早产儿视网膜病变(retinopathy of prematurity, ROP)是发生于新生早产儿的血管增生性视网膜病变，病理表现为视网膜组织缺氧、视网膜新生血管(retinal neovascularization, RNV)形成、纤维增生等^[1]。20世纪50年代，大量临床研究发现高浓度给氧可以明显改善早产儿呼吸状况，因此早产儿的补充氧气疗法在当时广泛应用，但ROP的发病率也在逐年增加^[2]。自此，研究人员开始尝试将氧气与ROP联系在一起，探索构建各种动物模型以了解ROP及RNV的发生机制。Smith等^[3]在1994年首先成功构建氧诱导视网膜病变(oxygen-induced retinopathy, OIR)小鼠模型，通过数年的改进和完善后该模型不仅构建方法简单、重复性好、成功率高，而且与电凝法、药物诱导法、转基因法、光凝法等^[4-5]其他方法相比，其视网膜病变过程更接近人类ROP新生血管的发生过程，故被广泛应用。

将出生后第7天(P7)的小鼠与哺乳母鼠一起放置于密闭氧箱中，氧浓度维持在75%±2%；哺乳5 d后将第12天(P12)小鼠与哺乳母鼠放回室内标准环境下饲养(氧浓度21%)，饲养5 d后即小鼠出生后第17天(P17)时模型构建结束^[3]。小鼠玻璃体血管和视网膜血管的发育存在一种相反的关系，即玻璃体血管在刚出生时存在，但随时间延长逐渐退化，而视网膜血管在出生时基本不存在，但在出生后第1周内逐渐生长。根据此生理现象，研究人员发现小鼠在P7时玻璃体血管的退化程度最大，视网膜血管的发育程度最低，随后易出现可视化的新生血管，同时可减少玻璃体血管造成的干扰，因此形成了最佳造模时间^[6]。ROP可分为两个典型的发展阶段：不成熟血管闭塞阶段和新生血管病理性增生阶段^[6]。在此模型中，第一个阶段从P7到P12，此阶段未成熟的视网膜血管经历退化。大多数的血管闭塞出现在高氧暴露下的第一个48 h，有观点认为这是机体为维持正常氧浓度发生的可逆性血管痉挛收缩^[7]。在第9天可观察到最早的血管再生长，此时小鼠仍处于高氧环境，这可能是发育中的视网膜因丢失大量血管故而需要增加营养的反应。P12到P17为第二阶段，P12时将小鼠转移至室内正常空气环境中, 此时血管闭塞区域相对缺氧刺激促血管生成因子产生，从而形成RNV，这是OIR模型第二阶段的标志，也是导致视力障碍最主要的原因。新生血管在P12开始发育，第14天(P14)快速增生，到P17时达最高峰^{[3, 7]}。随着血管不断修复，促血管生成因子不断减少，P17时新生血管开始消退，第25天(P25)时几乎完全消退被正常血管系统替代^[8]。通常，使用第8天(P8)至P12的视网膜评估第一阶段，即视网膜血管闭塞阶段；P17的视网膜用于第二阶段新生血管形成的检测。

大量研究证实血管内皮生长因子(vascular endothelial growth factor，VEGF)的表达对于OIR模型中正常视网膜血管发育和新生血管异常增生至关重要。高氧会抑制OIR小鼠模型中VEGF产生，从而抑制血管生长导致初期不成熟血管消退，当小鼠重新回到正常空气环境中时中央视网膜相对缺氧会上调VEGF水平，从而促进病理性新生血管的增生^{[1, 7, 9]}。进一步研究发现VEGF只是OIR模型中所涉及到的许多血管生长因子之一，外源性促红细胞生成素(erythropoietin，EPO)、类胰岛素生长因子1及其受体(insulin-like growth factor 1/receptor，IGF-1/IGF-1R)、ω3-多不饱和脂肪酸等细胞因子也有明显作用^[10]。有研究表明，在OIR新生血管病理性增生阶段用siRNA敲低EPO表达可减少新生血管形成，表明该阶段高水平EPO促进病理性视网膜血管生成^[11]；用IGF-1R抑制剂抑制IGF-1活性可减少RNV形成，加速生理血管再生，改善视网膜功能，而这与VEGF水平无关，可能是通过调节基质金属蛋白酶2(matrix metalloproteinases-2，MMP-2)发挥作用^[12]。细胞色素P450 CYP 2C8 ω3-长链多不饱和脂肪酸代谢产物可增加小鼠病理性RNV形成, 因此CYP 2C8可能影响了RNV形成中异常脂代谢途径^[13]。

