第二军医大学学报  2017, Vol. 38 Issue (10): 1336-1339   PDF    
引用本文
李叶阔, 段琬璐, 唐家伟, 何晶玲, 严飞, 郑海荣. 载IR-780与多柔比星温敏脂质体的制备与表征[J]. 第二军医大学学报, 2017, 38(10): 1336-1339  
LI Ye-kuo, DUAN Wan-lu, TANG Jia-wei, HE Jing-ling, YAN Fei, ZHENG Hai-rong. Preparation and characterization of thermo-sensitive liposomes loaded with IR-780 and doxorubicin[J]. Academic Journal of Second Military Medical University, 2017, 38(10): 1336-1339 (in Chinese with English abstract)  
载IR-780与多柔比星温敏脂质体的制备与表征
李叶阔1, 段琬璐1, 唐家伟1, 何晶玲1, 严飞2, 郑海荣2     
1. 广州军区广州总医院超声科, 广州 510010;
2. 中国科学院深圳先进技术研究院, 深圳 518055
收稿日期: 2017-03-18    接受日期: 2017-06-27
基金项目: 广东省自然科学基金（2016A030313611），广东省科技计划项目（2014A020212255），全军医学科研"十二五"计划课题（CWS12J076）.
作者简介: 李叶阔, 博士, 副主任医师
通信作者(Corresponding author): 李叶阔, Tel:020-88653681, E-mail:yekuoli@163.com
摘要: 目的 制备同时包封IR-780和多柔比星（DOX）的温敏脂质体并进行表征。方法 采用薄膜水化法及硫酸铵梯度法制备载IR-780和DOX温敏脂质体（DOX-IR-780 thermo-sensitive liposome，DITSL）。采用Malvern激光粒度仪检测各脂质体的粒径、表面电位及多分散系数（PDI）；采用激光诱导DITSL升温释药，检测各脂质体的释药特性。结果 IR-780和DOX同时被包封于温敏脂质体，成功制备得DITSL。IR-780和DOX的包封率分别为（94.47±8.57）%、（92.52±7.61）%；平均粒径（138.98±8.74）nm；略带负电位；PDI为0.32±0.02。激光0.8 W/cm2照射5 min，温度最高升到54.2℃，DOX释药率达80.1%。结论 DITSL具有药物包封率较高、粒径大小适宜、光热转化效率高、温度敏感性好的优点，并可通过激光控制释药，为下一步光热-化疗联合治疗肿瘤的研究奠定了基础。
关键词: 温敏脂质体     多柔比星     IR-780     光热疗法     药物疗法    
Preparation and characterization of thermo-sensitive liposomes loaded with IR-780 and doxorubicin
LI Ye-kuo1, DUAN Wan-lu1, TANG Jia-wei1, HE Jing-ling1, YAN Fei2, ZHENG Hai-rong2     
1. Department of Ultrasound, General Hospital of PLA Guangzhou Military Area Command, Guangzhou 510010, Guangdong, China;
2. Shenzhen Institutes of Advanced Technology, Chinese Academy of Sciences, Shenzhen 518055, Guangdong, China
Supported by Natural Science Foundation of Guangdong Province (2016A030313611), Science and Technology Planning Project of Guangdong Province (2014A020212255), and "12th Five-Year Plan" for Medical Science Research Foundation of PLA (CWS12J076).
Abstract: Objective To prepare and characterize a thermo-sensitive liposomes co-loaded with IR-780 and doxorubicin (DOX). Methods Membrane hydration method and ammonium sulfate gradient method were used to prepare IR-780/DOX thermo-sensitive liposomes (DITSL). The particle size, zeta potential and polydispersity coefficient (PDI) of liposomes were measured by Malvern laser particle size analyzer, and the drug release characteristic of DITSL induced by laser was also detected. Results DITSL loading both IR-780 and DOX was successfully prepared. The encapsulation efficiency of IR-780 and DOX was (94.47±8.57)% and (92.52±7.61)%, respectively; the average particle size was (138.98±8.74) nm, with slight negative potential; the PDI was 0.32±0.02. The drug release rate of DITSL was about 80.1% after laser radiation (0.8 W/cm2, 5 min) and the highest temperature of DITSL was 54.2℃. Conclusion The prepared DITSL has high drug encapsulation efficiency, appropriate particle size, high photo-thermal conversion efficiency, good temperature sensitivity and laser-induced thermal drug release property, which lays a foundation study for the combination treatment of tumors with photo-thermal therapy and chemotherapy.
Key words: thermo-sensitive liposomes     doxorubicin     IR-780     photo-thermal therapy     drug therapy    

