第二军医大学学报  2017, Vol. 38 Issue (3): 300-305   PDF    
载天冬酰胺酶纳米囊的活性及体外稳定性评价
李瑶1, 晏子俊2, 何丹1, 胡雪原1, 张景勍1     
1. 重庆医科大学重庆高校药物工程研究中心, 重庆 400016;
2. 攀枝花市中心医院药学部, 攀枝花 617067
摘要: 目的 制备载天冬酰胺酶(asparaginase,AN)透明质酸-聚乙二醇[hyaluronic acid-graft-poly(ethylene glycol),HA-g-PEG]/α-环糊精(α-cyclodextrin,α-CD)纳米囊(HA-g-PEG/α-CD hollow nanocapsules loaded with asparaginase,AHAPs),并对其体外活性及稳定性进行初步考察。 方法 采用自组装法制备AHAPs,测定AHAPs的最适温度、最适pH、粒径、zeta电位和包封率,并通过热稳定性、酸碱稳定性、抗胰蛋白酶水解能力、抗金属离子和有机化合物能力、血浆稳定性和贮存稳定性实验对游离AN与AHAPs的体外稳定性差异进行考察。通过荧光实验对AN与空白HA-g-PEG/α-CD纳米囊的相互作用进行研究。 结果 AHAPs的最适温度为50 ℃,最适pH值为7.0,测得平均粒径为(424.53±7.25)nm,zeta电位为(-48.77±0.99)mV。经计算,AHAPs的平均包封率为(64.40±1.82)%。稳定性实验结果显示,AHAPs中AN的体外稳定性及活性明显优于游离AN,且部分实验结果差异具有统计学意义(P < 0.05)。荧光实验结果表明,AHAPs中AN生物活性的提高可能与AN和空白HA-g-PEG/α-CD纳米囊的相互作用引起蛋白质残基微环境和酶构象改变相关。 结论 AHAPs不仅提高了AN的活性,而且明显增强了AN的体外稳定性。
关键词: 天冬酰胺酶     纳米囊     活性     稳定性    
Activity of hollow nanocapsules loaded with asparaginase and evaluation of in vitro stability
LI Yao1, YAN Zi-jun2, HE Dan1, HU Xue-yuan1, ZHANG Jing-qing1     
1. Chongqing Research Center for Pharmaceutical Engineering, Chongqing Medical University, Chongqing 400016, China;
2. Department of Pharmacy, Panzhihua Central Hospital, Panzhihua 617067, Sichuan, China
Supported by National Natural Science Foundation of China (30973645) and Natural Science Foundation of Chongqing (csct2015jcyjBX0027).
Abstract: Objective To prepare hyaluronic acid-graft-poly (ethylene glycol)/α-cyclodextrin hollow nanocapsules loaded with asparaginase (AHAPs) and to investigate their in vitro stability and activity. Methods We prepared the AHAPs by self-assembly method and detected the optimal temperature, optimal pH value, particle size, zeta potential and entrapment efficiency. Then the differences in in vitro stability between AHAPs and free asparaginase (AN) were investigated by measuring thermal stability, acid-and basic-stability, stability to trypsinase, stability to metal ions and organic compounds, plasma stability and storage stability. The interaction between AN and blank hyaluronic acid-graft-poly (ethylene glycol)/α-cyclodextrin hollow nanocapsules was studied through the fluorescence experiment. Results The optimal temperature for AHAPs was 50 ℃, the optimal pH value was 7.0, the mean particle size was (424.53±7.25) nm, and the mean zeta potential was (-48.77±0.99) mV. The entrapment efficiency of AHAPs was (64.40±1.82)%. The results of stability experiment showed that AHAPs had a significantly better in vitro stability than free AN, and some stability experimental results were statistically significant (P < 0.05). Fluorescence experiment showed that the improvement of biological activity of AHAPs may be related to the change of protein residues microenvironment and enzyme conformation caused by the interaction between AN and blank hyaluronic acid-graft-poly (ethylene glycol)/α-cyclodextrin hollow nanocapsules. Conclusion It has been found that AHAPs can not only improve the activity but also greatly enhance the stability of AN in vitro.
Key words: asparaginase     nanocapsules     activity     stability    

