2016, Vol. 37
海洋生物毒素是研究进展最为迅速的海洋生物活性物质，绝大部分海洋生物毒素仅为海洋生物特有，在陆生动物中极为罕见。海洋生物毒素对受体作用具有高选择性和高亲和性，通常特异作用于神经和肌肉，可兴奋细胞膜的关键靶点，如神经系统受体或离子通道，从而影响与受体有关的一系列细胞调控活动。海洋生物毒素有多种不同的分类方法。依据化学结构，可分为多肽类毒素、聚醚类毒素、生物碱类毒素等；根据最初分离得到的来源，可分为河鲀毒素(tetrodotoxin, TTX)、西加鱼毒素(ciguatoxin, GTX)、芋螺毒素(conotoxin, CTX)等；在与人类饮食密切相关的贝类毒素中，根据毒性作用机制可将海洋毒素分为腹泻性贝毒(diarrhetic shellfish poisoning, DSP)、麻痹性贝毒(paralytic shellfish poisoning, PSP)、神经性贝毒(neurotoxic shellfish poisoning, NSP)和失忆性贝毒(amnesic shellfish poisoning, ASP)等[1]。
由于海洋生物毒素具有分布广、毒性强及解毒难等特性，美、日等国在第二次世界大战之前就对以海洋有毒鱼类为主的海洋生物毒素进行了广泛的调查研究，获得了大量资料；禁止化学武器组织也将部分海洋生物毒素如石房蛤毒素(saxitoxin, STX)列入禁止化学品的第一类清单中；尽管目前全世界大部分国家已经签署了《禁止化学武器公约》，但随着世界多极化格局的发展，在复杂的国际环境下，恐怖分子利用海洋生物毒素的威胁是明显存在的[2]。此外，近年来海洋污染日趋严重，有害赤潮频发，直接影响了海洋产品的食用安全，存在极大的安全隐患。基于上述背景，近年来针对海洋生物毒素检测的研究进展迅猛。传统海洋生物毒素的检测方法是生物检测法，随着研究者对海洋生物毒素作用机制认识的逐渐深入，不断有新的检测方法被开发出来。本文将对海洋生物毒素检测技术的相关研究进行综述。
1 生物检测法生物检测法主要采用小鼠生物检测法(mouse bioassay, MBA)。该方法由美国分析化学家协会(Association of Official Analytical Chemists, AOAC)于1980年进行了标准化，是最早用于海洋生物毒素检测的一种经典方法，其原理是将毒素注射入小鼠体内，根据注射后小鼠的存活时间和中毒症状来评价毒性，通常用鼠单位(mouse unit, MU)来表示。目前我国贝类毒素的测定标准中，MBA仍然占有较大比例，如国家标准《GB/T 5009.212-2008贝类中腹泻性贝类毒素的测定》和《GB/T 5009.213-2008贝类中麻痹性贝类毒素的测定》，行业标准《SC/T 3023-2004麻痹性贝类毒素的测定生物法》《SC/T 3024-2004腹泻性贝类毒素的测定生物法》《SN/T 1573-2005贝类中神经性贝类毒素检验方法小鼠生物法》等。该方法的优势在于不需要复杂的设备、有历史数据、应用广泛[3]，但也存在一定缺点与不足：只能测出毒性的大小，无法确知其组成及含量；所测得的毒性和小鼠的品系、状态、体质量等有关，不确定因素多；毒性测定结果重复性差[4]。同时由于每年有大量小鼠被用于贝类毒素的日常检验，在学术界已引起伦理学的争论[5]。
2 免疫分析法免疫分析法是基于抗体与抗原或半抗原之间的高选择性反应而建立起来的一种生物化学分析法，即根据抗原-抗体反应，采用特异性抗体来检测药物、激素、蛋白质、微生物等物质的定量分析方法。免疫分析法主要包括酶联免疫法(enzyme-linked immunosorbent assay, ELISA)、放射性免疫法、荧光免疫法等，具有方便、快速的特点，但也存在一定的缺点，如费用较高、毒素之间的交叉反应难避免、实验结果重现性较差等。