肿瘤严重威胁着人类健康，目前化疗是治疗肿瘤的有效手段之一，但化疗的不良反应大且会产生一定的耐药性。光热联合化疗成为当今肿瘤治疗的热点。本课题组前期研究已验证了IR-780光热效应对小鼠乳腺癌的治疗效果[1]，然而，单纯光热效应难以彻底消灭肿瘤组织。本研究拟制备同时包封化疗药物多柔比星(doxorubicin, DOX)和光敏剂IR-780的温敏脂质体(DOX-IR-780 thermo-sensitive liposomes, DITSL)，并采用激光照射释药，以探索光热联合化疗治疗肿瘤的新途径。

1 材料和方法 1.1 主要材料与仪器

二棕榈酰磷脂酰胆碱(DPPC，美国Avanti Polar Lipids公司，纯度>99%，批号：63-89-8)，单棕榈酰磷脂酰胆碱(MPPC，美国Avanti Polar Lipids公司，纯度>99%，批号：69525-80-0)，二硬脂酰基磷脂酰乙醇胺-聚乙二醇2000(DSPE-PEG2000，美国Avanti Polar Lipids公司，纯度>99%，批号：474922-22-0)；IR-780碘化物；DOX(美国Sigma-Aldrich公司)；PBS(美国HyClone公司)。挤出仪(美国Avanti Polar Lipids公司)；Zeta粒度仪(英国Malvern公司)；激光器(由中国科学院深圳先进技术研究院医工所提供，自组装)；DMI4000B型倒置荧光显微镜、TCSSP5型激光共聚焦显微镜、RM2255型石蜡切片机(德国Leica公司)；BSA223S型电子天平(赛多利斯科学仪器北京有限公司)；Ti27型红外热像仪(美国Fluke公司)；LS55型荧光光谱仪、Lambda35型紫外-可见光光谱仪(美国PerkinElmer公司)；FLS920型荧光分光光度计(英国Edinburgh Industries公司)。

1.2 DITSL的制备

取DPPC、MPPC、DSPE-PEG2000(物质的量之比为86:10:4)与IR-780(IR-780:脂质=5:100，质量比)混溶于氯仿，边涡旋边氮气吹干成均匀薄膜，真空3 h抽去残留氯仿。加入250 mmol/L (NH4)2SO4溶液溶解脂质薄膜，在65 ℃水浴中超声振荡至澄清，制成IR-780脂质体(ITSL)。将ITSL用挤出仪从200 nm聚碳酸酯膜中反复挤出，制备成粒径均匀的ITSL。将ITSL装于透析袋中，放入PBS中透析4 h。将DOX溶液(1 mg/mL)逐滴加入ITSL中，边加边振荡，利用硫酸铵梯度法将DOX载入ITSL内核制备得DITSL。载DOX脂质体(DTSL)在成膜过程中只加入磷脂，其余制作方法如DITSL。使用Zeta粒度仪在室温下测粒径大小、粒径分布、多分散指数(PDI)和表面电位，用紫外-可见光光谱仪检测各脂质体的吸收光谱。

1.3 IR-780和DOX包封率的检测

使用荧光分光光度计测得IR-780和DOX的荧光值-浓度标准曲线。将制备好的各脂质体放入超滤管，通过超速离心法(11 200×g，30 min)分离脂质体和游离的药物，荧光分光光度计结合IR-780和DOX的荧光值-浓度标准曲线检测包封在脂质体内部的药物浓度，计算包封率。包封率(%)=(包封的药物量)/(初始加入量)×100%。

1.4 激光诱导的体外升温

分别取PBS、DTSL(DOX 15 μg/mL)、ITSL(IR-780 15 μg/mL)以及DITSL(IR-780 15 μg/mL, DOX 15 μg/mL)各1 mL加入小试管中。用近红外激光(808 nm，0.8 W/cm2)对每个样本照射5 min，每隔30 s用红外热像仪测量各脂质体溶液的温度并记录。