天冬酰胺酶 (asparaginase, AN) 是一种具有抗肿瘤作用的化疗药物,能将天冬酰胺水解为天冬氨酸和氨[1]。AN广泛用于治疗淋巴系统恶性肿瘤,如儿童急性淋巴细胞白血病、霍奇金淋巴瘤、淋巴肉瘤和黑肉瘤[2]。AN可以降解淋巴肿瘤细胞的必需氨基酸外源天冬酰胺,从而导致肿瘤细胞死亡[3-5]。尽管AN对肿瘤细胞的抑制作用明显,但其具有的半衰期短、稳定性差、高免疫原性等缺点限制了AN在临床上的应用[5-6]

针对AN的缺陷现已进行了下列研究[7-8]:(1) 化学修饰,如聚乙二醇 (PEG) 修饰;(2) 固定化,将AN制成用各种载体固定的固定酶;(3) 脂质体包封,定向给药,减少毒副作用;(4) 利用蛋白质工程技术对AN进行分子改造等。但改造后的AN仍存在酶活性损失、易脱落和生物相容性等问题[8]。自组装纳米囊作为一种新型的可封装酶、小分子药物、基因等物质的药物载体,具有生物膜相似性,能提高封装药物的稳定性,延长被封装药物的生物半衰期、提高封装药物的生物利用度以及降低毒副作用等优点[9-11]

本实验主要考察自组装法制备的天冬酰胺酶透明质酸 (HA)-聚乙二醇[hyaluronic acid-graft-poly (ethylene glycol), HA-g-PEG]/α-环糊精 (α-cyclodextrin, α-CD) 纳米囊 (HA-g-PEG/α-CD hollow nanocapsules loaded with asparaginase,AHAPs) 的活性和体外稳定性。实验首先对AHAPs的生物学特性进行了考察,然后通过AHAPs和游离AN的热稳定性、酸碱稳定性、抗部分金属离子及化合物能力、抗胰蛋白水解能力、血浆稳定性和贮存稳定性实验,对AHAPs的体外稳定性进行了评价,最后通过荧光光谱实验对AN与脂质膜的相互作用进行了研究。

1 材料和方法 1.1 仪器与试剂

AB 204S电子天平 (瑞士Mettler Toledo仪器公司);KQ 2200B型超声波清洗器 (江苏昆山市超声仪器有限公司);Milli-Q超纯水系统 (美国Millipore公司);pH计 (上海精密科学仪器有限公司);RE-52AA型旋转蒸发器 (上海亚荣生化仪器厂);UV-7504PC紫外分光光度计 (上海欣茂仪器有限公司);F-2500型荧光分光光度计 (日本Hitachi公司);85-2型恒温磁力搅拌器 (上海司乐仪器有限公司)。AN (以色列Prospec公司,批号:312PLASP1,纯度:96%);HA (山东曲阜市广龙生物制品厂,批号:20131027,纯度:95.6%);PEG (Sigma-Aldrich公司,批号:EY-(BR)-2669,纯度:99%);AHAPs (实验室自制,批号:20151022);其他试剂均为分析纯。

1.2 AHAPs的特性考察

将AN溶于HA-g-PEG溶液中后,缓慢滴加至α-CD饱和溶液中,一定温度下磁力搅拌2 h,即得AHAPs [11-12]。取AHAPs溶液,加入Tris-HCl缓冲液稀释后,使用马尔文粒度仪测定其粒径和zeta电位。按葡聚糖凝胶法[13]测定AHAPs的包封率。取空白HA-g-PEG/α-CD纳米囊溶液 (空白HA-g-PEG/α-CD纳米囊的制备方法与AHAPs的基本一致,唯一区别在于不加入AN),加入乙醇摇匀至溶液澄清,得溶液1。再取等体积过柱后的AHAPs溶液,同样加入乙醇摇匀至溶液澄清,得溶液2。最后取AHAPs溶液,加入破乳剂摇匀至溶液澄清,得溶液3。分别取溶液1、2、3,加入考马斯亮蓝G-250,混合,放置2 min后,以溶液1作为空白对照,测定溶液2和溶液3的光密度 (D) 值D1D2,并计算包封率。包封率 (%)=(D1/D2)×100%。

1.3 AN活性的测定

参照奈斯勒试剂法[14]测定。取适量天冬酰胺底物溶液,加入0.10 mL AN溶液后预热2 min,于37 ℃下反应10 min。加入0.10 mL三氯醋酸溶液,离心,取上清液,加入适量蒸馏水和奈斯勒指示剂。10 min后,于480 nm处测定其D值。酶活力单位定义为:在规定条件下,催化一个单位的底物释放1 μmol氨所需的酶量。

