腹膜透析(peritoneal dialysis, PD)是肾脏替代治疗的重要方式之一，利用自身腹膜等半透膜的作用，缓慢持续清除体内潴留的代谢产物和过多的水分，达到肾脏替代或支持治疗的目的。越来越多的研究表明，蛋白结合毒素(protein-bound toxins, PBT)对终末期肾脏病患者预后具有非常大的影响^[1-2]。然而目前针对PD患者PBT的研究较少，可能影响血清PBT浓度的相关因素尚不明确。因此，本研究利用高效液相色谱-电喷雾电离串联质谱技术(high-performance liquid chromatography-electrospray ionization tandem mass spectrometry, HPLC-ESI-MS/MS)对第二军医大学长征医院收治的PD患者及健康志愿者的血清PBT代表物质硫酸吲哚酚(indoxyl sulfate，IS)和硫酸对甲酚(p-cresyl sulfate，PCS)水平进行比较分析，探讨影响PD患者IS和PCS水平的可能因素。

纳入第二军医大学长征医院腹透中心2015年2月至7月符合入选标准的72例PD患者和体检中心24例健康志愿者。PD患者入选标准：(1)慢性肾衰竭腹膜透析治疗的患者；(2)年龄18~75岁，性别不限；(3)规律维持性PD治疗≥1个月；(4)未使用自动腹膜透析机；(5)未合并血液透析治疗；(6)已签署书面知情同意书。具有下列情况之一者不入选本研究：(1)慢性自身免疫疾病(类风湿关节炎、系统性红斑狼疮等)活动期或活动性感染；(2)哺乳期或妊娠期；(3)合并晚期恶性肿瘤；(4)1个月内曾发生心血管事件；(5)拒绝参与本研究者；(6)其他不适宜入选本研究者。健康志愿者入选标准：(1)年龄18~75岁，性别不限；(2)已签署书面知情同意书。排除标准同PD患者。此临床试验已通过第二军医大学长征医院生物医学研究伦理委员会审批(批件编号：2014SL027)。

收集PD患者及健康志愿者性别、年龄等一般资料，PD患者还需收集透析龄、肾脏原发病等资料。所有PD患者及健康志愿者均于采血前1日19：00后禁食，次日6:00空腹静脉采血3 mL。血样分别做血常规、C-反应蛋白(C-reaction protein，CRP)、肝肾功能、电解质等检查。PD患者需进行腹膜透析充分性及转运特性评估，主要包括临床评估、溶质清除指标[尿素清除指数(Kt/V)、肌酐清除率(creatinine clearance rate，Ccr)]以及腹膜平衡试验(peritoneal equilibration test，PET)。Kt/V、Ccr、PET、肾小球滤过率估计值(estimated glomerular filtration rate，eGFR)根据上海市慢性肾脏病及透析患者登记系统在线计算软件(http://www.cnrds.org/)得出。

利用HPLC-ESI-MS/MS技术测定血清IS和PCS浓度。其检测条件包括色谱条件和质谱条件。色谱条件：色谱柱为Agilent Zorbax SB C₁₈柱(100 mm×2.1 mm, 3.5 μm)；柱温：30 ℃；流速0.3 mL/min；进样体积5 μL；流动相为10%乙腈+90%水(10 mmol/L醋酸铵)，等度洗脱；分析时间4 min。质谱条件：采用ESI离子源、负离子模式，喷雾电压4 000 V，源温度为105 ℃，多反应监测(multiple reaction monitoring，MRM)模式。各检测成分的质谱参数见表 1。雾化气和干燥气均为氮气；碰撞气为高纯氮气，压力为0.1 MPa。其他质谱参数优化后如下：雾化压力为275.8 kPa(40 psi)；干燥气温度为350 ℃，流速为10 L/min^[3]。

表 1 (Tab 1)

