慢性鼻-鼻窦炎伴鼻息肉(chronic rhinosinusitis with nasal polyps，CRSwNP)为常见慢性鼻-鼻窦炎，是引起患者嗅觉功能减退的主要原因^[1]。研究发现，CRSwNP患者病变组织常伴有嗜酸粒细胞(eosinophil，EOS)浸润，且EOS浸润在鼻息肉的形成及进展中有重要作用^[2]。然而目前CRSwNP患者发生EOS浸润的原因尚未明确。Ba等^[3]研究发现，虽然人外周血中EOS占白细胞比例不及10%，但其对变应原、致炎因子引起的炎性反应有重要的介导作用。EOS为白细胞介素5(interleukin-5，IL-5)的关键效应细胞，IL-5在EOS浸润过程中有促使其趋化、活化和抑制凋亡作用^[4]。也有研究发现，免疫球蛋白E(IgE)介导的Ⅰ型变态反应是引起细胞活化、EOS浸润的主要原因，而细胞因子IL-5在IgE生成过程中发挥调节作用^[5-6]。目前对于CRSwNP患者鼻黏膜EOS趋化因子(Eotaxin-2)在息肉形成过程中的机制及其与IL-5的关系尚未见报道。因此，本研究对新疆医科大学第一附属医院收治的48例CRSwNP患者展开分析，以探讨CRSwNP患者鼻息肉黏膜Eotaxin-2及IL-5表达及其相关性。

1 资料和方法 1.1 一般资料

选择2013年1月至2016年3月新疆医科大学第一附属医院收治的48例CRSwNP患者作为研究组，纳入标准：符合慢性鼻-鼻窦炎诊断和治疗指南中的CRSwNP诊断标准^[5]；入组前1周未使用抗组胺药及肾上腺皮质激素；择期接受手术治疗，术中留取鼻息肉黏膜组织；无过敏性鼻炎、变应性哮喘等疾病史。选取同期收治的30例慢性鼻-鼻窦炎不伴鼻息肉(chronic rhinosinusitis without nasal polyps，CRSsNP)患者作为对照1组，均满足慢性鼻-鼻窦炎诊断和治疗指南中的CRSsNP诊断标准^[5]，经内镜检查无鼻息肉，入组4周内未使用抗组胺药、肾上腺皮质激素及免疫调节药物；30例单纯鼻中隔偏曲患者作为对照2组，纳入患者均无哮喘、变应性鼻炎、支气管扩张、阿司匹林特异反应性、慢性阻塞性肺疾病及自身免疫性疾病，入组4周内无急性呼吸道感染及类固醇药物使用史，均行鼻中隔偏曲矫正术，术中留取下鼻甲黏膜。所有纳入本研究者均排除严重心肝肾肺疾病、全身性疾病、严重精神疾病、急性上呼吸道感染、合并恶性肿瘤、真菌性鼻窦炎、系统性血管炎、凝血功能障碍。

1.2 标本及取材

研究组：鼻内镜下切除息肉组织，留取鼻息肉黏膜组织标本。对照1、2组：鼻内镜下切除下鼻甲组织，留取下鼻甲部分黏膜组织。术中留取组织立即切成小块(3~5 mm³)浸入非液氮型样本RNA保存液，－4 ℃低温保存，24 h后去除非液氮型样本RNA保存液，－70 ℃冰箱保存备用。

1.3 试剂

兔抗人Eotaxin-2多克隆抗体(ant-127，北京博奥派克生物科技有限公司)，兔抗人IL-5多克隆抗体(200-05-2 μg，上海酶研生物科技有限公司)。二步法抗兔/小鼠通用型免疫组织化学SP试剂盒(福州迈新生物技术开发有限公司)，IL-5 ELISA试剂盒(深圳市晶美生物工程有限公司)，IgE ELISA试剂盒(上海岚派生物科技有限公司)，DAB显色试剂盒(武汉博士德生物工程有限公司)。

