2017, Vol. 38
2. 第二军医大学药学院无机化学教研室, 上海 200433
2. Department of Inorganic Chemistry, School of Pharmacy, Second Military Medial University, Shanghai 200433, China
5-氟尿嘧啶 (5-fluorouracil，5-FU) 是一类抑制DNA合成的抗代谢药物，最初用于肿瘤治疗和青光眼手术，近年来广泛应用于瘢痕治疗并展现出良好的治疗效果[1-5]。目前5-FU在治疗瘢痕时多采用病灶内注射的方式[6]，但病灶内注射是侵入性疗法，周期长，易造成患者疼痛及色素沉着、溃疡等不良反应[7]。另有报道指出口服5-FU的生物利用率低，半衰期短 (8~20 min)，患者顺应性差[8]。与皮下注射和口服给药相比，经皮给药系统具有无侵入性、自我管理方便、避免肝脏的首过效应、延长药物作用时间的优点[9]，鉴于经皮给药系统的这些优势，本实验将5-FU制备成经皮给药贴剂，以期为临床瘢痕的治疗提供一种新的方法。
驻极体是一类能长期保存空间电荷和偶极电荷的功能电介质材料[10]。作为一种物理促渗方法，驻极体在经皮给药系统中的应用已受到极大地关注。大量研究证明驻极体对小分子药物[11-12]和大分子药物[13-14]的经皮促渗效果显著，而驻极体对贴剂基质中药物的体外释放研究较少。本实验将5-FU制备成驻极体压敏胶贴剂，研究驻极体和化学促渗剂对5-FU贴剂体外释放规律的影响，为后期的贴剂药效考察奠定基础。
1 材料和方法 1.1 试剂与仪器5-FU[生工生物工程 (上海) 股份有限公司]；Eudragit E100(德国Rohm公司)；柠檬酸三丁酯 (上海国药集团化学试剂有限公司)；水溶性氮酮 (北京贝丽莱斯生物化学有限公司)；无水乙醇、甲醇、冰乙酸、乙醇胺 (上海国药集团化学试剂有限公司)；其他试剂均为分析纯。
RYJ-6B型药物透皮扩散试验仪 (上海黄海药检仪器有限公司)；FA1004型电子天平 (上海天平仪器厂)；Hi-tech超纯水系统 (Hi-tech设备有限公司)；DL-120B智能超声波清洗器 (上海之信仪器有限公司)；真空抽滤装置FB-01T (上海摩速科学器材有限公司)；栅控电晕充电系统 (大连理工大学静电与特种电研究所)；ESR102A振动电容静电计 (北京华晶汇科技有限公司)；初黏性试验仪 (海达国际仪器有限公司)；持黏性试验装置 (自制)；LC-2010高效液相色谱仪 (岛津仪器有限公司)。
1.2 驻极体材料及制备 1.2.1 驻极体材料聚丙烯 (日本东丽株式会社，膜厚13 μm)。
1.2.2 驻极体的制备将5 cm×5 cm的双裸面聚丙烯薄膜平铺于铝块上，室温下置于栅控恒压电晕充电系统上进行电晕充电，栅压分别为－1 000 V和－2 000 V，注极8 min。充电后驻极体的表面电位用表面电位计测量，分别制备得－1 000 V驻极体和－2 000 V驻极体。
1.3 负极性驻极体5-FU的制备 1.3.1 5-FU贴剂的制备将适量Eudragit E100和柠檬酸三丁酯溶于一定量无水乙醇中，超声溶解20 min，加入10 mg 5-FU粉末，超声溶解至透明。冷却后涂布在5 cm×5 cm聚丙烯膜上，涂布面积为20.25 cm2。常温下自然挥干12 h，覆盖防黏层，制备得到5-FU贴剂。
1.3.2 5-FU贴剂的性质考察初黏力的测定 (滚球法)：按GB4852-1984测定初黏力。持黏力的测定：按GB4851-1988测定持黏力。体外释放量的测定：将5-FU贴剂裁剪成合适大小，固定在Franz扩散池的供给室与接受室之间，背衬层向上，含药层面向接受室并与接收液 (超声除气后的PBS，pH=7.4) 恰好接触。(32.0±0.5) ℃恒温水浴，磁力搅拌速度500 r/min，分别于2、4、8、12、24、36 h取样1 mL，同时补充等量接收液，样品经0.22 μm微孔滤膜过滤后，高效液相色谱仪测定峰面积A值并进行定量分析。
1.3.3 含化学促渗剂5-FU贴剂的制备参照1.3.1项下5-FU贴剂的制备方法，在混合溶液中加入一定质量浓度的水溶性氮酮，制备得到含化学促渗剂的5-FU贴剂。
1.3.4 负极性驻极体5-FU贴剂的制备将5-FU贴剂和含化学促渗剂5-FU贴剂的背衬层分别置于－1 000 V驻极体和－2 000 V驻极体的充电面上，制备得到负极性驻极体5-FU贴剂和含化学促渗剂的负极性驻极体5-FU贴剂。
