2017, Vol. 38
2. 中国科学院深圳先进技术研究院, 深圳 518055
2. Shenzhen Institutes of Advanced Technology, Chinese Academy of Sciences, Shenzhen 518055, Guangdong, China
高强度聚焦超声(high-intensity focused ultrasound, HIFU)在临床上广泛用于治疗肿瘤[1-2]。近年有关提高HIFU治疗效果的研究多集中在增强HIFU对肿瘤的定位成像和增强HIFU对肿瘤的杀伤力两个方面。当前临床上定位成像主要通过超声(ultrasound)或磁共振成像(magnetic resonance imaging，MRI)实现[3-6]，评估疗效主要通过超声造影(contrast-enhanced ultrasound, CEUS)或MRI造影实现[7-9]，增强疗效主要通过静脉注射超声造影剂或脂质体载纳米材料实现[10-12]。MRI对病灶整体及其与周边组织关系的显示较超声更有优势。然而，目前临床使用的MRI造影剂一般通过静脉注射，在肿瘤内的存留时间较短，不利于HIFU定位治疗；此外，定位、增强疗效及评估疗效均为独立程序，步骤繁琐、操作复杂。因此，研制一种集提高可视化精度定位、增强疗效及评估疗效于一体的纳米材料造影剂，对HIFU的临床意义重大。
介孔二氧化硅纳米囊脂质体(mesoporous silica nanocapsules loaded liposomes，MSN-LIPO)是一种纳米颗粒，可以通过被动靶向效应在肿瘤部位持续蓄积达24 h，便于完成HIFU治疗的整个过程，其所包封的乙酸异戊酯在HIFU作用下由液态转为气态，从而对HIFU起到显著的增强疗效作用。本科室前期构建了一种同时包封乙酸异戊酯和Fe3O4的MSN-LIPO，揭示了其基本理化特征、生物相容性及被人恶性胶质母细胞瘤细胞株U-87 MG的摄取情况，证实了其对HIFU灭活肿瘤细胞的增强作用[13]。但MSN-LIPO的MRI弛豫特征尚待验证，本研究旨在探索MSN-LIPO增强MRI显影的特点。
1 材料和方法 1.1 仪器与试剂核磁共振成像系统(Magnetom Trio，A Tim System 3T MRI System，德国西门子公司)；自制MSN-LIPO[13]；PBS(美国Hyclone公司)；琼脂粉(天津市大茂化学试剂厂)；人恶性胶质母细胞瘤细胞株U-87 MG细胞(ATCC® HTB-14TM，美国ATCC细胞库)。
1.2 体外MRI的弛豫特性检测将含铁浓度分别为0.16、0.08、0.04、0.02、0.01、0.005、0.002 5、0.001 25 mmol/L的MSN-LIPO溶液和纯水分别装入到1.5 mL密封离心管中，按照浓度从高到低的顺序依次放入含凝固琼脂的扫描盒孔中，进行MRI扫描。扫描参数：4通道小鼠线圈，自旋回波(spin echo，SE)序列，重复时间(repetition time，TR) 4 000 ms，回波时间(echo time，TE) 17.4 ms，翻转角(flip angle，Flip) 180°，层厚5 mm，视野(field of vision，FOV) 90 mm×180 mm。检测信号强度(signal intensity，SI)及T2值，以铁浓度为横坐标、1/T2为纵坐标绘制弛豫率曲线。
1.3 荷瘤裸鼠模型的构建SPF级BALB/c裸鼠6只，雌性，6~8周龄，体质量18~22 g，购于广东省医学实验动物中心[动物生产许可证：SCXK(粤)2013-0002，动物使用许可证：SYXK(粤)2012-0119]。饲料、饮水、垫料均经高压蒸汽灭菌处理(121 ℃、20 min)，自由饮食。采用含10%胎牛血清、1%青霉素/链霉素的DMEM高糖培养液、于37 ℃、5% CO2的细胞培养箱中培养U-87 MG细胞。取对数生长期的U-87 MG细胞，胰酶消化1~2 min，1 000 r/min(r=15 cm)离心4 min，弃上清液后加入PBS重悬，按照1×107/只裸鼠的细胞密度接种于裸鼠侧腹部，隔天观察肿瘤生长情况。