20世纪50年代，许多OIR模型的研究并没有特定的动物种类，学者们尝试用猫、家兔、犬、大鼠、小鼠等动物构建OIR模型，因小鼠具有体型小、繁殖快、易饲养、品种多、遗传背景详尽等优点逐渐脱颖而出。目前常使用的小鼠品种为具有较低眼部先天性变异率的C57BL/6小鼠。随着对血管再生的深入研究和基因技术的进步，不同品种小鼠的眼部血管再生对外源性血管生成因子、炎症因子和血管系统的反应具有较大的遗传异质性^[14]。C57BL/6小鼠较BALB/cJ小鼠有更强的视网膜感受器对氧分压的易感性^[15]，而与129S3/SyIM小鼠相比具有较低的血管生成水平^[16]。为减少小鼠品种因素对实验结果的干扰，小鼠应从指定供应商的相同品种中进行筛选，且实验应包括同种体内对照和多个同窝抽样等，以使年龄和遗传异质性最小化。转基因小鼠研究的实验组和对照组小鼠也应有相同的遗传背景。

OIR模型构建的高氧环境是模拟人类早产儿出生时的环境暴露，氧箱内氧气百分含量的选择是影响造模成功与否的关键因素。早前，有些组织对于引发视网膜病变的氧气浓度的阈值见解不一，研究表明，随着氧浓度增加血管的增生性反应相应增加，较低的氧浓度(低于75%)下小鼠无明显的血管闭塞和新生血管性反应^[3]，但若氧浓度超过80%视网膜血管的增生性反应增加的幅度相对较小，哺乳期母鼠和幼崽的死亡率骤升，加大了实验难度^[17]，因此，选择75%的氧浓度作为基本实验条件，不仅可使小鼠视网膜产生一致的血管增生性反应也可减少动物消耗。

高氧毒性是OIR小鼠模型的主要问题。早期OIR小鼠模型实验报道哺乳期母鼠对高氧环境耐受能力低于其幼崽^[6]，高氧不仅会影响母鼠的哺乳行为和生育能力，严重时还可使母鼠肺部中毒而死亡。因此，在造模期间适当替换母鼠十分重要。此外，我们在实验中观察到哺乳期母鼠暴露于高氧后不能再多产地繁殖，因此不应用于育种目的，并且在高氧环境和正常氧环境下频繁处理饲养笼易引起母鼠吞食其幼崽。由于小鼠幼崽在刚出生的21 d内依赖母鼠乳汁汲取营养，所以母鼠或替代母鼠的生理健康和精神行为正常对于小鼠幼崽的存活至关重要(结果未发表)。据报道，构建OIR小鼠模型时，将每日持续高氧暴露改为22 h高氧暴露+2 h常氧暴露，可最大限度降低高氧对母鼠的不利影响^[17]。近期我们在改良实验中发现2只母鼠12 h交替哺乳可显著改善母鼠的营养水平，并降低母鼠死亡和吞食小鼠的发生率，较6 h交替哺乳相比既节省人力也提高了效率(结果未发表)。

产后体质量增加量是新生儿营养状况的指标之一。近年来，监测PWG和IGF-1已成为预测ROP的可靠方法^[18-19]。因此，PWG也引起了许多动物建模者的关注。Vanhaesebrouck等^[20]发现来自大窝的小鼠具有较低的体质量且存在更严重的RNV病变，同时强调了幼崽数量对出生后小鼠生长和营养状况的重要性。Stahl等^[21]研究发现与中等PWG(5~7.5 g)和较高PWG(> 7.5 g)的幼崽相比，较低PWG( < 5 g)的幼崽具有明显延长的血管闭塞和新生血管阶段，随后他们探究了替代母鼠和幼崽的数量对PWG的影响，结果发现通过第一阶段额外替代母鼠的使用和减少幼崽数量可提高幼崽的PWG，改善其营养状况。此外，我们在OIR造模中发现体质量较小的小鼠对于麻醉药耐受能力差、死亡率较高，严重影响后续玻璃体内注射等干预实验的开展(结果未发表)。因此，记录幼崽数量是OIR小鼠模型构建中十分重要的环节，因为其可以显著影响OIR小鼠的PWG和视网膜病变程度。目前有学者建议将一窝小鼠的数量限制为8只以保证每只小鼠达到较佳的营养状况，记录所有OIR实验中的体质量数据，并在P17时剔除体质量低于6 g的小鼠^[6]，以确保比较时使用的小鼠体质量基本一致。