1.4 观察指标 1.4.1 Eotaxin-2水平及EOS浸润情况的检测

采用免疫组织化学H-E染色测定Eotaxin-2水平。石蜡包埋组织连续切片，厚度5 μm，切片脱蜡水化，PBS冲洗2~3次，每次5 min。滴加过氧化酶阻断液室温孵育10 min，PBS冲洗3次，每次3 min，弃PBS。切片滴加50 μL DAB底物，室温孵育10 min，弃上清。滴加一抗，4 ℃过夜，PBS冲洗3次，每次3~5 min，弃PBS；滴加DAB显色剂，室温孵育10 min，PBS冲洗3次，每次3 min，弃PBS。滴加50 μL链霉素抗生物素-过氧化酶溶液，室温孵育10 min，PBS冲洗3次，每次3 min，弃PBS。滴加100 μL DAB溶液，镜下观察，自来水冲洗，苏木精复染，返蓝，梯度乙醇脱水，二甲苯透明，中性树胶封片。于光学显微镜下观察Eotaxin-2阳性表达情况，阳性细胞呈棕黄色，自上皮、腺体周围各取10个高倍视野，采用BI-2000图像分析系统对染色结果进行分析，计算阳性细胞数目。H-E染色检测EOS浸润情况，光学显微镜下观察EOS，每张切片随机取5个高倍视野，计算100个炎性细胞内EOS的数目，取平均值表示其浸润程度，即每个高倍视野中EOS数目。

1.4.2 IL-5测定

组织匀浆制备，取鼻黏膜组织剪成小块，1 g加1 mL生理盐水，电动玻璃匀浆器研磨15 min，高速冷冻离心机4 ℃ 1 000~1 350×g离心10 min，取上清。采用双缩脲比色法测定组织匀浆总蛋白质，应用UV-160A紫外分光光度计进行测定，采用ELISA测定IL-5水平，具体测定方法参照IL-5 ELISA试剂盒说明书。组织匀浆IL-5水平(ng/g)=样本IL-5浓度(ng/L)/样本总蛋白浓度(g/L)。

1.4.3 血清总IgE测定

入院后采集3组外周静脉血各3 mL，采用ELISA测定血清总IgE水平，具体测定方法参照IgE ELISA试剂盒说明书。

1.4.4 外周血EOS计数测定

采集静脉血3 mL，采用深圳迈瑞生物医疗电子股份有限公司BC-5500型全自动血细胞分析仪测定患者外周血EOS计数。

1.5 统计学处理

数据均录入SPSS 19.0软件进行分析。呈正态分布的计量资料以x±s表示，组间比较采用t检验。计数资料以率表示，组间比较采用χ²检验。EOS浸润程度、IgE、Eotaxin-2及IL-5相关性分析采用Pearson相关性分析。检验水准(α)为0.05。

2 结果 2.1 3组患者基本情况

研究组纳入CRSwNP患者48例，其中男29例，女19例；年龄21~74岁，平均(46.1±4.7)岁；病程2~11个月，平均(5.1±1.1)个月；鼻息肉分型：Ⅰ型7例、Ⅱ型35例、Ⅲ型6例。对照1组纳入CRSsNP患者30例，其中男19例，女11例；年龄21~76岁，平均(47.1±5.1)岁。对照2组纳入单纯鼻中隔偏曲患者30例，其中男20例，女10例；年龄20~75岁，平均(45.9±4.5)岁。

2.2 3组患者EOS浸润情况的比较

研究组(图 1A)患者鼻息肉黏膜组织均可见明显组织水肿，细胞成分少，组织表面见假复层纤毛柱状上皮及鳞状上皮组织转化，上皮下息肉基质严重水肿；大量EOS浸润，聚集成团，H-E染色后胞质呈棕褐色，主要分布于黏膜上皮下及小血管周围，胞质红染，可见2~3个分叶核。对照1组(图 1B)患者鼻黏膜组织轻微水肿，上下层疏松结缔组织内见散在成纤维细胞和少量炎性细胞，多为浆细胞、中性粒细胞、淋巴细胞，见少量EOS浸润。对照2组(图 1C)患者鼻黏膜组织微血管见少量淋巴细胞，基本无EOS浸润。

2.3 3组患者EOS计数及IL-5、Eotaxin-2、IgE水平的比较

研究组患者鼻黏膜组织EOS计数及外周血EOS计数、IgE水平均高于对照1、2组，其鼻黏膜组织IL-5浓度高于对照1、2组，Eotaxin-2阳性表达率也高于对照1、2组，差异均有统计学意义(P均 < 0.05)；对照1组鼻黏膜组织EOS计数、IL-5水平及外周血EOS计数、IgE水平高于对照2组，差异均有统计学意义(P均 < 0.05)，见表 1。研究组(图 2A)患者Eotaxin-2阳性细胞主要表达于腺体、血管内皮细胞、黏膜固有层浸润的炎性细胞中，阳性细胞数目多，呈棕黄色，颜色较深；对照1组(图 2B)上皮组织中Eotaxin-2阳性细胞数少于研究组，间质可见弥散Eotaxin-2表达；对照2组(图 2C)阳性染色浅，分布于浸润炎性细胞或黏膜上皮。研究组(图 2D)鼻黏膜组织见较多IL-5阳性染色细胞，为棕黄色或棕色，阳性细胞分布较密，呈丛集性分布，集中于血管、上皮、腺体周围，间质可见散在阳性细胞；对照1组(图 2E)鼻黏膜组织IL-5阳性细胞较研究组略少，分布稀松；对照2组(图 2F)阳性染色细胞少，散在分布于间质及上皮。