1.4 药物分析方法的建立利用高效液相色谱法建立5-FU的标准曲线。色谱柱：Diamonsil C18柱 (4.6 mm×250 mm，5 μm；Dikma公司)，流动相：甲醇-缓冲盐溶液 (体积比5:95；缓冲盐溶液由去离子水、0.15%乙酸和0.15%乙醇胺混合配制)，检测波长265 nm，流速1 mL/min，柱温60 ℃，进样量10 μL。
1.5 统计学处理采用SPSS 21.0软件进行数据分析，计量资料以x±s表示，组间比较采用重复测量设计资料的方差分析。检验水准 (α) 为0.05。
2 结果 2.1 5-FU标准曲线的建立在给定的色谱条件下，5-FU标准溶液在10~400 μg/mL浓度之间的药物浓度 (C) 与峰面积 (A) 线性关系良好 (A=349 85C+35 922，R=0.999 9)。其他组分对测定无干扰，高、中、低3个不同浓度的日内、日间相对标准偏差 (RSD) 均小于3%，相对回收率大于99%。
2.2 含化学促渗剂5-FU贴剂的处方优化 2.2.1 增塑剂和压敏胶对5-FU贴剂黏力的影响由表 1和表 2可知，单因素考察发现增塑剂与E100的质量比和Eudragit E100的质量均会影响5-FU贴剂的初黏力和持黏力，增塑剂与Eudragit E100的质量比或Eudragit E100的质量增加后，5-FU贴剂的初黏力呈不同程度的上升，持黏力则呈不同程度的降低。
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表 1 增塑剂对5-FU贴剂黏力的影响 Tab 1 Influence of plasticizer on adhesive power of 5-FU patch |
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表 2 E100对5-FU贴剂黏力的影响 Tab 2 Influence of E100 on adhesive power of 5-FU patch |
2.2.2 化学促渗剂对5-FU贴剂黏力的影响
单因素考察发现不同质量分数的水溶性氮酮对5-FU贴剂的初黏力和持黏力均有影响。Eudragit E100和增塑剂的用量不变时，水溶性氮酮质量分数为3%和5%的含化学促渗剂5-FU贴剂的初黏力较5-FU贴剂 (对照组) 和1%的含化学促渗剂5-FU贴剂增加，而持黏力下降；且氮酮质量分数越高，5-FU贴剂的持黏力的下降越明显 (图 1)。
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图 1 水溶性氮酮对5-FU贴剂持黏力的影响 Fig 1 Influence of water-soluble azone on holding capacity of 5-FU patch Control: 5-FU patch; 1%-5% Azone: 5-FU patch with 1%-5% water-soluble azone. 5-FU: 5-Fluorouracil. *P < 0.05 vs control group. n=5, x±s |
2.2.3 负极性驻极体对5-FU贴剂黏力的影响
由图 2可知，不同电压的负极性驻极体均会不同程度地降低5-FU贴剂的持黏力，且电压越高持黏力降低越多。但不同电压的负极性驻极体对5-FU贴剂的初黏力无明显影响。
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图 2 负极性驻极体对5-FU贴剂持黏力的影响 Fig 2 Influence of negative polarity electret on holding capacity of 5-FU patch Control: 5-FU patch; －1 000 V: 5-FU patch with －1 000 V negative polarity electret; －2 000 V: 5-FU patch with －2 000 V negative polarity electret. 5-FU: 5-Fluorouracil. *P < 0.05 vs control group. n=5, x±s |
2.2.4 含化学促渗剂5-FU贴剂的最优处方
单因素考察各影响因素后，以初黏力、持黏力和体外释放量为指标，选用L9(33) 正交表进行试验，利用综合平衡法分析后，确定含化学促渗剂5-FU贴剂的最终优化处方：Eudragit E100为0.25 g、m(增塑剂):m(E100)=50:100、水溶性氮酮的质量分数为3%、5-FU为10 mg。