早期OIR研究发现，暴露于第一阶段高氧的小鼠在黑暗中比在光照中生成更多的新生血管，这种差异可能是由于夜间视网膜较高的代谢需求所致。进一步研究证实暗环境下视网膜光感受器中的视杆细胞代谢旺盛，耗氧量大，加速了病理性新生血管的发展^[22]。在照明环境中视锥细胞的活动可显著抑制视杆细胞的活动，从而减少了视网膜的耗氧量，在一定程度上减少了促新生血管生成因子的释放，进而抑制了RNV的生成^[23]。Natoli等^[24]研究发现，OIR小鼠模型在构建期间暴露于670 nm红光可减少OIR小鼠血-视网膜屏障破坏、血管闭塞和视网膜血管分支形成，并显著减轻肺损害。因此，可以推断与昼夜节律有关的光照暴露可能对OIR发挥着重要作用，在同一时间开始实验和样品收集对减少这种因素所造成的潜在变异十分重要。

近年来荧光标记外源性凝集素染色法、荧光素异硫氰酸葡聚糖(fluorescein isothiocyanate-dextran，FITC-dextran)灌注法、CD31抗体玻璃体腔注射法的出现大大提高了小鼠视网膜中血管的可视化^[25-26]。Li等^[27]研究表明达到视网膜染色相同效果的情况下，FITC-dextran眶后注射法比心脏灌注法节约了更多的FITC-dextran，操作程序也更为简单，同时他们用此方法观察了第2天(P2)、P8和P17正常小鼠中视网膜血管的荧光染色，结果表明FITC-dextran的眶后注射可适用于所有年龄段的小鼠。通过免疫荧光标记血管内皮特异性抗原CD31可显著标记RNV的分布和无血管区域。值得注意的是，与正常血管相比CD31能更明显地标记出病理性RNV，并且几乎不存在FITC-dextran心脏灌注法因视网膜病理性新生血管不完全吻合的微血管腔所造成的“盲区”^[26]，因此提高了RNV量化的准确度。Liang等^[26]研究表明，西非单豆凝集素(Griffonia simplicifolia lectin, GSL)染色的冷冻切片可以清楚地显示OIR小鼠视网膜深部和浅表毛细血管床的新生血管簇，GSL结合于内皮细胞的表面可短时间内在视网膜中清楚地鉴别出病理性新生血管，与过碘酸-希夫(periodic acid-Schiff，PAS)或苏木精-伊红(hematoxylin-eosin，H-E)染色的切片中计数穿透内界膜的细胞核数，比较发现GSL染色方法更加客观有效。在OIR动物模型中眼底荧光素血管造影术(fundus fluorescein angiography，FFA)相比于前面所提及的染色技术，其优势是可以在活体中进行动态观察减少了动物损耗，但因其对动物大小和操作技术的要求过高，故而在OIR小鼠模型中运用较少。此外，病理性新生血管与正常血管具有较高对比度，加上ImagePro^® Plus软件的自动识别功能、Adobe Photoshop软件的图像跟踪和像素计算，可对OIR小鼠模型视网膜结果进行综合详细的定量评估，增加实验数据的准确性和客观性^[28]。

目前OIR小鼠模型已被广泛接受并应用于研究RNV形成的分子机制、病理生理和靶向治疗中，如CD34^[29]、白细胞介素12(interleukin-12, IL-12)^[30]等分子在病理性RNV形成中的作用研究等。此外，关于此模型氧化应激的作用也进行了大量研究^[31-32]，内源性和人工合成的抗氧化剂在抗OIR中可能起关键作用^[17]。β-肾上腺素能受体活性的调节可改变OIR中的血管生成活性^[33]。Kim等^[34]发现自然免疫的主要组成部分即补体替代途径可在不损坏正常视网膜血管系统的情况下协助清除病理性的新生血管，且这一作用不受VEGF的影响。正常情况下视网膜血管表达的补体抑制因子会阻碍病理性新生血管的清除，而在OIR第二阶段即病理性新生血管形成阶段补体抑制因子的水平发生了下调，因此研究人员认为病理性的新生血管可能会被补体替代途径定向消除。未来随着免疫染色和遗传操作技术的进步，在OIR小鼠模型的基础上，可能会建立新的血管增生性视网膜病变动物模型，如RNV病变斑马鱼模型的发展^[35-36]。但是，目前OIR小鼠模型的地位是不可替代的，其为研究许多眼部疾病的新生血管生成、神经炎症和探索新治疗策略奠定了坚实基础。