2017, Vol. 38
, YIN Hui-rong, YAN Hong-li, SUN Fang-zhen, SHI Min-feng, FENG Shu-gai, SONG Di, XU Ya-jun, HONG Yi, CAI Yan-ping, ZHU Min
, ZHANG Hui-qin
体外受精-胚胎移植(in vitro fertilization-embryo transfer，IVF-ET)是治疗不孕不育的主要方法，但在临床应用中，5%~10%患者存在受精失败风险[1]，其高危因素主要包括不孕5年以上、男方精液临界水平、男方正常精子形态少于4%、3次以上宫腔内人工授精(intra-uterine insemination，IUI)未孕。卵子受精失败不仅给患者带来经济损失，也带来心理负担。传统补救方法是取卵第2天针对未受精的卵子行卵胞浆内单精子显微注射(intracytoplasmic sperm injection，ICSI)，但因错过卵子受精时间窗，其卵子受精率、胚胎质量以及移植后妊娠率较低[2-4]。目前临床上预防体外受精(in vitro fertilization, IVF)失败的常规方法主要是Aboulghar等[5]提出的部分卵胞浆内单精子显微注射(half-intracytoplasmic sperm injection，half-ICSI)以及Chen和Kattera[6]提出的短时IVF联合早期补救ICSI。
为预防存在精卵结合障碍高危因素的患者在初次助孕周期发生IVF受精率低下，第二军医大学长海医院生殖医学中心通常采用half-ICSI或短时IVF联合早期补救ICSI。本研究旨在通过回顾性分析以上两种授精方式的受精情况、胚胎发育以及接受新鲜胚胎移植后妊娠结局，探讨两种授精方式的利弊以指导临床。
1 材料和方法 1.1 研究对象收集2015年5月1日至2016年12月31日在第二军医大学长海医院初次行IVF助孕、存在精卵结合障碍高危因素的患者，所有患者为预防受精率低下自主选择短时IVF或half-ICSI助孕，短时IVF助孕IVF受精率≤30%时接受早期补救ICSI助孕。纳入标准：(1)患者存在至少一项精卵结合障碍高危因素(不孕5年以上、男方精液临界水平、男方正常精子形态少于4%、3次以上IUI未孕)；(2)此次周期为初次IVF助孕周期；(3)授精方式是half-ICSI或短时IVF(或短时IVF联合早期补救ICSI)。排除标准：(1)未获卵或获卵数 < 4枚；(2)取卵第2天补救ICSI授精；(3)卵子成熟障碍。所有患者在医师充分告知后签署知情同意书。本研究通过第二军医大学长海医院生殖医学中心医学伦理委员会审批通过。
1.2 分组根据授精方式分为2组：短时IVF助孕组(A组，患者接受短时IVF或短时IVF联合早期补救ICSI，n=192)、half-ICSI助孕组(B组，患者接受half-ICSI，n=85)。筛选A、B两组中IVF受精率低下周期(IVF受精率≤30%)的患者并分别设为A1组(n=20)、B1组(n=9)。
1.3 促排卵和取卵根据患者年龄、卵巢储备功能以及患者意愿采用个体化促排卵方案，包括长方案、短方案、微刺激方案、拮抗剂方案、改良超长方案、超长方案。促排卵药物有注射用重组人促卵泡激素(果纳芬，批号S20130055，Merck Serono SA Aubonne Branch，75 IU/支)和(或)注射用尿促性素(乐宝得，批号170604，丽珠制药厂，75 IU/支)和(或)注射用尿促卵泡素(丽申宝，国药准字H20052130，丽珠制药厂，75 IU/支)。促排卵同时监测卵泡直径，至主卵泡直径1个≥18 mm或2个≥17 mm或3个≥16 mm时，结合卵泡发育数目以及血清激素水平适时皮下注射重组人绒促性素(艾泽，批号S20100016，Merck Serono S.P.A.，250 μg/支) 250 μg或200 μg，35~37 h内经阴道B超引导下取卵。
1.4 收集精液取卵当天男方取精，取精前禁欲3~7 d，手淫法获取精液。经密度梯度离心法处理精液，联合上游法优选精子，然后调整精子密度至1×106/mL。
