蝙蝠蛾拟青霉(Paecilomyces hepiali)和中国弯颈霉(Tolypocladium sinenis)都是从冬虫夏草的菌核和子座的菌丝组织分离而得到的虫生真菌，有资料表明中国弯颈霉的基因测序结果与基因数据库收录的冬虫夏草的基因测序(登录号AF291749)进行比对其相似性达99%^[1]。我们前期研究发现天然冬虫夏草、冬虫夏草菌丝和发酵液中游离氨基酸的种类和含量并不相同^[2]，但目前尚未见对蝙蝠蛾拟青霉和中国弯颈霉2种虫生真菌菌丝的蛋白质氨基酸分析和研究的报道。本研究采用世界卫生组织和联合国粮农组织(World Health Organization/Food and Agriculture Organization，WHO/FAO)提出的必需氨基酸模式谱作为评价的参考标准，对2种虫生真菌菌丝的蛋白质氨基酸进行含量分析和质量评价，并且与标准蛋白质的氨基酸模式^[3-7]进行比对，为2种真菌的其他相关研究和应用提供依据。

蝙蝠蛾拟青霉和中国弯颈霉的菌种均是从冬虫夏草的菌核组织和子座产孢组织中分离获得的纯菌种^[8]。试管母种通过人工发酵培养而获得大量菌丝体，菌丝体经过冷冻干燥、粉碎，制成发酵菌粉，保存在4 ℃以下，用于蛋白质氨基酸的分析。

氨基酸标准品购自美国Sigma公司。甲醇、乙腈为色谱纯，其他试剂均为分析纯。水为超纯水。Agilent 1200高效液相色谱仪购于美国安捷伦公司，Hypersil Gold C₁₈柱(250 mm×4.6 mm，5 μm)购自美国赛默飞公司；D2900型旋转式振荡器购自江苏省太仓市强乐实验设备厂；CP225D型电子分析天平购自德国赛多利斯公司；JL型超声波清洗器购自上海杰理科技有限公司。

准确称取菌丝粉200 mg，置于水解管中，加入20 mL 6 mol/L盐酸封管，在110 ℃烘箱中水解24 h后，冷却，启封，过滤，定容至10 mL，待测样品液上样。上柱前，向样品液中加入邻苯二甲醛-氯甲酸芴甲酯(o-phthalaldehyde-fluorenylmethyl chloroformate，OPA-FMOC)，混合均匀后自动衍生化，然后上柱，上样量10 μL。

色谱柱为Hypersil Gold C₁₈柱(250 mm×4.6 mm, 5 μm), 柱温40 ℃, 检测波长338 nm。流动相A为20 mmol/L NaAc+0.3%四氢呋喃、0.02%三乙胺，流动相B为100 mmol/L醋酸钠-甲醇-乙腈(200:450:350，体积比)，pH 2.2。梯度：0~60 min，B相5%升至56%；60~64 min，B相保持56%;64~68 min，B相100%。流速1.0 mL/min。采用外标法定量，参照标准品氨基酸，计算各种蛋白质氨基酸的含量。由于采用盐酸水解法，色氨酸不稳定，本研究对色氨酸的分析不讨论。

根据WHO/FAO提出和推荐的必需氨基酸模式和计算方法^[4-6]，作为蛋白质氨基酸质量评价的参考标准。

即每一种必需氨基酸占总氨基酸量的百分含量。WHO/FAO根据氨基酸平衡理论设计了必需氨基酸模式谱，每一种必需氨基酸的质量分数越接近WHO/FAO模式谱其质量就越优。

利用必需氨基酸模式计算样品中RAA、RC和SRC。RAA的含义为样品中蛋白质的某种必需氨基酸含量相当于模式中相应必需氨基酸的多少倍，计算公式：RAA=待测样品某必需氨基酸含量/模式中相应必需氨基酸含量。由于不同的食品和药品中各种必需氨基酸RAA往往不相同，故可计算RAA的平均数，从而计算RC。RC=待测样品某必需氨基酸RAA/RAA的平均数。模式氨基酸的RC为1，如果待测样品中蛋白质必需氨基酸组成含量比例与模式氨基酸一致，则待测样品中各种必需氨基酸的RC等于1；RC大于或小于1均表示偏离氨基酸模式，RC＞1表明该种必需氨基酸相对过剩，RC＜1则表明该种必需氨基酸相对不足。SRC=100-CV×100，其中CV为RC的变异系数(CV=标准差/平均数)。如果生物制品的必需氨基酸组成比例与必需氨基酸模式一致，则CV=0，SRC=100；生物制品蛋白质必需氨基酸的RC越分散，表明这些必需氨基酸在氨基酸平衡生理方面所起的负作用就越大，导致CV变大，SRC变小，蛋白质的营养价值越差；相反，SRC越接近100，其氨基酸组成就接近人体需要，其利用率就越高。

WHO/FAO设计了一种标准蛋白质的必需氨基酸模式，该方法含义是：在标准蛋白质中每种必需氨基酸在必需氨基酸总量中所占的含量(mg·g^-1)，依据标准蛋白质的模式含量为参考标准，对生物制品蛋白质的营养价值进行评定。