1.4 最适温度

将样品溶液分别放置于加热到20、30、37、40、50、60、70、80 ℃的水浴锅中,在各温度下预热2 min,于相应温度下反应10 min后,分别按照1.3项下的方法测定游离AN及AHAPs中AN的活性,并以AN最适温度下活性为100%计算相对活性。

1.5 最适pH

用pH分别为5.5、6.0、6.5、7.0、7.5、8.0、8.5、9.0、9.5的Tris-HCl缓冲液配制底物AN溶液,放置37 ℃下预热2 min后,按照1.3项下的方法测定游离AN及AHAPs中AN的活性。以AN最适pH下活性为100%计算相对活性。

1.6 热稳定性的测定

取AHAPs和游离AN溶液分别置于55 ℃的水浴中,于0、1、2、3、4、5 h时分别取出,按照1.3项下的方法测定游离AN及AHAPs中AN的活性。

1.7 酸碱稳定性的测定

取适量AHAPs溶液,分别用pH 5.5、6.0、6.5、7.0、7.5、8.0、8.5、9.0、9.5的Tris-HCl缓冲液稀释,37 ℃水浴放置40 min后,按照1.3项下方法分别测定游离AN及AHAPs中AN的活性。

1.8 抗胰蛋白酶水解能力的测定

取游离AN和AHAPs溶液,分别加入胰蛋白酶溶液,混匀后置于37 ℃水浴中,分别于0、10、20、30、40、50、60、70、80 min时取出,按照1.3项下的方法测定游离AN及AHAPs中AN的活性。

1.9 抗金属离子和有机化合物能力的测定

取游离AN和AHAPs溶液,分别加入配制好的山梨醇、吐温-80、氯化钾 (KCl)、氟化钠 (NaF)、PEG2000和氯化铵 (NH4Cl) 溶液,混匀,于25 ℃水浴中放置1 h后,按照1.3项下的方法测定游离AN及AHAPs中AN的活性。

1.10 血浆稳定性的测定

参照文献[15]方法配制体外模拟空白血浆样品后,取AHAPs和游离AN溶液,分别加入5倍体积的体外模拟空白血浆,混匀,于37 ℃下孵育0、1、2、4、8、12、24、48、72、96 h后,按照1.3项下的方法分别测定游离AN及AHAPs中AN的活性。

1.11 贮存稳定性的测定

取AHAPs和游离AN溶液,贮存于4 ℃,分别在0、1、2、5、10、15、20、25、28 d时取出,并按1.3项下的方法分别测定游离AN及AHAPs中AN的活性。

1.12 AN与纳米制剂膜的相互作用

取AN溶液、空白HA-g-PEG/α-CD纳米囊溶液、AN与空白HA-g-PEG/α-CD纳米囊的混合溶液 (混合后需室温孵育1 h) 各980 μL,分别与20 μL含异硫氰基荧光素 (FITC) 的Tris-HCl溶液混合,得样品溶液1、2和3,将3种样品溶液置于黑暗处孵育5 min。在发射波长为500~600 nm、激发波长为480 nm的条件下,于1 mL比色皿中检测荧光强度[14-15]

1.13 统计学处理

采用SPSS 20.0软件对游离AN和AHAPs中AN的活性及稳定性数据进行双向单侧t检验。检验水准 (α) 为0.05。

2 结果 2.1 AHAPs的特性

测得AHAPs的平均粒径为 (424.53±7.25) nm,zeta电位为 (-48.77±0.99) mV。经计算,AHAPs的平均包封率为 (64.40±1.82)%。

2.2 最适温度

图 1所示,游离AN的最适温度为60 ℃,AHAPs的最适温度为50 ℃。当温度在20~70 ℃范围内变化时,AHAPs中AN的活性均高于游离AN (60 ℃时除外)。

图 1 游离AN与AHAPs的最适温度 Fig 1 Optimum temperature of free AN and AHAPs AN: Asparaginase; AHAPs: Hyaluronic acid-graft-poly (ethylene glycol)/α-cyclodextrin hollow nanocapsules loaded with asparaginase. *P < 0.05 vs AN group. n=3, x±s

2.3 最适pH

图 2所示,AHAPs的最适pH为7.0。实验条件下 (pH 7.5和9.0除外) AHAPs中AN的活性均高于游离AN,且当pH为7.0和9.5时AHAPs中AN的活性优于游离AN (P < 0.05)。