1.4 荷瘤裸鼠MRI扫描 1.4.1 瘤内注射取3只荷瘤裸鼠麻醉固定，沿着肿瘤0、3、6、9点方向进针，注射200 μL含铁浓度为0.16 mmol/L的MSN-LIPO溶液，轻柔按压。瘤内注射前、注射后5 min内行MRI扫描。扫描参数：4通道小鼠线圈，SE序列，TR 3 700 ms，TE 71 ms，Flip 120°，层厚1.2 mm，FOV 48 mm×80 mm。
1.4.2 静脉注射另取3只荷瘤裸鼠麻醉固定，经尾静脉注射200 μL含铁浓度为0.16 mmol/L的MSN-LIPO溶液。静脉注射前、注射后30 min行MRI扫描。扫描参数同1.4.1项。
1.5 统计学处理采用SPSS 21.0软件进行数据分析。呈正态分布的计量资料以x±s表示，两组间比较采用独立样本t检验。检验水准(α)为0.05。
2 结果 2.1 MSN-LIPO体外MRI T2加权成像的弛豫特性不同含铁浓度MSN-LIPO的MRI扫描结果(图 1A)和定量分析结果(图 1B)显示，随着MSN-LIPO含铁浓度的逐渐增加，MRI T2信号强度呈逐渐降低的趋势。弛豫率曲线(图 1C)显示，1/T2在一定的MSN-LIPO含铁浓度范围内与铁浓度的呈线性关系，测得弛豫率(r2)为413.7 mmol-1·s-1。
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图 1 MSN-LIPO体外MRI T2加权成像弛豫特性 A: MRI T2加权成像(a~h的含铁浓度分别为0.16、0.08、0.04、0.02、0.01、0.005、0.002 5、0.001 25 mmol/L，i为纯水)；B：MSN-LIPO体外MRI模型扫描定量图(n=3, x±s)；C：不同含铁浓度MSN-LIPO的弛豫效能拟合曲线. MRI:磁共振成像；MSN-LIPO:介孔二氧化硅纳米囊脂质体 |
2.2 瘤内注射MSN-LIPO负性增强BALB/c荷瘤裸鼠皮下瘤MRI T2信号
注射前BALB/c荷瘤裸鼠肿瘤部位呈现T2高信号，肿瘤局部注射MSN-LIPO 5 min后，注射中心区域的信号强度降低，与周围组织呈现明显对比(图 2A、2B)。注射前肿瘤信号强度平均值为211.44±5.34，高于注射后5 min的15.34±1.24，差异有统计学意义(t=36.38，P < 0.05；图 2C)。
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图 2 瘤内注射MSN-LIPO增强恶性胶质母细胞瘤MRI T2加权像及信号值 A：注射前，肿瘤呈高信号(箭头所示)；B：注射后5 min肿瘤信号降低(箭头所示)；C：注射MSN-LIPO前后肿瘤的MRI信号强度值. MRI:磁共振成像；MSN-LIPO:介孔二氧化硅纳米囊脂质体. *P < 0.05与注射前比较.n=3, x±s |
2.3 静脉注射MSN-LIPO负性增强BALB/c荷瘤裸鼠皮下瘤MRI T2信号
注射前BALB/c荷瘤裸鼠肿瘤部位呈现T2高信号，静脉注射MSN-LIPO 30 min后整个肿瘤区域的信号均降低，与注射前呈现明显对比(图 3A、3B)。注射前肿瘤信号强度平均值为235.99±5.17，高于注射后30 min的179.00±4.35，差异有统计学意义(t=14.34，P < 0.05；图 3C)。