2.3 5-FU贴剂体外释放量的影响因素 2.3.1 3%水溶性氮酮对5-FU贴剂体外释放量的影响图 3所示为5-FU贴剂和含3%水溶性氮酮5-FU贴剂36 h内的体外释放曲线，由图可见：(1) 5-FU贴剂2 h的体外释放量达 (77.58±6.78)μg/cm2，存在突释现象，随后体外释放量平稳上升。36 h的累积释放量为 (132.99±1.40) μg/cm2，累积释放率为26.93%，其释放规律满足Higuchi方程，即Q=2.466 5 
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图 3 3%水溶性氮酮对5-FU贴剂体外释放率的影响 Fig 3 Influence of 3% water-soluble azone on cumulative release rate of 5-FU in vitro Control: 5-FU patch; 3% Azone: 5-FU patch with 3% water-soluble Azone.5-FU: 5-Fluorouracil. *P < 0.05 vs control group. n=6, x±s |
2.3.2 负极性驻极体对5-FU贴剂体外释放量的影响
图 4所示为－1 000 V负极性驻极体和－2 000 V负极性驻极体5-FU贴剂的体外释放曲线。由图可见，36 h时－1 000 V负极性驻极体5-FU贴剂的累积释放量为 (151.84±2.16) μg/cm2，是5-FU贴剂 (对照组) 的1.14倍；36 h时－2 000 V负极性驻极体5-FU贴剂的累积释放量为 (181.17±11.95) μg/cm2，是5-FU贴剂的1.36倍。－1 000 V负极性驻极体和－2 000 V负极性驻极体均促进了5-FU贴剂的体外释放，而且较高电压的－2 000 V负极性驻极体对药物体外释放的促进作用更强 (P < 0.05)。与对照组相比，在0~4 h之间负极性驻极体组与对照组差异无统计学意义 (P > 0.05)，贴剂释放8 h后，负极性驻极体组的体外释放量高于对照组 (P < 0.05)。
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图 4 负极性驻极体对5-FU贴剂体外释放率的影响 Fig 4 Influence of negative polarity electret on cumulative release rate of 5-FU in vitro Control: 5-FU patch; －1 000 V electret: 5-FU patch with －1 000 V negative polarity electret; －2 000 V electret: 5-FU patch with －2 000 V negative polarity electret. 5-FU: 5-Fluorouracil. *P < 0.05 vs control group; △P < 0.05 vs －1 000 V electret group. n=6, x±s |
2.3.3 3%水溶性氮酮联合负极性驻极体对5-FU贴剂体外释放量的影响
图 5所示为3%水溶性氮酮联合负极性驻极体5-FU贴剂的释放曲线。与单用3%水溶性氮酮相比，3%水溶性氮酮与负极性驻极体联合使用时5-FU贴剂的体外释放量更高 (P < 0.05)，36 h时3%水溶性氮酮联合－1 000 V负极性驻极体组5-FU的累积释放量为 (373.53±26.00) μg/cm2，是3%水溶性氮酮组的1.24倍；36 h时3%水溶性氮酮联合－2 000 V负极性驻极体组5-FU的累积释放量为 (452.11±32.24) μg/cm2，是3%水溶性氮酮组的1.50倍。