ELISA是检测海洋生物毒素所采用的主要免疫方法。该技术可用目测，也可用酶标仪测定光密度值，具有易定性定量的优点[6]。Tsao等[7]采用单克隆抗体ELISA检测法检测ASP中的软骨藻酸(domoic acid, DA)，并建立了基于单克隆抗体的胶体金免疫条检测法；该方法的检测限为5 ng/mL，在10 min内就可完成测定，提示免疫条检测可用来快速检测贝类样品中的DA。也有研究者建立了基于基因工程单链抗体竞争ELISA检测方法，该方法最大的优势是毒素可在大肠杆菌中快速、大量得到表达，且容易和其他小分子融合，形成融合蛋白以用于检测或其他用途；对该方法进行验证发现，其与标准高效液相色谱法(high-performance liquid chromatography, HPLC)检测结果有较好的相关性[8]。李军涛等[9]建立DSP免疫荧光层析试纸条检测方法，灵敏度可达0.125 μg/mL，达到我国贝类产品中DSP所允许的限量。Dubois等[10]建立了间接竞争ELISA方法检测STX，该方法用毒素的偶联物免疫产生的抗体来检测贻贝、牡蛎和扇贝中的STX类毒素；在检测之前，用90%的乙醇溶液将STX类毒素从贝类组织里快速提取出来，该方法的最低检测限为5 μg/kg。Garthwaite等[11]也建立了4类贝毒的ELISA方法，均可满足贝类提取物中样品的鉴定，且样品回收率较高。TTX为氨基全氢喹唑啉型化合物，是自然界中所发现的毒性最大的神经毒素之一[12]。Thattiyaphong等[13]建立了一种侧流免疫层析技术来实现TTX的快速检测，并运用该方法检测了河鲀及食用鱼中TTX的含量；与液相色谱-串联质谱法(liquid chromatography-tandem mass spectrometry，LC-MS/MS)相比，该方法的灵敏度为94.0%，特异性为92.4%。总的来说，侧流免疫层析技术可用于大批量样本的筛选，阳性结果的样本再使用LC-MS/MS进行确认，减少了LC-MS/MS的测试量，降低了检测成本。Reverte等[14]开发了一种基于双硫醇自组装单分子膜的新ELISA方法，该方法可用于检测河鲀中TTX的含量，检测限为0.23 mg/kg，其与LC-MS/MS法的相关性为0.991。
大田软海绵酸(okadaic acid, OA)是DSP中的主要成分，属于聚醚类海洋生物毒素，尚无致死病例，但长期摄入可以致畸及致癌[15]。刘仁沿等[16]通过细胞融合，制备抗OA单克隆抗体和胶体金标记抗体，建立快速检测OA的免疫层析试纸条分析方法，该方法检出限为500 ng/mL。该研究组在此基础上进行改进，使用卵清蛋白合成高耦联比的包被抗原，以硝酸纤维素膜为载体，改进后方法检测限达12 ng/mL[17]。张洋等[18]采用自行研发的免疫胶体金试纸条对双贝壳类DSP的主要成分OA的污染情况进行调查，通过与ELISA检测法的结果进行比较，发现该方法检测结果准确可靠，未出现假阳性结果。Johnson等[19]对4种已经商业化的快速检测试剂盒是否可检测英国双壳贝类中的DSP进行验证。这4种试剂盒包括1种ELISA试剂盒、1种蛋白磷酸酶2A(protein phosphatase 2A，PP2A)试剂盒以及2种侧流免疫测定(lateral flow immunoassay, LFI)试剂盒。实验结果表明，ELISA与LC-MS/MS具有较好的相关性，且不存在结果偏大的情况，但是存在假阴性结果；2种LFI试剂盒与LC-MS/MS检测结果大部分具有一致性，但存在假阴性结果。总的来说，选择何种方法去检测DSP主要取决于检测要求、实验室的条件、实验人员是否经过训练以及对结果的要求是半定量的还是定性的。
Jellett快速检测试纸条(Jellett rapid test strip, JRT)是一种现场检测PSP的有效手段，该方法是通过样品中的PSP与结合到检测线上的毒素竞争结合标记的抗STX抗体来实现。为了达到敏感度水平，试纸条上添加的抗体总量是一定的，随着样品中毒素浓度的增加检测线逐渐消失。该方法的检测限与MBA相似，同时与MBA有很好的相关性[20]。Costa等[21]将JRT与其他PSP检测法进行比较，结果表明，HPLC适用于每一种PSP的检测，但是HPLC耗时较长、仪器要求高以及需要一定专业知识的技术人员。JRT和受体结合分析法都是基于抗体的检测方法。JRT是实现快速筛查的一种有效手段，但是由于该检测方法假阳性率较高，在该方法检测出阳性结果之后有必要再使用HPLC进一步确认，从而避免不必要的误报；受体结合分析法也可实现高通量筛查PSP且未发现假阳性结果，但是该方法需要放射性材料因而限制了其使用；ELISA无法检测阿留申岛贝类中的PSP，可能是由于阿留申岛贝类PSP衍生物较多，而ELISA法更适合毒素衍生物成分较少的贝类检测。从日常大批量检测的角度考虑，JRT可用于现场初步筛查，接着使用受体结合分析法和HPLC检测结果进行确认。