2.4 CRSwNP患者鼻黏膜组织EOS浸润、IgE水平和外周血EOS计数与IL-5的相关性

CRSwNP患者鼻黏膜组织EOS浸润数目(r=0.844，P=0.000)、外周血EOS计数(r=0.721，P=0.001)、鼻黏膜组织Eotaxin-2阳性表达(r=0.668，P=0.002)、外周血IgE水平(r=0.432，P=0.012)与鼻黏膜组织IL-5表达均呈正相关。

3 讨论

研究报道，约有80%的CRSwNP患者病变组织伴EOS浸润，且呈水肿型改变，部分伴中性粒细胞浸润或黏液腺体增生^[6]。Fundová等^[7]发现，EOS颗粒富含毒性产物，包括趋化因子、白三烯、血管活性物质、嗜酸细胞阳离子蛋白等，可导致上皮溶解、纤毛停滞、气道低反应性。EOS活化后嗜酸细胞阳离子蛋白表达上调，炎性浸润程度增加。本研究通过对CRSwNP患者鼻息肉黏膜组织EOS浸润及外周血EOS计数情况进行检测发现，CRSwNP患者鼻黏膜组织EOS浸润程度和外周血EOS计数均高于鼻黏膜组织正常者及CRSsNP患者，表明CRSwNP患者鼻黏膜组织炎性浸润较为严重。

Eotaxin-2为EOS的高选择性趋化因子，可特异性趋化EOS，促进EOS浸润，加速气道炎症进展^[8]。本研究发现，CRSwNP患者Eotaxin-2主要表达于鼻息肉血管内皮细胞、炎性细胞质内，而在腺上皮细胞质、黏膜上皮细胞质中表达相对较少，且其Eotaxin-2阳性率高于CRSsNP与鼻黏膜组织正常者。分析Eotaxin-2在CRSwNP患者鼻黏膜组织中高表达的原因，可能与鼻息肉黏膜组织炎性反应加重导致EOS趋化于炎性部位，促进Eotaxin-2、IL-5等炎性介质释放有关，导致腺体分泌增加，从而引起组织水肿、血管扩张，促进鼻息肉形成。

本研究发现，CRSwNP患者鼻息肉黏膜组织IL-5含量高于CRSsNP患者与鼻黏膜组织正常者，分析可能原因为：IL-5可特异性作用于EOS，促进其活化、趋化，抑制其凋亡，同时促进毒性物质释放，延长EOS存活时间，加重上皮组织损伤，加速鼻息肉进展^[4]。IgE是介导变态性反应的关键因子，当机体遭受外源性变应原刺激时，IgE表达水平上升，从而激活EOS、肥大细胞因子，加重炎性反应。此外，IgE可介导迟发相反应，其变应原不仅可激活肥大细胞，同时可延迟激活中性粒细胞、单核-巨噬细胞、T淋巴细胞等，促进大量炎性介质、细胞因子释放，引起持续性炎性反应。本研究发现，CRSwNP患者血清总IgE水平高于CRSsNP患者与鼻黏膜组织正常者，表明IgE介导的变态反应在鼻息肉发病过程中有重要作用，考虑CRSwNP患者发病过程中可能存在IgE介导的以EOS浸润为主的迟发相变态反应炎症。本研究发现，CRSwNP患者鼻黏膜组织EOS细胞数、外周血EOS计数、Eotaxin-2水平均与IL-5表达水平呈正相关，表明CRSwNP患者鼻息肉的形成及进展可能与EOS活化释放IL-5炎性介质、IL-5抑制EOS凋亡有关。

目前尚无研究对IL-5与IgE表达的关系进行报道，本研究发现，CRSwNP患者血清IgE水平与IL-5表达呈正相关，提示CRSwNP患者鼻息肉的形成及进展可能与IL-5在调节IgE生成过程中具有一定作用有关。但本研究样本量小，且尚未对CRSwNP患者过敏原进行筛查，尚未分析受试者过敏状态，后续将扩充样本量、进行过敏原穿刺点筛查，以进一步明确慢性鼻-鼻窦炎患者鼻息肉形成的病理机制。