表 1 待测化合物和内标化合物的质谱检测参数 Tab 1 Parameters of mass spectrometric detection of analytes and internal standard compouds Analyte Precursor ion Fragmentor U/V Collision energy Q/eV Product ion Indoxyl sulfate 212.2 130 20 80.0 p-Cresyl sulfate 187.0 100 18 107.1 Hydrochlorothiazide 296.0 180 25 205.1

表 1 待测化合物和内标化合物的质谱检测参数 Tab 1 Parameters of mass spectrometric detection of analytes and internal standard compouds

应用SPSS 21.0软件进行统计学分析，计量资料以x±s表示，服从正态分布且两组间方差相等者采用独立样本t检验，不满足以上任一条件采用非参数检验。单因素相关性分析采用Pearson相关性分析，多因素相关性分析采用多元线性回归分析方法。检验水准(α)为0.05。

符合本研究纳入条件的PD患者有72例，男42例、女30例，年龄(44.94±14.70)岁，透析龄(10.49±12.97)个月，平均Kt/V为2.23±1.00，总Ccr为(77.82±28.66) mL/min(总Ccr=残肾Ccr+腹膜Ccr)。原发性慢性肾小球肾炎29例，糖尿病肾病4例，高血压肾病17例，痛风性肾病2例，常染色体显性遗传(成年型)多囊肾病(autosomal dominant polycystic kidney disease, ADPKD) 5例，狼疮性肾病1例，肾发育不良2例，胡桃夹综合征1例，乙肝相关性肾损害2例，原因不明9例。健康志愿者24例，男15例、女9例，年龄(39.79±10.40)岁。两组年龄(t’=1.880, P=0.065)、性别(χ²=0.130, P=0.719)差异均无统计学意义。

24例健康志愿者的血清游离IS和游离PCS浓度均在HPLC-ESI-MS/MS最小检测限之下。PD患者血清总IS及总PCS浓度均高于健康志愿者，差异有统计学意义(P < 0.001)。见表 2。

表 2 (Tab 2)

表 2 PD患者与健康志愿者血清IS和PCS浓度 Tab 2 Concentration of serum IS and PCS in PD patients and healthy volunteers ρB/(mg·mL-1), x±s Index PD patients n=72 Control n=24 Statistic P value Total IS 17.96±11.31 1.26±0.56 t’=12.481 < 0.001 Free IS 1.40±1.21 - Total PCS 17.17±12.99 2.17±2.44 t’=9.310 < 0.001 Free PCS 1.18±1.17 - “-” indicates that the data are lower than detection limit of HPLC-ESI-MS/MS. HPLC-ESI-MS/MS: High-performance liquid chromatography-electrospray ionization tandem mass spectrometry; PD: Peritoneal dialysis; IS: Indoxyl sulfate; PCS: p-Cresyl sulfate

表 2 PD患者与健康志愿者血清IS和PCS浓度 Tab 2 Concentration of serum IS and PCS in PD patients and healthy volunteers

PD患者按性别分组，比较总IS、游离IS、总PCS及游离PCS浓度，组间差异均无统计学意义。见表 3。

表 3 (Tab 3)

表 3 PD患者血清IS和PCS浓度的性别差异 Tab 3 Concentrations of serum IS and PCS in male and female patients undergoing PD ρB/(mg·mL-1), x±s Index Male n=42 Female n=30 Statistic P value Total IS 18.79±12.17 16.80±10.08 t=0.733 0.466 Free IS 1.40±1.30 1.42±1.08 t=－0.075 0.940 Total PCS 16.22±14.34 18.49±10.94 t=－0.729 0.469 Free PCS 1.23±1.36 1.12±0.86 t=－0.373 0.711 PD: Peritoneal dialysis; IS: Indoxyl sulfate; PCS: p-Cresyl sulfate

表 3 PD患者血清IS和PCS浓度的性别差异 Tab 3 Concentrations of serum IS and PCS in male and female patients undergoing PD

将PD患者根据有残肾功能和无残肾功能(腹透患者尿量 < 100 mL为无残肾功能)分为2个亚组，无残肾功能的PD患者血清总IS浓度高于有残肾功能者，差异有统计学意义(P=0.001)，见表 4。

