48 h时达到高峰，与0 h时相比差异有统计学意义 (P < 0.05，图 1A)。HMGB1的表达随LPS刺激时间的延长而逐渐升高，在24 h时达到高峰，与0 h时相比差异有统计学意义 (P < 0.05，图 1B、1C)，而在48 h时又下降到一定水平。
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图 1 LPS处理后AM NR8383细胞中miR-142-3p (A) 和HMGB1(B, C) 的表达水平及与时间的效应关系 Fig 1 Relationship between time effect and expressions of miR-142-3p (A) and HMGB1 (B, C) in AM NR8383 cells stimulated with LPS LPS: Lipopolysaccharide; AM: Alveolar macrophage; HMGB1: High-mobility group box 1. *P < 0.05 vs 0 h. n=3, x±s |
2.2 miR-142-3p下调HMGB1的表达
在大鼠AM NR8383细胞中转染miR-142-3p mimic后，检测NR8383细胞中HMGB1 mRNA的表达水平和细胞培养液及细胞中HMGB1蛋白的表达水平。结果 (图 2) 显示，转染miR-142-3p mimic后，NR8383细胞中miR-142-3p的表达升高 (P < 0.05)，而HMGB1 mRNA及蛋白的表达均降低 (P < 0.05)。
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图 2 miR-142-3p对AM NR8383细胞HMGB1表达的影响 Fig 2 Effect of miR-142-3p on HMGB1 expression in AM NR8383 cells AM: Alveolar macrophage; HMGB1: High-mobility group box 1. *P < 0.05 vs miR-control group. n=3, x±s |
2.3 LPS诱导的AM中miR-142-3p负向调控HMGB1的表达
转染miR-142-3p mimic 24 h后，加入LPS分别诱导AM 0、6、24、48 h，用ELISA试剂盒检测转染组和未转染组上清中HMGB1的含量。结果 (图 3) 显示，培养0、6、24 h时miR-142-3p mimic转染组中HMGB1的含量均低于未转染组 (P < 0.05)。表明过表达miR-142-3p能够负向调控HMGB1的表达水平。
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图 3 miRNA-142-3p负向调控HMGB1的表达 Fig 3 miRNA-142-3p downregulates expression of HMGB1 protein HMGB1: High-mobility group box 1. *P < 0.05 vs miR-control group. n=3, x±s |
2.4 LPS诱导的AM中miR-142-3p下调炎症因子mRNA的表达
大鼠AM转染miR-142-3p mimic后，分别加入LPS诱导AM 0、6、24、48 h，qPCR检测AM中TNF-α、IL-6、IL-1β和MIP-2β mRNA的表达水平。结果 (图 4) 显示，与未转染组相比，转染miR-142-3p mimic后NR8383细胞中TNF-α、IL-6、IL-1β以及MIP-2β mRNA的表达水平均降低，差异有统计学意义 (P < 0.05)。
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图 4 过表达miR-142-3p对LPS诱导的AM NR8383细胞炎症因子表达的影响 Fig 4 Influence of miR-142-3p overexpression on inflammatory factors in AM NR8383 cells stimulated with LPS LPS: Lipopolysaccharide; AM: Alveolar macrophage; TNF-α: Tumor necrosis factor-α; IL-6: Interleukin-6; IL-1β: Interleukin-1β; MIP-2β: Macrophage inflammatory protein-2β. *P < 0.05 vs miR-control group. n=3, x±s |
3 讨论