1.5 授精及培养 1.5.1 短时IVF联合早期补救ICSI授精取卵后4~6 h将卵-冠-丘复合体与精子混合，授精后5 h去除颗粒细胞，并置于新培养液微滴中观察第二极体的出现情况。若出现第二极体的卵母细胞占比(2Pb率)≤30%，记为受精率低下周期，并对该患者同一批卵子中明确一个极体的M Ⅱ卵母细胞于授精后6~8 h行早期补救ICSI。2Pb率＞30%者不行ICSI授精。
1.5.2 half-ICSI授精将每例患者的卵母细胞随机分为2份，分别采用常规IVF和ICSI方法授精。IVF授精：取卵后4~6 h将卵-冠-丘复合体与精子混合，培养过夜后去除颗粒细胞，观察卵子受精情况。ICSI授精：取卵后4~6 h直接行ICSI授精。IVF受精率≤30%计为受精率低下周期。
1.5.3 体外培养以及胚胎发育评级授精后18~20 h观察原核，出现双原核(2PN)记为正常受精卵，继续体外培养胚胎至取卵后第3天对胚胎进行质量评估：根据胚胎卵裂球数目、形态、大小是否均匀及有无碎片将胚胎分为Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ级，其中6细胞及以上的Ⅰ、Ⅱ级胚胎为优质胚胎。根据患者意愿决定是否行囊胚培养，若行囊胚培养则继续体外培养至第5~6天，观察形成囊胚者并保留可用的囊胚冷冻或移植。
1.5.4 胚胎移植取卵后第3天或第5天行胚胎移植。若存在移植日内膜偏薄、重度卵巢过度刺激倾向、输卵管严重积水、宫腔积液、无可移植胚胎等情况，知情告知后放弃新鲜胚胎移植，可用胚胎玻璃化冷冻。若无以上情况且要求新鲜胚胎移植者，选择1~2个相对优质胚胎(优先选择IVF受精胚胎)进行移植。可用胚胎较多时，经患者知情同意后取部分胚胎行囊胚培养。
1.6 胚胎移植后黄体支持及妊娠结局判断胚胎移植后予肌内注射黄体酮60 mg/d或阴道内塞黄体酮阴道缓释凝胶(雪诺同，批号C16143-C，Fleet Laboratories Limited，90 mg/支) 90 mg/d，同时联合口服黄体酮软胶囊100 mg/次、2次/d支持黄体功能。移植后14 d检测血清人绒毛膜促性腺激素(human chorionic gonadotropin，hCG)水平，阳性为妊娠；移植后35 d超声观察到宫内妊娠囊为临床妊娠。
1.7 观察指标计算方法ICSI率=ICSI助孕卵子总数/成熟卵子总数；正常受精率=正常受精卵数(2PN)/成熟卵子数；可用胚胎率=可用胚胎数/正常受精卵数；优质胚胎率=优质胚胎数/正常受精卵数；囊胚形成率=囊胚数/养囊胚胎数；临床妊娠率=临床妊娠周期数/移植周期数；流产率=流产周期数/临床妊娠周期数；胚胎着床率=着床胚胎数/移植胚胎数。
1.8 统计学处理采用SPSS 18.0软件进行统计学分析。计数资料采用百分数表示，组间比较采用χ2检验或Fisher确切概率法；符合正态分布的计量资料用x±s表示，采用t检验比较组间差异。检验水准(α)为0.05。
2 结果 2.1 一般情况比较纳入A组和B组患者分别为192和85例。由表 1可见，A、B两组不孕年限、原发不孕率、女方年龄、女方体质量指数(body mass index，BMI)以及基础卵泡刺激素(basic follicle stimulating hormone，bFSH)、染色体多态率、男方精子存活率、A+B级精子百分比、正常形态精子百分比、不孕因素构成比和促排卵方案构成比差异均无统计学意义。
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表 1 两组一般情况比较 Tab 1 Comparison of general characteristics between two groups |
2.2 两组获卵后受精、胚胎发育情况的比较
如表 2所示，A、B两组IVF受精率低下周期率、所获卵子成熟度差异无统计学意义(P均>0.05)，但A组卵子ICSI率、过度ICSI率低于B组(P均 < 0.01)。虽然A组正常受精率低于B组(P < 0.01), 但A、B两组可用胚胎率、优质胚胎率、囊胚形成率差异均无统计学意义(P均>0.05)。
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表 2 两组获卵后受精、胚胎发育情况的比较 Tab 2 Comparison of fertilization and embryo development outcomes between two groups |