1.5 激光诱导DITSL药物释放

取DITSL和DTSL分别置入含90%血清的PBS中, 用近红外激光(808 nm，0.8 W/cm2)分别照射20 s、40 s、1 min、2 min、3 min、4 min、5 min，检测辐照不同时间两种脂质体的DOX释放情况，同时设无激光辐照为对照，检测相同时间点DITSL的DOX释放量。

1.6 统计学处理

应用SPSS 19.0软件行数据分析。所有数据均以x±s表示，两样本间比较采用t检验，多样本比较采用单因素方差分析，检验水准(α)为0.05。

2 结果 2.1 DITSL的构建

各脂质体的光学特性如图 1所示。ITSL在793 nm处有最大吸收峰，DTSL在492 nm处有最大吸收峰，DITSL在793 nm和492 nm均有显著吸收峰，表明DITSL成功构建。

图 1 载药脂质体的紫外-可见光光谱图 DITSL:载IR-780和多柔比星(DOX)温敏脂质体; ITSL:载IR-780温敏脂质体; DTSL:载DOX温敏脂质体

2.2 DITSL表征

各脂质体的粒径分布如图 2所示，载单药脂质体平均粒径均小于100 nm，而DITSL平均粒径为139 nm左右。各脂质体的药物包封率均高于90%，提示温敏脂质体是良好的载药工具。DITSL粒径大小、PDI、zeta电位及包封率见表 1。

图 2 载药脂质体的粒径分布 DITSL:载IR-780和多柔比星(DOX)温敏脂质体; ITSL:载IR-780温敏脂质体; DTSL:载DOX温敏脂质体

表 1 各脂质体的性质表征

2.3 红外热像仪显示结果

0.8 W/cm2激光照射5 min后，DITSL、ITSL、DTSL和PBS组的最高温度分别为54.2、54.1、34.1、33.7 ℃(图 3)，各组在激光照射前的起始温度均为24.4 ℃。ITSL和DITSL组的温度升高一段时间后开始缓慢下降。单因素方差分析结果显示各组间差异有统计学意义(F=1 764.08，P < 0.05)；多重比较结果显示，PBS和DTSL组为同类子集(P>0.05)，ITSL和DITSL组为同类子集(P>0.05)，两子集间比较差异有统计学意义(P < 0.05)。

图 3 DITSL、ITSL和DTSL在808 nm激光辐照下的光热升温效应和红外热像图 DITSL:载IR-780和多柔比星(DOX)温敏脂质体; ITSL:载IR-780温敏脂质体; DTSL:载DOX温敏脂质体. PBS组和DTSL组与ITSL组和DITSL组比较，P < 0.05

2.4 激光诱导DITSL的药物释放特性

DITSL释药率随激光辐照时间延长而增加，照射1 min后达56.0%，照射5 min后达80.1%(图 4)。无激光辐照DITSL的药物释放率较低，5 min后约为8.9%。DTSL在激光辐照下的药物释放率与DITSL无激光情况相仿，5 min后的药物释放率约为11.2%。单因素方差分析结果显示各组间差异有统计学意义(F=490.30，P < 0.05)；多重比较结果显示，DTSL+激光组和DITSL组为同类子集(P>0.05)，DITSL+激光组与这两组比较差异均有统计学意义(P < 0.05)。

图 4 激光照射下DITSL中多柔比星(DOX)累计释放情况 DITSL:载DOX/IR-780温敏脂质体; ITSL:载IR-780温敏脂质体; DTSL:载DOX温敏脂质体. DITSL+激光组与DTSL+激光组和DITSL组比较，P < 0.05. n=5, x±s