表 4 (Tab 4)

表 4 有无残肾功能的PD患者血清IS和PCS浓度的差异 Tab 4 Difference of serum IS and PCS concentrations in PD patients with RRF or not ρB/(mg·mL-1), x±s Index With RRF n=64 Without RRF n=8 Statistic P value Total IS 16.43±9.98 30.25±14.40 t=－3.509 0.001 Free IS 1.31±1.19 2.18±1.08 t=－1.975 0.052 Total PCS 16.92±11.06 19.12±24.65 t’=－0.968 0.333 Free PCS 1.14±1.01 1.52±2.14 Z=－0.806 0.420 PD: Peritoneal dialysis; RRF: Residual renal function; IS: Indoxyl sulfate; PCS: p-Cresyl sulfate

表 4 有无残肾功能的PD患者血清IS和PCS浓度的差异 Tab 4 Difference of serum IS and PCS concentrations in PD patients with RRF or not

单因素相关性研究显示, 血清总IS与血清游离IS、游离PCS、透析龄、血肌酐、腹膜Kt/V、总蛋白、白蛋白呈正相关(P < 0.05, P < 0.01)，与24 h尿量、总Kt/V、残肾Kt/V、总Ccr、残肾Ccr、残肾eGFR呈负相关(P < 0.05, P < 0.01)。总PCS与游离PCS呈正相关(P < 0.01)。血清游离IS与总IS、游离PCS、血肌酐、腹膜Kt/V、腹膜Ccr呈正相关(P < 0.01)，与24 h尿量、总Ccr、残肾Ccr、残肾eGFR呈负相关(P < 0.05, P < 0.01)。游离PCS与总IS、总PCS、游离IS呈正相关(P < 0.01)，与天冬氨酸转氨酶(AST)呈负相关(P < 0.05)。总IS、游离IS以及总PCS、游离PCS均与年龄、血红蛋白、CRP等指标无明显相关性。见表 5。

表 5 (Tab 5)

表 5 PD患者血清IS和PCS单因素相关性分析 Tab 5 Simple correlation analysis of serum IS and PCS in PD patients r Variable Total IS Total PCS Free IS Free PCS Total IS 0.146 0.719** 0.310** Total PCS 0.146 0.185 0.695** Free IS 0.719** 0.185 0.606** Free PCS 0.310** 0.695** 0.606** Age －0.124 －0.001 －0.155 －0.174 Dialysis duration 0.306** 0.131 0.144 0.139 Serum urea 0.142 －0.048 0.015 0.035 Serum creatinine 0.501** －0.047 0.452** 0.179 Serum uric acid －0.075 －0.086 －0.205 －0.154 24-Hour urine volume －0.290* 0.051 －0.277* －0.044 Total Kt/V －0.251* －0.027 －0.061 0.055 Peritoneal Kt/V 0.260* 0.113 0.362** 0.185 Residual renal Kt/V －0.372** －0.074 －0.210 －0.015 Total Ccr －0.476** －0.050 －0.351** －0.103 Peritoneal Ccr 0.226 0.077 0.325** 0.191 Residual renal Ccr －0.515** －0.071 －0.430** －0.156 Residual renal eGFR －0.495** －0.077 －0.431** －0.159 WBC 0.149 0.141 0.106 0.181 Hb 0.079 0.099 －0.116 －0.070 PLT －0.051 0.140 －0.077 0.094 TP 0.328** －0.009 0.040 －0.014 Albumin 0.299* 0.112 0.083 0.112 AST －0.091 －0.200 －0.187 －0.264* ALT 0.083 －0.030 －0.120 －0.105 TB 0.108 －0.107 0.107 －0.084 CRP －0.113 －0.204 －0.108 －0.161 PD: Peritoneal dialysis; IS: Indoxyl sulfate; PCS: p-Cresyl sulfate; Kt/V: Urea clearance index; Ccr: Creatinine clearance rate; eGFR: Estimated glomerular filtration rate; WBC: White blood cell; Hb: Hemoglobin; PLT: Platelet; TP: Total protein; AST: Aspartate aminotransferase; ALT: Alanine aminotransferase; TB: Total bilirubin; CRP: C-reactive protein. *P < 0.05, **P < 0.01