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图 3 静脉注射MSN-LIPO增强恶性胶质母细胞瘤瘤的MRI T2加权像及信号值 A：注射前，肿瘤呈高信号(箭头所示)；B：注射后30 min肿瘤信号降低(箭头所示)；C：注射MSN-LIPO前后肿瘤的MRI信号强度值. MRI:磁共振成像；MSN-LIPO:介孔二氧化硅纳米囊脂质体. *P < 0.05与注射前比较.n=3, x±s |
3 讨论
本研究所构建的MSN-LIPO是以乙酸异戊酯为HIFU增敏剂内核、Fe3O4为MRI造影剂的脂质体包封的纳米颗粒。乙酸异戊酯熔点为－78 ℃，沸点为143 ℃，常温为液态，在HIFU的作用下持续发生液-气相转换，形成微气泡，增强HIFU消融效应，从而增强HIFU对肿瘤的杀伤力。目前HIFU治疗的引导技术为超声或MRI。虽然MRI较超声检查时间长、费用高，但图像整体性好，能更清晰地分辨肿瘤与周围正常组织的界限，更精确地引导HIFU对病灶进行热消融，准确评估疗效。含Fe3O4的MRI造影剂具有超顺磁性、性质稳定、生物相容性好、强度高、无毒副作用等特点，被广泛应用于临床[14-15]。本科室前期研究证实MSN-LIPO具有对HIFU的增效作用[13]，但在MRI T2加权成像中的效果尚不确定。本研究旨在验证MSN-LIPO的MRI T2加权成像增强效果。
本研究体外实验结果显示，MSN-LIPO具有良好的MRI T2加权成像增强功能。弛豫时间的长短决定着信号的强弱。MRI T2信号随着MSN-LIPO含铁浓度的降低呈增加趋势，1/T2与铁浓度呈现线性关系。根据MSN-LIPO的弛豫率曲线，测得弛豫率为413.7 mmol-1·s-1。可见MSN-LIPO因含Fe3O4而具有MRI造影剂功能，对临床上HIFU的精确引导具有潜在的应用价值。
本研究瘤内注射结果表明，MRI T2加权图像可清晰显示肿瘤内部MSN-LIPO的分布情况。对于浅表部位的肿瘤，局部直接注射可使瘤内药物保持高浓度状态，从而提高疗效。但瘤内注射也存在分布不均的现象，为了解浅表肿瘤内MSN-LIPO的分布情况，MRI T2加权成像非常必要。本研究中在瘤内局部注射MSN-LIPO后，肿瘤各部位T2信号强度相差悬殊，中心区域信号值极低，周围则表现为强信号，两者在T2加权图像上形成鲜明对比。这可能是由于肿瘤中心部位有较高浓度的MSN-LIPO而在T2加权图像上呈低信号，而周围部位MSN-LIPO扩散较少或无扩散而呈强信号，这不仅为HIFU提供了良好的消融定位，还可指导医师及时补充注射、补充消融。
本研究静脉注射结果表明，MSN-LIPO可增加MRI T2加权图像的肿瘤显影效果。对于深层及全身转移的肿瘤，不便于穿刺直接注射，经静脉注射药物是常用方法。目前临床使用的顺磁性静脉内造影剂钆喷酸葡胺(Gd-DTPA)或超顺磁性氧化铁(SPIO)不具备被动靶向功能，在肿瘤内停留时间短。而HIFU定位治疗用时较长，故Gd-DTPA与SPIO均不能用于引导HIFU消融治疗。MSN-LIPO是一种纳米颗粒，可通过被动靶向作用在肿瘤部位较长时间聚集[13]，便于引导HIFU完成整个消融过程。尾静脉注射MSN-LIPO后，肿瘤部位的MRI T2信号值也会发生改变，显示在图像上的差异可被肉眼分辨，因此，对于需要静脉注射的肿瘤疾病，MSN-LIPO可以发挥良好的MRI T2加权像造影剂功能。然而，静脉注射MSN-LIPO引起的肿瘤组织T2信号降低水平明显不如瘤内注射，这可能是因为MSN-LIPO经静脉注射进入体内，除了被稀释外，肝、脾等脏器的主动摄取也会导致其在肿瘤部位的蓄积量减少。
综上所述，本研究从体外、瘤内注射和静脉注射3个层面验证了MSN-LIPO具有良好的MRI T2加权成像的造影功能，表明MSN-LIPO可以作为HIFU消融的造影剂。
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