在2种虫生真菌菌丝的氨基酸分析中共测出17种氨基酸，其中7种为必需氨基酸，2种为半必需氨基酸(精氨酸、组氨酸)。2种真菌菌丝的蛋白质氨基酸含量差异较大，蝙蝠蛾拟青霉有4种氨基酸(天冬氨酸、缬氨酸、异亮氨酸、亮氨酸)含量超过中国弯颈霉，而中国弯颈霉有11种氨基酸(谷氨酸、丝氨酸、甘氨酸、苏氨酸、精氨酸、丙氨酸、酪氨酸、胱氨酸、蛋氨酸、赖氨酸、脯氨酸)含量超过蝙蝠蛾拟青霉。两者含量最高的氨基酸是谷氨酸，分别为20.69 mg/g和24.83 mg/g；含量最低的为蛋氨酸，分别为1.30 mg/g和2.20 mg/g。中国弯颈霉的氨基酸总量(203.05 mg/g)、必需氨基酸总量(68.03 mg/g)和非必需氨基酸总量(135.02 mg/g)都高于蝙蝠蛾拟青霉(分别为176.40、62.71和113.69 mg/g)，蝙蝠蛾拟青霉的支链氨基酸含量(34.59 mg/g)高于中国弯颈霉(32.00 mg/g)，2种真菌支链氨基酸与芳香族氨基酸的比值较接近(分别为2.28和2.08)。详见表 1。

表 1 (Tab 1)

表 1 2种虫生真菌菌丝的蛋白质氨基酸含量 wB/(mg·g-1) 氨基酸 蝙蝠蛾拟青霉 中国弯颈霉 天冬氨酸  17.44  15.45 谷氨酸  20.69  24.83 丝氨酸  11.84  13.95 组氨酸   5.17   5.14 甘氨酸  10.75  18.50 苏氨酸   8.94   9.20 精氨酸  12.07  16.25 丙氨酸  13.65  15.71 酪氨酸   5.82   6.04 缬氨酸  11.33  10.67 胱氨酸   6.07   7.96 蛋氨酸   1.30   2.20 苯丙氨酸   9.32   9.33 异亮氨酸   8.83   7.50 亮氨酸  14.43  13.83 赖氨酸   9.86  17.50 脯氨酸  10.18  11.19 氨基酸总量 176.40 203.05 必需氨基酸总量  62.71  68.03 非必需氨基酸总量 113.69 135.02 支链氨基酸总量  34.59  32.00 芳香族氨基酸总量  15.14  15.37 支链氨基酸/芳香族氨基酸   2.28   2.08

表 1 2种虫生真菌菌丝的蛋白质氨基酸含量

蝙蝠蛾拟青霉的各种必需氨基酸的质量分数与WHO/FAO模式谱比对后，除蛋氨酸+胱氨酸略低于WHO/FAO模式谱外，其他必需氨基酸均高于WHO/FAO模式谱标准；中国弯颈霉除亮氨酸略低于WHO/FAO模式谱外，其他必需氨基酸都高于WHO/FAO模式谱的标准(表 2)。说明2种虫生真菌菌丝蛋白的必需氨基酸与推荐的人体必需氨基酸模式相比，其营养比较均衡，有很高的营养价值。

表 2 (Tab 2)

表 2 2种虫生真菌菌丝各种必需氨基酸占总氨基酸的质量分数 % 氨基酸 质量分数 WHO/FAO模式谱 蝙蝠蛾拟青霉 中国弯颈霉 苏氨酸 5.01 4.53 4.0 缬氨酸 6.42 5.30 5.0 蛋氨酸+胱氨酸 3.44 3.92 3.5 异亮氨酸 5.00 4.23 4.0 亮氨酸 8.18 6.81 7.0 苯丙氨酸+酪氨酸 8.58 7.46 6.0 赖氨酸 5.64 8.61 5.5

表 2 2种虫生真菌菌丝各种必需氨基酸占总氨基酸的质量分数

氨基酸的营养价值主要由必需氨基酸的种类、数量和组成比例决定。蛋白质中所含必需氨基酸组成比例越接近人体必需氨基酸比例，其质量越好。为了确定2种冬虫夏草中氨基酸的营养价值，将其所含必需氨基酸与WHO/FAO推荐的氨基酸模式谱标准值进行比较，2种冬虫夏草种各种必需氨基酸的RAA、RC、SRC结果见表 3。蝙蝠蛾拟青霉中的蛋氨酸+胱氨酸RC最小，其次为赖氨酸，缬氨酸最大。而中国弯颈霉中亮氨酸的RC最小，其次为异亮氨酸，赖氨酸最大。

表 3 (Tab 3)