图 2 游离AN与AHAPs的最适pH Fig 2 Optimum pH of free AN and AHAPs AN: Asparaginase; AHAPs: Hyaluronic acid-graft-poly (ethylene glycol)/α-cyclodextrin hollow nanocapsules loaded with asparaginase. *P < 0.05 vs AN group. n=3, x±s

2.4 热稳定性

图 3中可知,实验条件下游离AN失活较快,3 h已完全失活;而此时AHAPs中AN的活性仍在80%左右,5 h时AHAPs中AN的活性仍>50%。实验结果说明AHAPs大大提高了AN的热稳定性。

图 3 游离AN与AHAPs在55 ℃下的热稳定性 Fig 3 Thermal stabilities of free AN and AHAPs at 55 ℃ AN: Asparaginase; AHAPs: Hyaluronic acid-graft-poly (ethylene glycol)/α-cyclodextrin hollow nanocapsules loaded with asparaginase. *P < 0.05 vs AN group. n=3, x±s

2.5 酸碱稳定性

以pH 8.5时AN的活性为100%而计算的相对活性见图 4。不同酸碱环境下AHAPs中AN的活性都高于游离AN (除pH 7.0时AHAPs中AN与游离AN的活性接近外),且当pH为8.5和9.0时,两者的活性差异有统计学意义 (P < 0.05)。当pH值在7.5~9.5范围内变化时,AHAPs中的AN都能保持80%以上的高活性。结果可知,AHAPs较游离AN具有更好的耐溶液酸碱变化的能力。

图 4 游离AN与AHAPs的酸碱稳定性 Fig 4 pH stabilities of free AN and AHAPs AN: Asparaginase; AHAPs: Hyaluronic acid-graft-poly (ethylene glycol)/α-cyclodextrin hollow nanocapsules loaded with asparaginase. *P < 0.05 vs AN group. n=3, x±s

2.6 抗胰蛋白酶水解能力

图 5所示,在胰蛋白酶的作用下,游离AN被迅速酶解,其活性呈快速下降的趋势,30 min时,游离AN的活性仅存约30%,而此时AHAPs中AN的活性仍>60%;50 min时,游离AN已完全失活,而AHAPs中AN的活性仍>30%,并到80 min时才完全失活。结果显示AHAPs中的AN相比游离AN具有更好的抗酶解能力。

图 5 游离AN与AHAPs的抗胰蛋白酶水解能力 Fig 5 Trypsinase stabilities of free AN and AHAPs AN: Asparaginase; AHAPs: Hyaluronic acid-graft-poly (ethylene glycol)/α-cyclodextrin hollow nanocapsules loaded with asparaginase. *P < 0.05 vs AN group. n=3, x±s

2.7 抗部分金属离子及有机化合物能力

图 6所示,加入PEG2000后,AHAPs中AN及游离AN的活性与不加PEG2000的初始活性 (100%) 相比,均提高了近40%;其次是吐温-80,使游离AN与AHAPs中AN的活性均提高了10%左右。其中,山梨醇组、NaF组和NH4Cl组中游离AN及AHAPs中AN的活性差异均有统计学意义 (P < 0.05)。而KCl对游离AN及AHAPs中AN的活性无明显影响。结果表明,PEG2000、吐温-80、山梨醇、KCl、NaF和NH4Cl对游离AN及AHAPs的活性均有不同程度的影响。

图 6 部分金属离子及有机化合物对游离AN与AHAPs活性的影响 Fig 6 Effects of several metal ions and organic compounds on activities of free AN and AHAPs AN: Asparaginase; AHAPs: Hyaluronic acid-graft-poly (ethylene glycol)/α-cyclodextrin hollow nanocapsules loaded with asparaginase. *P < 0.05. n=3, x±s

2.8 血浆稳定性

图 7所示,当时间为4、12、24、48、72、96 h时,游离AN和AHAPs中AN的活性差异具有统计学意义 (P < 0.05)。其中,游离AN活性降低速度较快,4 h已损失了近一半的活性,而此时AHAPs中AN的活性仍高达90%;48 h时,游离AN已完全失活,而96 h时AHAPs中AN仍保持有20%以上的活性。实验结果说明AHAPs中的AN较游离AN具有更好的血浆稳定性。

图 7 游离AN与AHAPs的血浆稳定性 Fig 7 Plasma stabilities of free AN and AHAPs AN: Asparaginase; AHAPs: Hyaluronic acid-graft-poly (ethylene glycol)/α-cyclodextrin hollow nanocapsules loaded with asparaginase. *P < 0.05 vs AN group. n=3, x±s