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图 5 3%水溶性氮酮联合负极性驻极体对5-FU贴剂体外释放率的影响 Fig 5 Influence of 3% water-soluble azone combined with negative polarity electret on cumulative release rate of 5-FU in vitro Control: 5-FU patch; 3% Azone: 5-FU patch with 3% water-soluble azone; －1 000 V electret+3% azone: 5-FU patch with 3% water-soluble azone combined with －1 000 V negative polarity electret; －2 000 V electret+3% azone: 5-FU patch with 3% water-soluble azone combined with －2 000 V negative polarity electret. 5-FU: 5-Fluorouracil. *P < 0.05 vs control group; △P < 0.05 vs 3% azone group; ▲P < 0.05 vs －1 000 V electret+3% azone group. n=6, x±s |
3 讨论
本实验以5-FU为模型药物，聚丙烯酸酯Eudragit E100为基质，柠檬酸三丁酯为增塑剂，制备了5-FU压敏胶贴剂，按《中华人民共和国药典》规定考察5-FU贴剂的初黏力、持黏力和体外释放量，结果显示制备的5-FU贴剂有较好的初黏力和持黏力，体外释放规律满足Higuchi方程。
水溶性氮酮的促渗作用具有浓度依赖性，浓度越高体外释放量越多。这是因为化学促渗剂也是一种成形剂，会进入压敏胶的交联网络中，影响贴剂的机械性能，改变贴剂的内聚力[15]。持黏力是贴剂内聚强度的体现，取决于基体树脂的相对分子质量和交联密度[16]。水溶性氮酮加入后，5-FU贴剂的交联密度减小，导致小分子药物向5-FU贴剂表面迁移的速率加快。当加入水溶性氮酮的质量分数为5%时，贴剂出现拉丝，从皮肤揭下时有残胶，所以本研究优选水溶性氮酮的质量分数为3%。与对照组相比，3%水溶性氮酮的加入提高了5-FU贴剂中5-FU的体外释放量，可能是因为亲水性药物5-FU在全疏水性聚丙烯酸酯Eudragit E100中的兼容性差[17]，水溶性氮酮的加入增强了5-FU在压敏胶中的兼容性，从而使药物的体外释放量增多。
皮肤角质层是药物经皮渗透的最大障碍，往往需利用物理或化学促渗技术促进药物的经皮吸收。驻极体是一种常用的物理促渗技术，有不少学者已证明驻极体可以促进药物的经皮吸收[12-14, 18-20]。本实验进一步研究了负极性驻极体对5-FU贴剂药物释放规律的影响，结果显示不同电压的负极性驻极体对贴剂药物的体外释放均有不同程度的促进作用，且电压越高促进作用越强。这可能是因为5-FU是小分子极性药物，具有二元弱酸结构[21]，离子型带负电，而负极性驻极体为贴剂提供了较稳定的静电场，与5-FU产生了静电排斥力，给予了5-FU向表面迁移的推力，从而促进了5-FU的体外释放。为进一步研究负极性驻极体促进贴剂药物体外释放的机制，本实验研究了负极性驻极体对5-FU贴剂初黏力和持黏力的影响，结果显示不同电压的负极性驻极体不同程度地降低了5-FU贴剂的持黏力，且电压越高持黏力降低越多，而对初黏力无明显影响。与水溶性氮酮相比，负极性驻极体对5-FU贴剂黏力的影响较小。我们推测驻极体静电场可能降低了基质分子之间和药物与基质分子之间的作用力，使5-FU贴剂的内聚力下降，宏观上表现为5-FU贴剂的持黏力下降。在5-FU贴剂内聚力降低的情况下，静电排斥力的作用可能发挥得更好，加快了药物向5-FU贴剂表面迁移的速率。
为进一步比较改变持黏力和静电排斥力对5-FU贴剂体外释放量的作用，本研究将负极性驻极体与水溶性氮酮联合作用于5-FU贴剂。结果显示，－2 000 V负极性驻极体联合水溶性氮酮组5-FU的累积释放量达 (452.11±32.24) μg/cm2，是3%水溶性氮酮组的1.50倍。这说明两者联用对5-FU贴剂的体外释放具有协同促进作用。与水溶性氮酮对5-FU贴剂持黏力的改变程度相比，两者联用对5-FU贴剂持黏力的改变有所增加，说明负极性驻极体与水溶性氮酮联用更大程度地降低了5-FU贴剂的交联密度，使药物释放的阻力进一步减小，负极性驻极体对5-FU的静电排斥作用发挥得更充分。
综上所述，驻极体静电场不仅可以作用于皮肤，降低角质层的渗透阻力从而促进药物的经皮吸收，还能够改变贴剂基质分子之间的作用力。驻极体静电场可以影响5-FU贴剂的黏力，并能够利用静电排斥力使极性药物分子极化，进而改变药物向贴剂表面的迁移速率，增加药物的体外释放量。
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