适配体(aptamer)是单链或双链DNA或RNA，是基于指数富集的配体系统进化技术(systematic evolution of ligands by exponential enrichment, SELEX)，从随机寡核苷酸库中通过多轮循环筛选所富集获得[22]。筛选过程就是利用不同核酸序列，形成特异空间构象，通过分子间的密切适应，得到与靶分子强特异性、高亲和力结合的特异核酸分子，即适配体。与经典抗体相比，适配体具有明显的特性。现在报道的适配体靶分子既有蛋白质等生物大分子，又有燃料、金属离子、药物、氨基酸等小分子，甚至还有病毒、孢子、完整细胞等。因此，基于适配体可以建立各种生物毒素的检测技术[23]。2013年美国FDA的研究人员报道通过SELEX筛选出了特异结合STX的适配体[24]。焦炳华教授课题组[25]利用STX ELISA试剂盒(Abraxis LLC, 产品编号: 52255B)，在优化的适配体与STX结合缓冲液中分析适配体与STX的结合情况。结果发现：适配体与试剂盒中的标准STX和酶标的STX都能特异结合，并呈剂量依赖关系；适配体能阻断STX的溶红细胞作用，还能抑制STX对藜芦定和哇巴因激活的钠离子通道的阻断作用，以及延长STX对小鼠的毒性等。利用生物膜干涉技术测定亲和常数，发现适配体的Kd值为7.44 μmol/L，通过优化适配体的序列和结构，一条预测能形成G四联体的序列Kd值为128 nmol/L，由此得到了一条与STX亲和力提高了40倍的新适配体[25]。该课题组还验证了OA适配体OA34也能与OA特异结合，并拟进一步筛选包括游离GTX、TTX以及与磁珠定向耦合的GTX、BTX等毒素的适配体[23]。2015年，该课题组[26]基于SELEX开发了一条新的STX适配体M-30f，该适配体的Kd值为133 nmol/L，与之前Handy研究组[24]报道的STX适配体APTSTX1相比，亲和力提高了30倍，有较好的应用前景。
3 酶活力抑制分析法PP2A酶是主要的丝/苏氨酸蛋白磷酸酶，作用于磷酸酶的α亚单位，广泛存在于生物的细胞组织中，占细胞总蛋白质的0.05%~0.25%。DSP能够高效抑制PP2A酶的活性，造成细胞内磷酸化蛋白的急剧增加，从而改变肠细胞钠的分泌和细胞膜的通透性，导致腹泻。因此可以利用该类毒素抑制PP2A酶活力的特性，选择一种在酶催化反应后能产生荧光产物的物质作为底物，依据酶反应过程中产物产生的速率来指示酶活力受抑制的程度，进而计算抑制剂的浓度。
Ikehara研究组[27]利用杆状病毒表达系统，通过遗传工程技术合成了人重组PP2A催化亚基(recombinant catalytic subunit of human PP2A, rhPP2Ac)，并定量检测了水中微囊藻素的含量[28]。2010年，该课题组又采用PP2A酶抑制法检测了扇贝和贻贝中的OA含量[29]，结果显示该方法检测扇贝和贻贝中OA的检测限为0.034 8 μg/g和0.061 1 μg/g，低于欧盟标准(0.16 μg/g)，且PP2A酶抑制法与LC-MS结果有较好的相关性。孙海燕等[30]基于DSP抑制PP2A酶活性的原理构建了固定化PP2A酶生物传感器并对时间、pH和温度等影响电流响应的参数进行了优化，以构建的传感器对OA进行检测，采取4参数logistic曲线法进行标准曲线拟合，曲线的R2值达0.994 7，拟合度较好，OA的检测限为10.07 μg/L，组间RSD为8.3%，在4℃放置7 d后，其响应电流为初始电流的87%，与HPLC检测结果相比具有较好的相关性，可用于OA的快速检测。