2.9 贮存稳定性

图 8所示,5、10、15、20、25和28 d时两组的活性差异均有统计学意义 (P < 0.05)。其中,15 d时游离AN的活性已降至50%以下,而此时AHAPs中AN仍保持有近70%的活性;28 d时,游离AN的活性仅存约20%,而此时AHAPs中AN的活性约为游离AN的2倍。结果表明,AHAPs中的AN具有更好的贮存稳定性。

图 8 游离AN与AHAPs的贮存稳定性 Fig 8 Storage stabilities of free AN and AHAPs AN: Asparaginase; AHAPs: Hyaluronic acid-graft-poly (ethylene glycol)/α-cyclodextrin hollow nanocapsules loaded with asparaginase. *P < 0.05 vs AN group. n=3, x±s

2.10 AN与纳米制剂膜相互作用结果

AN与纳米制剂膜的相互作用实验结果见图 9。如图 9所示,3种样品 (从上到下依次为:AN、空白HA-g-PEG/α-CD纳米囊、AN+空白HA-g-PEG/α-CD纳米囊) 的荧光强度呈规律性降低,其中AN+空白HA-g-PEG/α-CD纳米囊混合溶液 (曲线3) 的荧光强度最小;空白HA-g-PEG/α-CD纳米囊溶液 (曲线2) 的荧光强度稍大;AN溶液 (曲线1) 的荧光强度最大。与AN相比,AN+空白HA-g-PEG/α-CD纳米囊混合溶液的荧光强度明显减弱,说明AN和FITC竞争性地与纳米制剂膜结合,也证明AN与纳米制剂膜之间产生了相互作用。比较AN+空白HA-g-PEG/α-CD纳米囊混合溶液和空白HA-g-PEG/α-CD纳米囊也能得出同样的结论。

图 9 荧光图谱 Fig 9 FITC fluorescence spectra Excitation wavelength: 480 nm; emission wavelength: 500-600 nm. 1: AN; 2: Blank HA-g-PEG/α-CD; 3: AN+Blank HA-g-PEG/α-CD. AN: Asparaginase; HA-g-PEG/α-CD: Hyaluronic acid-graft-poly (ethylene glycol)/α-cyclodextrin hollow nanocapsules

3 讨论

不同种类的CD衍生物,如α-CD和磺丁基-β-CD,在理化性质如相对分子质量、葡萄糖单元数、分子结构、增溶作用、毒性作用、水溶性等方面存在着明显差异,且以α-CD和磺丁基-β-CD为主要辅料加上其他辅料后制得的新型药物纳米递送系统的稳定性、溶解性、生物学特性、药代动力学、毒性作用等都可能存在不同。实验发现,本研究中以α-CD为主要辅料制得的新型药物纳米递送系统与谢江川等[16]以磺丁基-β-CD为主要辅料制得的新型药物纳米递送系统在平均zeta电位、平均包封率、最适pH等方面存在较大差异。两种递送系统在药代动力学、毒性作用等方面是否存在差异还需进一步研究。

药物制剂的稳定性是其质量控制的关键因素,良好的稳定性也是其临床应用的必要条件[17]。本实验测定了AHAPs的最适温度、最适pH、粒径、zeta电位和包封率,并分别对AHAPs和游离AN的热稳定性、酸碱稳定性、抗胰蛋白酶水解能力、抗部分金属离子及有机化合物能力、血浆稳定性、贮存稳定性及AN与纳米制剂膜的相互作用进行了考察。实验结果显示,AHAPs中的AN较游离AN具有更优的活性和体外稳定性。

荧光实验结果发现AN与纳米制剂膜之间产生了相互作用,该相互作用可能会导致酶的构象发生变化,而这些改变可能正是AHAPs中AN生物学特性明显提高的原因[18-19]。若要进一步验证AN的构象是否发生了变化以及深入探讨该变化对AN酶学性质的影响,还需更深入的研究。

理论上AHAPs不仅具有纳米囊所具有的提高封装药物稳定性、延长被封装药物的生物半衰期、提高封装药物的生物利用度以及降低毒副作用等优势,而且通过HA的修饰还具有缓释和肿瘤靶向性的特点,本实验结果已证明相比游离AN,AHAPs中的AN具有更好的酶学活性和更优的体外稳定性,为剂量的减少及临床上的广泛应用奠定了一定的基础,同时本研究也为AHAPs在体内的进一步研究奠定了良好的基础。

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