ARDS是由肺内外因素引起的毛细血管内皮细胞弥漫性受损，可出现肺水肿及肺不张等不良表现[10]，表现为顽固性低氧血症，进而出现多器官功能衰竭。ARDS临床病死率高，且发生和发展过程复杂，发病机制尚未完全阐明。有研究表明，ARDS的发生和发展与炎症反应、水通道蛋白、凝血/纤溶系统失衡、肺细胞 (AM、肺泡上皮细胞等) 凋亡等有关[11-14]，而在众多机制中，炎性反应可能是其发病机制的“中心环节”[11]。研究发现，miRNA在炎症反应中具有重要的生物学功能，其中miR-142-3p已经被证实在小鼠的基底膜、脾脏及胸腺中均有表达，特别是在B细胞亚群和T细胞亚群中高表达[15-16]。此外，在LPS诱导树突细胞建立的炎症模型中，miR-142-3p的表达明显上升[17]，提示miR-142-3p在炎症发展中可能具有重要作用，但其对炎症因子的影响机制尚不明确。有研究发现，在感染牛结核杆菌的巨噬细胞中，miR-142-3p可通过调控IRAK-1基因的表达抑制炎症因子 (TNF-α、IL-1、IL-8) 的表达[18]。HMBG1是一种非组蛋白核蛋白，可在大多数真核细胞的胞质、胞核中表达，而在AM胞核中的表达仅维持在基础水平；在炎症反应过程中，HMGB1可作为一种重要的炎症介质促进免疫细胞 (淋巴细胞、树突细胞、单核巨噬细胞等) 分泌炎性因子 (TNF-α、IL-1、IL-8等)[19-20]。Li等[21]发现在呼吸机及脓毒症引起的肺损伤中，HMGB1可通过诱导线粒体氧化性损伤和增加肺内皮细胞通透性加重肺损伤。Jiang等[22]发现，在LPS诱导的小鼠ALI/ARDS模型中，HMGB1的表达明显增加，表明HMGB1可能参与LPS诱导的ALI/ARDS的发病机制。
本研究通过LPS体外诱导大鼠AM产生炎症反应，并检测了miR-142-3p的表达情况，结果显示LPS刺激后miR-142-3p的表达上升，且在48 h时达到高峰。在LPS诱导的大鼠AM中转染miR-142-3p mimic上调miR-142-3p的表达后，与未转染组相比，miR-142-3p过表达组细胞中各种炎症细胞因子 (TNF-α、IL-6、IL-1β和MIP-2β) mRNA的表达均显著下降，表明miR-142-3p参与了LPS诱导的AM的炎症反应过程。Kanaan等[8]研究发现，在LPS诱导的小鼠腹膜炎模型中，刺激24 h和48 h后miR-142-3p的表达均升高，而HMGB1的表达降低，表明HMGB1与miR-142-3p呈负相关。为探究miR-142-3p调控LPS诱导的AM炎症反应过程的具体机制，本实验检测了LPS处理后不同时间点HMGB1蛋白的表达情况，结果显示，LPS刺激6 h后HMGB1的表达略微增加，至24 h时达到高峰，而至48 h时又下降到一定水平，表明miR-142-3p可能负向调控HMGB1的表达。为验证这一推测，本研究在大鼠AM中转染miR-142-3p mimic上调细胞中miR-142-3p表达，然后使用LPS分别诱导转染组和非转染组，检测LPS诱导的大鼠AM中过表达miR-142-3p对HMGB1 mRNA和蛋白的调控作用，结果显示与未转染组相比，miR-142-3p过表达组细胞中HMGB1 mRNA和蛋白的表达均显著下降。但miR-142-3p对HMGB1的影响机制尚不明确。有研究发现，miRNA可通过调控TRAF6和IRAK1等激活TLR4下游信号，从而促进TNF-α、IL-6、IL-1β等炎症因子大量释放，导致炎症反应加重[23]。Qi等[24]发现，在鼠巨噬细胞体外实验中，上调miRNA的表达可负向调控NF-κB1的表达，减少炎症因子分泌，而下调miRNA的表达可正向调控NF-κB1表达，增加炎症因子分泌。研究表明，在缺氧/复氧诱导的小鼠心肌细胞中过表达miR-142-3p和抑制HMGB1基因的表达都可以抑制TGF-β1/Smad3信号通路，表明miR-142-3p可能通过TGF-β1/Smad3信号通路负向调控HMGB1[25]。Wang等[26]研究发现，在小鼠骨关节炎模型中，miR-142-3p抑制HMGB1的表达后，NF-κB通道信号减弱，提示miR-142-3p通过TGF-β1/Smad3信号通路负向调控HMGB1。miRNA调控基因表达及信号传导通路的机制复杂，单个miRNA可能调控多个靶基因，单个靶基因可能需要多个miRNA调控；同时，同一miRNA在不同细胞中也可能调控不同靶基因。
综上所述，本研究表明在利用有效浓度的LPS体外诱导大鼠AM的炎症反应过程中，miR-142-3p可能是通过负向调控HMGB1的表达发挥对炎症反应的干预作用。因此，miR-142-3p有可能成为ARDS的治疗靶点。但是本实验还存在不足之处，即miR-142-3p负向调控HMGB1的具体机制尚不明确，还需进一步的探讨和研究。
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