李爱峰等[31]利用PP2A酶活力法检测了3个牡蛎样本中的OA含量，实验结果表明样本中不含OA和鳍藻毒素(dinophysistoxin, DTX)，但水解后可检出OA毒性，其中2个牡蛎水解样品的毒性当量分别为1.81和1.21 μg/kg贝组织。Prassopoulou等[32]的实验结果也表明，PP2A酶活力抑制分析法检测结果与HPLC-荧光检测法(fluorimetric detection, FLD)的结果有较好的相关性。有研究者将PP2A酶活力测试试剂盒与其他3种商业化的快速检测试剂盒包括1种ELISA试剂盒以及2种LFI试剂盒进行了比较，实验结果表明，PP2A试剂盒是唯一没有假阴性结果的方法，且与LC-MS/MS结果相关性较好，缺点是检测出来的毒性偏大[19]。
4 细胞毒性试验PSP类毒素具有钠离子通道阻滞剂的特性，可拮抗箭毒、藜芦碱的作用，减少细胞形态的改变及细胞裂解死亡，拮抗作用与PSP类毒素的量呈剂量反应关系。细胞毒性试验即利用PSP的钠离子通道阻滞剂的特性，使用钠离子通道激活剂箭毒、藜芦碱协同开放成神经细胞瘤细胞钠离子通道，通过检测细胞的死亡情况来判断PSP类毒素的毒性。早期方法是用显微镜计数活细胞数以检测PSP类毒素的量，检测时间长，操作烦琐。20世纪90年代初，研究者对此方法进行改进，应用结晶紫对细胞进行染色，用酶标仪进行测定。该方法实现了检测的自动化，可批量检测样品，但需要对细胞染色，多次洗板，并固定、干燥、裂解细胞，仍存在操作烦琐的缺点[33]。后来，研究者们对该方法进一步改进，用四甲基偶氮唑盐(MTT)代替结晶紫。该方法操作简便、操作时间短、方法易掌握，不仅可检测PSP类毒素，还可以检测钠离子通道激活剂NSP和GTX等，检测限分别为0.25 ng/mL和0.01 ng/mL[34]。陈洋[35]用小鼠皮肤细胞、人肝细胞、人肝癌细胞和小鼠神经瘤细胞作为受试细胞对DSP的重要组分OA和其他几种成分进行MTT比色细胞毒性试验，结果表明，OA对这4种细胞的增殖呈显著抑制作用，且抑制作用与毒剂剂量呈正相关。
研究者们还发现细胞生物传感器可动态、实时监测细胞的新陈代谢以及细胞的激活与阻滞。2015年，Zou等[36]开发了一种可检测PSP的细胞生物传感器，该传感器是基于成神经瘤细胞，检测限为0.03 ng/mL，较之前的检测方法，其在灵敏度和选择性上皆有大幅提高。2016年，Zou等[37]在前期研究基础上，设计了基于HeLa细胞和HepG2细胞的生物传感器，该传感器可检测DSP代表毒素OA，检测限分别为10.2 μg/L和3.3 μg/L，灵敏度远高于传统的细胞测试法(HeLa细胞检测限为21.2 μg/L、HepG2细胞检测限为9.8 μg/L)。
5 HPLC生物分析法注重的是样品的毒性，在专一性和灵敏性方面存在一定的不足。化学分析方法一般以液相色谱分离原样或净提取物为基础，然后用物理化学方法进行特异性毒素检测。HPLC是目前检测海洋生物毒素最常见的化学分析方法之一，已被包括中国在内的多个国家列为国家标准方法。HPLC具有灵敏、准确、可靠、能确定各种毒素成分、使用广泛、易校正、所需检测的样品量少等优点。近年来随着色谱-质谱联用技术的飞速发展，HPLC-MS及HPLC-MS/MS已经成为毒素分析的一种主流技术。HPLC-MS联用技术可以不使用毒素标准品和衍生试剂，相比其他检测器具有很大的优势。
罗璇等[38]建立了可用于微量DSP分析的HPLC-MS联用技术，并首次报道了我国近海渐尖鳍藻产毒状况，在渐尖鳍藻样品中检测到了OA、DTX和扇贝毒素2(pectenotoxin 2, PTX2)等毒素成分，含量分别为2.54、4.04和1.73 pg/cell。于慧娟等[39]建立了HPLC-MS检测方法，并以虾夷扇贝和菲律宾蛤仔为测试对象，对方法的有效性进行了评价。结果显示，STX、脱酰基甲酸石房蛤毒素(decarbamoyl saxitoxin, dcSTX)和新石房蛤毒素(neosaxitoxin, neoSTX)检测限为100 μg/kg，GTX1~GTX5、脱酰基甲酸西加毒素2(decarbamoyl ciguatoxin 2, dcGTX2)和dcGTX3检测限为50 μg/kg。