3 讨论

温度敏感脂质体是壳膜由双分子层脂质组成(主要是磷脂和胆固醇)、内部为水相的闭合囊泡，壳膜磷脂的疏水尾部相对，具有典型的双亲分子特性[2-5]。其包封范围广泛，亲水性药物、两性药物和疏水性药物均可被包封[6-8]，且可在一定温度作用下释放包封的药物。因此，本研究采用温敏脂质体作为运载亲水性药物DOX和脂溶性光敏剂IR-780的载体，并利用IR-780的光热效应，采用激光激发升温释药。紫外-可见分光光度计检测结果表明ITSL在793 nm处有最大吸收峰，符合IR-780的吸收特征; DTSL在492 nm处有最大吸收，与DOX吸收峰相似; DITSL同时在793 nm和492 nm有显著吸收峰，表明亲水性的DOX和疏水性的IR-780被同时包封于脂质体内，DITSL构建成功。本研究制备的DITSL平均粒径为(138.98±8.74) nm，略带负电荷，PDI为0.32±0.02，说明粒径分布均匀，IR-780和DOX的包封率均高达90%以上。红外热像仪检测结果证实0.8 W/cm2激光照射5 min时，DITSL和ITSL最高温度分别升到54.2 ℃和54.1 ℃，而DTSL和PBS组的升高幅度低于DITSL和ITSL组。缺乏光热制剂时激光不能有效地转化成热能，因此DTSL和PBS组只有轻微的温度升高，而DITSL和ITSL组由于IR-780的存在温度明显升高，但升高一段时间后会缓慢下降，推测其原因可能是IR-780在光照一段时间后发生了分子之间的自猝灭。

本研究结果显示0.8 W/cm2激光照射1 min后DITSL的释药率达到56.0%，照射5 min时释药率约80.1%。而DTSL中由于不含IR-780，光热转换效率低，在激光辐照下的释药率与DITSL无激光情况相仿，5 min后的释药率约为11.2%；无激光辐照DITSL 5 min后的释药率也仅为8.9%。表明IR-780在激光作用下升温，温敏脂质体双分子膜由“凝胶”态转变到“液晶”态结构，膜的流动性增大，膜变薄，脂质体表面出现裂孔，导致包封药物的迅速释放[9]。

综上所述，本研究制备的DITSL可同时包封IR-780和DOX，包封率高、理化性质良好，并能在激光照射下高效释药，未来我们将开展细胞水平实验和动物实验研究其对肿瘤治疗的效果。

参考文献
[1] 周群芳, 段琬璐, 黎国峰, 严飞, 刘锐洪, 李叶阔. IR-780光热治疗小鼠乳腺癌移植瘤的初步研究[J]. 临床肿瘤学杂志, 2015, 22: 303–306.
[2] LEE B K, YUN Y H, PARK K. Smart nanoparticles for drug delivery:boundaries and opportunities[J]. Chem Eng Sci, 2015, 24: 158–164.
[3] QIU Y, GUO L, ZHANG S, XU B, GAO Y, HU Y, et al. DNA-based vaccination against hepatitis B virus using dissolving microneedle arrays adjuvanted by cationic liposomes and CpG ODN[J]. Drug Deliv, 2016, 23: 2391–2398.
[4] SCHWENDENER R A, SCHOTT H. Liposome formulations of hydrophobic drugs[J]. Methods Mol Biol, 2010, 605: 129–138. DOI: 10.1007/978-1-60327-360-2
[5] VENKATAHARSHA P, MAHESHWARA E, RAJU Y P, REDDY V A, RAYADU B S, KARISETTY B. Liposomal Aloe vera trans-emulgel drug delivery of naproxen and nimesulide:a study[J]. Int J Pharm Investig, 2015, 5: 28–34. DOI: 10.4103/2230-973X.147230
[6] WU H, YAO L, MEI J, LI F. Development of synthetic of peptide-functionalized liposome for enhanced targeted ovarian carcinoma therapy[J]. Int J Clin Exp Med, 2014, 7: 4809–4818.
[7] THAMPHIWATANA S, GAO W, PORNPATTANANANGKUL D. Phospholipase A2-responsive antibiotic delivery via nanoparticle-stabilized liposomes for the treatment of bacterial infection[J]. J Mater Chem B Mater Biol Med, 2014, 2: 8201–8207. DOI: 10.1039/C4TB01110D
[8] YU T, CHAN K W, ANONUEVO A, SONG X, SCHUSTER B S, CHATTOPADHYAY S, et al. Liposome-based mucus-penetrating particles (MPP) for mucosal theranostics:demonstration of diamagnetic chemical exchange saturation transfer (diaCEST) magnetic resonance imaging (MRI)[J]. Nanomedicine, 2015, 11: 401–405. DOI: 10.1016/j.nano.2014.09.019
[9] ANDERSON V C, THOMPSON D H. Triggered release of hydrophilic agents from plasmalogen liposomes using visible light or acid[J]. Biochim Biophys Acta, 1992, 1109: 33–42. DOI: 10.1016/0005-2736(92)90183-M