2.3 两组接受新鲜胚胎移植和妊娠结局情况
两组中接受新鲜胚胎移植助孕患者共196例，其中A组145例，B组51例。A、B两组新鲜移植周期的平均移植胚胎数目、移植日内膜厚度、囊胚移植率、临床妊娠率、胚胎着床率、流产率差异均无统计学意义(P均>0.05)。见表 3。
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表 3 两组接受新鲜胚胎移植和妊娠结局情况 Tab 3 Comparison of fresh-embyo-transfer and pregnancy outcomes between two groups |
2.4 两组患者中IVF受精率低下周期受精情况的比较
192例短时IVF受精周期中因IVF受精率低下(≤30%)行早期补救ICSI者20例(A1组)，85例half-ICSI受精周期中IVF受精率低下者9例(B1组)。分析A1、B1两组的卵子受精情况，结果见表 4，A1、B1组所获卵子成熟度差异无统计学意义(P>0.05)，但A1组ICSI率和正常受精率均高于B1组(P均 < 0.01)。
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表 4 两组中IVF受精率低下周期受精情况的比较 Tab 4 Comparison of fertilization outcomes in low fertilization cycles between two groups |
3 讨论 3.1 受精低下的预测及补救方案
精卵结合是一个复杂过程，包括卵母细胞成熟、精子成熟、精子获能、精子透明带结合、配子融合等环节，任何一个环节发生障碍均会导致受精失败。据报道，10%~25%的常规IVF病例会发生卵子完全不受精或受精率低下[7]；接受IVF治疗的不明原因不孕患者中约17.6%发生全部卵母细胞受精失败[8]。不孕5年以上、男方精液临界水平、男方正常精子形态少于4%及3次以上IUI未孕均是精卵结合障碍的高危因素[9-10]。针对存在至少1项上述高危因素的夫妇，在其首次接受IVF-ET助孕时，本中心采用短时IVF联合早期补救ICSI或half-ICSI授精预防受精率低下。临床观察两种授精方式均能一定程度上避免受精率低下，但也存在对受精正常的卵子过度ICSI的风险。为探讨两种授精方式的利弊、指导临床，本研究回顾性分析比较两者的受精情况、胚胎发育以及移植后妊娠结局。
3.2 两种方案对卵子受精、发育潜能的影响排除卵子成熟障碍、获卵数偏少这2个偏倚因素后，A、B两组卵子成熟度、IVF受精低下周期率差异均无统计学意义(卵子成熟度88.9% vs 88.6%，χ2=0.060，P=0.806；IVF受精低下周期率10.4% vs 10.6%，χ2=0.002，P=0.966)，说明该研究数据避免了授精方式以外因素对受精结果的干扰，结果较可靠。
研究结果显示，虽然A组的正常受精率低于B组，但两组可用胚胎率、优质胚胎率以及囊胚形成率差异均无统计学意义。由此看出，短时IVF在正常受精率偏低的情况下能达到与half-ICSI类似的胚胎发育结局。因此我们认为短时IVF有改善受精后胚胎发育结局的潜在优势。其主要原因可能是由于短时IVF缩短了精卵共孵育时间并及早更换了体外培养基，从而减少了精子等细胞代谢产物及过氧化物对胚胎后续发育的影响[11-12]。
Half-ICSI助孕的ICSI率远远高于短时IVF(45.1% vs 10.0%，χ2=480.686，P < 0.01)，且其中89.8%的卵子是常规IVF受精率正常的卵子，属于过度ICSI。短时IVF则仅在受精率低下时对未受精卵子行早期补救ICSI授精，不存在过度ICSI。由此可见，虽然half-ICSI可因较高的ICSI率提高卵子的正常受精率，但存在过度ICSI风险。目前ICSI对于后代的远期影响仍有争议，因此应尽量避免过度ICSI。