表 3 2种虫生真菌菌丝必需氨基酸的RAA、RC和SRC分析 氨基酸 蝙蝠蛾拟青霉 中国弯颈霉 RAA RC SRC RAA RC SRC 苏氨酸 1.252 1.067 1.132 0.972 缬氨酸 1.284 1.094 1.060 0.910 蛋氨酸+胱氨酸 0.983 0.838 1.120 0.962 异亮氨酸 1.250 1.065 1.057 0.908 亮氨酸 1.168 0.955 0.973 0.835 苯丙氨酸+酪氨酸 1.263 1.076 1.243 1.066 赖氨酸 1.017 0.867 1.572 1.349 92.06 88.17 RAA:氨基酸比值; RC:氨基酸比值系数; SRC:比值系数分

表 3 2种虫生真菌菌丝必需氨基酸的RAA、RC和SRC分析

蝙蝠蛾拟青霉所有的必需氨基酸都高于标准蛋白质模式含量；中国弯颈霉除了异亮氨基酸低于标准蛋白质模式外，其他必需氨基酸在必需氨基酸总量的含量都高于标准蛋白质的模式含量(表 4)。证实2种虫生真菌菌丝蛋白质氨基酸的优质性和营养性。

表 4 (Tab 4)

表 4 2种虫生真菌菌丝必需氨基酸与标准蛋白质模式比较 wB/(mg·g-1) 氨基酸 某种必需氨基酸量/必需氨基酸总量 蝙蝠蛾拟青霉 中国弯颈霉 标准蛋白质 异亮氨酸 141 111 129 亮氨酸 230 203 172 赖氨酸 157 257 125 苯丙氨酸 148 137 114 苏氨酸 143 135 99 缬氨酸 180 157 141

表 4 2种虫生真菌菌丝必需氨基酸与标准蛋白质模式比较

冬虫夏草是我国一味名贵的中药材，在我国西藏、青海、云南、贵州、四川、甘肃、广东及广西都有出产。其主要有效成分有虫草多糖、蛋白质和氨基酸、甘露醇、脂肪和脂肪酸、抗菌活性物质、虫草素和生物碱及微量元素等，其中氨基酸是虫草补益强壮、辅助治疗消化系统和神经系统疾病及增强免疫功能的物质基础之一^[9-10]。

我们前期研究发现天然冬虫夏草、冬虫夏草菌丝和发酵液中游离氨基酸的种类和含量并不等同^[2]，提示冬虫夏草不同部位的氨基酸含量和种类有所差异。高观世等^[7]对6种食用菌进行蛋白质评价，发现食用菌因品种、来源不同，组成蛋白质的氨基酸含量和几种必需氨基酸的组成比例与WHO/FAO模式谱有一定程度的差异，但可利用各品种之间的氨基酸互补性以改善这种差异，从而提高食用菌的营养价值。张登友等^[11]评价了4种金福菇菌株子实体的蛋白质营养价值，发现菌盖总氨基酸和RC均较菌柄的高, 而各菌株菌柄的必需氨基酸指数和生物价均高于菌盖^[2]，这与我们前期在冬虫夏草中得出的结论一致。

为了深入探讨冬虫夏草的营养价值和生物活性，本研究对蝙蝠蛾拟青霉和中国弯颈霉2种来源于冬虫夏草的虫生真菌菌丝的蛋白质氨基酸进行分析，结果发现2种虫生真菌菌丝蛋白质氨基酸含量较高，种类齐全，富含多种药效氨基酸，两者必需氨基酸与WHO/FAO提出的蛋白质氨基酸参考模式比较，结果显示蝙蝠蛾青霉略高于模式标准，中国弯颈霉与模式标准相接近。采用氨基酸比值系数求得SRC，2种虫生真菌菌丝蛋白质的必需氨基酸SRC(蝙蝠蛾拟青霉92.06、中国弯颈霉88.17)相对接近氨基酸模式(SRC为100)，两者的SRC均高于药用真菌松茸菌(Tricholoma matsutake，SRC为80.43)、食用菌真姬菇(Hypsizygus marmoreus，SRC为80.43)，更高于几种植物蛋白质的必需氨基酸的SRC，如大米的SRC为70.5，绿茶为72.5，桑叶为69.71，乌饭树叶为77.05^[12-15]。说明2种虫生真菌菌丝均具有较高的营养价值。但我们同时也发现，蝙蝠蛾拟青霉中天冬氨酸、缬氨酸、异亮氨酸、亮氨酸以及支链氨基酸的含量高于中国弯颈霉，中国弯颈霉中谷氨酸、丝氨酸、甘氨酸、苏氨酸、精氨酸、丙氨酸、酪氨酸、胱氨酸、蛋氨酸、赖氨酸、脯氨酸以及氨基酸总量、必需氨基酸总量、非必需氨基酸的含量则高于蝙蝠蛾拟青霉，说明两者的蛋白质氨基酸含量并不等同。

综上所述，本研究发现蝙蝠蛾拟青霉与中国弯颈霉2种来源于冬虫夏草的虫生真菌菌丝均具有较高的营养价值，但二者的蛋白质氨基酸含量并不等同，为进一步探讨冬虫夏草的辅助治疗功能提供了实验依据。