表 5 PD患者血清IS和PCS单因素相关性分析 Tab 5 Simple correlation analysis of serum IS and PCS in PD patients

筛选单因素相关性研究中P < 0.3的因素为自变量，采用逐步线性回归方法进行分析，结果(表 6)显示：血清总IS与游离IS、总Ccr、总蛋白独立相关(P < 0.01)；总PCS与总IS、游离IS、游离PCS独立相关(P < 0.01)；血清游离IS与总IS、总PCS、游离PCS、腹膜Kt/V独立相关(P < 0.05，P < 0.01)；血清游离PCS与总IS、总PCS、游离IS独立相关(P < 0.01)。

表 6 (Tab 6)

表 6 以血清IS和PCS为因变量的多元线性回归分析 Tab 6 Multivariable linear regression analysis of serum IS and PCS as dependent variables Variable Total IS Total PCS Free IS Free PCS β β’ P value β β’ P value β β’ P value β β’ P value Total IS 0.389 0.316 0.008 0.056 0.527 ＜0.001 －0.031 －0.275 0.003 Total PCS 0.704 0.683 ＜0.001 0.055 0.609 ＜0.001 Free IS 5.920 0.631 ＜0.001 －6.870 －0.638 ＜0.001 0.682 0.702 ＜0.001 Free PCS 0.772 0.972 ＜0.001 －0.305 －0.382 ＜0.001 Peritoneal Kt/V 0.451 0.141 0.023 Total Ccr －0.086 －0.220 0.006 TP 0.369 0.275 ＜0.001 Take the variables that P < 0.3 in the simple linear regression analysis as candidates, multivariable linear regression analysis has been done. Then we adopted stepwise regression, taking P < 0.05 as inclusion criteria and P>0.10 as exclusion criteria. β: Unstandardized coefficients; β’: Standardized coefficients. IS: Indoxyl sulfate; PCS: p-Cresyl sulfate; Kt/V: Urea clearance index; Ccr: Creatinine clearance rate; TP: Total protein

表 6 以血清IS和PCS为因变量的多元线性回归分析 Tab 6 Multivariable linear regression analysis of serum IS and PCS as dependent variables

肾脏病患者机体内的代谢废物不能经尿液正常清除而在体内潴留，潴留的成分中引起尿毒症症状的物质称为尿毒症毒素。根据分子的大小及物理化学性质可将尿毒症毒素分为3类^[4]：(1)小分子水溶性毒素如肌酐、尿素等，相对分子质量＜500，透析时容易被清除；(2)中分子毒素如β2-微球蛋白、瘦素等，相对分子质量≥500，部分可以通过腹膜透析和高通量血液透析清除；(3)PBT，大部分为与蛋白结合的小分子毒素如IS、PCS等，由于和蛋白结合率高，难以通过传统透析清除。随着研究的深入以及实验技术的发展，越来越多的研究表明PBT直接或间接地对心、脑、肾等重要脏器造成严重损害^[1-2]。PBT通过影响血管内皮功能^[5]、增强氧化应激反应^[6]，促进血管平滑肌细胞增殖，诱导肌成纤维细胞转化为成骨细胞，导致大动脉血管增厚和钙化^[7]。此外，PBT还可加速肾脏纤维化，影响骨矿物质代谢，产生胰岛素抵抗等一系列危害^[8]。PD缓慢持续的清除作用在保护残余肾功能、提高患者生活质量方面优势明显。本研究主要证实PD患者血清IS、PCS浓度较健康人群升高，并对其影响因素进行分析。