进一步分析IVF受精率低下周期，短时IVF联合早期补救ICSI的正常受精率高于half-ICSI(77.9% vs 49.4%，χ2=23.833，P < 0.01)。主要原因是短时IVF利用早期补救ICSI及时补救未受精卵子，而half-ICSI助孕时近一半卵子因未发现受精失败而未行ICSI造成了卵子的浪费(ICSI率83.1% vs 59.0%，χ2=19.844，P < 0.01)。蒋彦等[13]回顾性分析常规IVF完全受精失败周期中half-ICSI与短时IVF联合早期补救ICSI两种授精方式的助孕结局，发现两组受精率、优质胚胎率及妊娠率差异无统计学意义。但蒋彦等[13]在分析受精完全失败周期时仅统计了half-ICSI组以及短时受精联合早期补救ICSI(Re-ICSI)组中行ICSI授精的卵子，因纳入对象常规IVF授精完全失败，half-ICSI组存在近一半卵子未受精且未行ICSI，而在Re-ICSI组所有卵子均接受了早期补救ICSI，由此可见，两组之间存在卵子利用度的偏差，可能影响获得卵子的总体受精情况。本研究将两组的总获卵数作为一个整体来分析受精结局，因此结果更加合理，对临床的指导作用更加全面、直观。正是由于我们考虑了half-ICSI助孕时行IVF的卵子受精情况，从而发现了短时IVF具有充分利用卵子提高正常受精率的优势。
3.3 两种方案对移植后临床妊娠结局的影响避免IVF失败、保证卵子受精率可使患者有更多的胚胎移植和冷冻，增加妊娠率。朱琴等[14]发现half-ICSI助孕时，IVF受精低下周期的妊娠结局与IVF受精正常周期的差异无统计学意义，由此认为half-ICSI不仅能有效防止受精失败，还能获得较理想的妊娠结局。刘琨等[15]也认为在短时受精基础上实施早期补救ICSI有助于增加胚胎利用率，降低无胚胎移植风险，改善临床妊娠结局。
胚胎着床需要具有发育潜能的胚胎及良好容受性的子宫内膜。近年来，玻璃化冷冻技术的成熟保证了稳定的胚胎冷冻复苏率[16]。Achache和Revel[17]认为胚胎种植失败，胚胎因素仅占三分之一，子宫内膜容受性是剩余三分之二的原因。因此，患者存在卵巢过度刺激综合征、子宫内膜过薄或过厚或回声不均、输卵管积水、合并内科急症等不利因素时，为避免浪费胚胎均在患者知情同意下选择放弃新鲜胚胎移植、冻存胚胎, 择期接受冻融胚胎移植助孕。接受新鲜胚胎移植助孕患者的基本情况较为平衡，利于观察胚胎因素对妊娠结局的影响。吴丽敏等[18]在常规IVF完全受精失败周期中比较了早期补救ICSI与half-ICSI两种授精方式的妊娠结局，发现两者可获得相似的新鲜胚胎妊娠结局。
本研究中，A、B两组平均移植胚胎数(1.91±0.29 vs 1.92±0.27，t=-0.244, P=0.808)、移植日子宫内膜厚度(10.96±1.84 vs 11.05±1.62，t=1.780, P=0.077)、移植囊胚率(3.2% vs 4.1%，Fisher确切概率法，P=0.749)差异均无统计学意义。比较A、B两组中接受新鲜胚胎移植助孕患者的妊娠结局发现，与half-ICSI相比，短时IVF的临床妊娠率、流产率、胚胎着床率差异均无统计学意义，与既往研究结果[18]一致。本研究中，短时IVF助孕组总体正常受精率偏低，胚胎发育结局与half-ICSI助孕组类似，提示短时IVF有改善受精后胚胎发育结局的潜在优势。尽管如此，A、B两组新鲜胚胎移植后的妊娠结局差异无统计学意义，可能与样本量偏少有关。
3.4 小结相比既往研究[13, 18-19]，本研究认为短时IVF和half-ICSI是预防受精率低下的两种授精方式，分析两者利弊时应采用历史队列研究的方法。从确定存在受精障碍高危因素拟行短时IVF或half-ICSI时为起始时间点，追踪分析患者最终总体结局，研究结果更加贴近临床，指导意义更加直接。此外，本研究在总体分析后结合了亚组分析，即以IVF受精率低下的half-ICSI助孕与实施了早期补救ICSI的短时IVF助孕患者为研究对象进行了人群亚组分析，排除half-ICSI助孕过度ICSI影响总体正常受精率的干扰。本研究方法合理，结果具有一定说服力，可指导临床。
综上所述，与half-ICSI相比，短时IVF助孕能避免过度ICSI风险，且联合早期补救ICSI后因能及时对未受精卵子进行早期补救ICSI，可提高卵子利用率以及受精能力低下卵子的正常受精率。本研究为回顾性研究，存在偏倚，且纳入短时IVF联合早期补救ICSI助孕的病例较少，具有一定的局限性，因此需要大样本、设计良好的前瞻性随机对照临床试验研究进一步探索。
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