食物中的色氨酸、酪氨酸和苯丙氨酸等经肠道细菌的代谢产生吲哚和对甲酚^[9-10]，在肠道上皮或者肝脏中硫酸化，成为IS和PCS。肾功能正常时，IS和PCS从肾脏排泄。患者肾功能受损时，PD并不能有效清除体内IS和PCS，导致其在体内蓄积，因此PD患者血清IS和PCS水平远高于健康志愿者。比较残肾功能在清除PBT中的作用，结果显示无残肾功能患者血清IS浓度较有残肾功能患者升高，提示残肾功能对降低血清IS浓度起到重要作用。有研究证实高浓度血清IS可加速残肾功能的丢失^[9]，而残肾功能丢失进一步提高血清IS浓度，两者呈相互促进的恶性循环，导致患者预后不良。降低血清PBT有可能延缓肾功能的丧失，对于PD患者意义重大。

研究报道eGFR为4 mL/(min·1.73 m²)的PD患者，残肾PCS清除率占总PCS清除率的2/3以上^[11]。理论上随着残肾功能下降，残肾对PCS清除率降低，血清PCS水平随之上升，然而本研究中血清PCS浓度在有或无残肾功能患者中并无明显差异。Lee等^[12]的研究获得相似的结果，即无残肾功能和有残肾功能的PD患者血PCS浓度无明显差异，但是作者并未对此现象进行讨论。Pham等^[13]也曾有类似报道，无尿的PD患者PCS清除率虽然下降，但患者血液中PCS浓度却未见明显上升，作者猜想可能与无尿患者肠道内的对甲酚产生减少有关，也有可能是机体存在某种调节或者平衡机制抑制了PCS浓度的增加。我们猜想此现象可能与PCS浓度升高后抑制肠道上皮吸收并硫酸化对甲酚有关，但具体原因还有待进一步探索。

本研究发现血清总IS与游离IS、血清总PCS与游离PCS密切相关，游离IS和PCS约占总IS和PCS的10%，与之前研究^[12-14]结果相似。

当白蛋白浓度升高时，与白蛋白结合的IS浓度可能也随之升高，所以总IS浓度与白蛋白浓度呈正相关；另一方面由于IS是由蛋白中的氨基酸在肠道内代谢产生，当患者膳食摄入蛋白含量增加时，血液中白蛋白和IS水平可能同时升高^[15]；PD患者随着残肾功能减退尿中蛋白漏出可能减少，与此同时，残肾对IS清除率也减少^[14]，从而导致白蛋白与IS呈正相关。以上猜测认为白蛋白可能是血清总IS的独立影响因素，但具体机制仍需进一步研究。值得注意的是，白蛋白浓度与IS浓度对于患者预后的意义相反^[16]，两者之间是否有某个平衡点可使患者获益最大目前仍不清楚。

本实验中血清总IS与血肌酐呈正相关，而与残肾Kt/V、残肾Ccr、残肾eGFR、24 h尿量呈负相关，说明残肾功能对于降低血清IS意义重大。而血清总PCS与腹透充分性及残肾功能并未显示相关，猜想可能有以下几个原因：(1)由于PCS前体对甲酚是由肠道上皮吸收并进行硫酸化，当残肾功能丧失时，可能通过抑制肠道硫酸化对甲酚或吸收入血抑制PCS浓度升高；(2)IS和PCS在血液中竞争性结合白蛋白，当IS持续升高时抑制了PCS与蛋白结合，两者之间可能存在某种平衡。游离IS由于相对分子质量小，可通过腹膜清除^[17]，因此游离IS与腹膜Kt/V呈正相关。IS和PCS与年龄、性别、血红蛋白、CRP等未显示明显的相关性。

综上，PD患者的血清IS和PCS较健康志愿者升高，差异均有统计学意义。PD患者血清IS水平与患者残肾功能呈负相关，而与年龄、性别和CRP无明显相关性，提示保护残肾功能有利于PD患者清除血清中的IS。