2014年，曹文卿等[40]采用HPLC-MS/MS方法进行了河鲀鱼肝脏中TTX含量的快速检测研究。研究结果表明，该方法检测限为40 μg/kg，在50~1 000 μg/kg范围内线性关系良好。该研究组还建立了QuEChERS/LC-MS方法[41]，该方法也可实现快速检测红鳍东方鲀肉中TTX的含量，采用外标法基质标准曲线定量方法的检出限为10 μg/kg，检测限为30 μg/kg。为了能更好地完成日常监测DA和脂类海洋毒素的任务，McCarron等[42]在采用液相色谱与混合三重四极杆离子肼质谱仪联用技术的同时，还引入了选择反应监测技术和数据相关采集扫描功能，分析了DA、OA、DTX、PTX、原多甲藻酸贝类毒素、虾夷扇贝毒素等海洋毒素。实验结果表明，该方法的检测限、灵敏度、可信度均较好。2015年，李军等[43]建立了快速、准确检测红鳍东方鲀中TTX的HPLC-MS/MS的分析方法，选择正离子多反应监测(MRM)模式进行HPLC-MS/MS测定，外标法定量。结果表明，该方法检测TTX在5~100 ng/mL范围内呈良好的线性关系，检测限为5 ng/mL，适用于检测红鳍东方鲀中的TTX。王丽英等[44]建立准确、快速检测TTX的超高效液相色谱-串联质谱的分析方法，以了解市售烤鱼片、鱿鱼干制品和鱼丸中TTX的污染状况。结果市售的107份样品中，鱿鱼干制品和鱼丸中没有检出TTX；64份烤鱼片样品中检出16份含有TTX。Tsujimura和Yamanouchi[45]建立了一种LC-MS/MS快速检测TTX的方法，该方法只需很小体积的血液就可检测出TTX，且检测限低达0.5 ng/mL。Vlamis等[46]通过超高效液相色谱-串联质谱首次检测到希腊贝类中存在TTX。
除了建立新的方法，也有研究者对已经建立的LC-MS方法进行了改进。STX和大部分衍生物都是通过LC-MS/MS进行定性和定量。传统的前处理过程一般是在溶液中加盐酸来萃取STX，Harju等[47]认为盐酸具有较强的基质抑制效应，不适合作为萃取溶剂，通过实验发现1%乙酸是最佳的STX萃取剂；研究者还尝试了很多纯化的方法，发现最合适的方法是使用乙腈沉淀。优化后的方法可定性并定量检测STX及衍生物，检测结果与HPLC-FLD法基本一致。由于LC-MS/MS样品处理过程需要旋蒸等一系列操作，耗时较长，因此临床上TTX中毒的快速诊断一直难以实现。Saito等[48]使用羧基键合相和酰胺键合相的SPE小柱提取尿液、血浆中的TTX，用10%乙酸溶液0.1 mL作为洗脱液洗脱柱子得到TTX，使用LC-MS/MS直接分析洗脱液，避免了大量烦琐的前处理步骤。美国疾控中心合成了15N4-STX，以此作为内标建立了一种在线固相萃取-LC-MS联用技术，可检测人尿液中STX和neoSTX。与之前报道的人工前处理相比，在线固相萃取节省了70%的处理时间。该方法的STX和neoSTX检测限分别为1.01 ng/mL与2.62 ng/mL[49]。
免疫亲和柱(IAC)是一种基于抗原抗体反应的新型层析柱，利用生物大分子具有对一类生物大分子特异识别和可逆结合的特性制作而成，具有独特的选择专一性和良好的吸附净化性能。严忠雍等[50]基于LC-MS的高灵敏度和精确性，利用IAC的独特选择识别性，建立了一种快速、简便、高效测定海洋生物中TTX的分析方法并应用该方法对鹰爪虾、对虾、海鳗、曼氏无针乌贼、贻贝、花蛤等共计13种样品进行了检测，其中织纹螺、花蛤、圆尾鲎样品中检出TTX，浓度依次为56.4、2.43和174 μg/kg。实验结果表明采用IAC净化、LC-MS法检测海洋生物中TTX的方法灵敏度高，精密度和回收率均能满足检测分析的要求。
HPLC-FLD也是检测海洋生物毒素常用方法，通过使用衍生剂将毒素衍生成含荧光基团的物质，用荧光检测器进行检测，在毒素分子上引入荧光基团可使检测灵敏度提高。我国检测TTX和PSP的国家标准中均有HPLC-FLD。Sayfritz等[51]通过HPLC-FLD将STX的检测限降低到89 μg/kg，可满足标准低于313 μg/kg的要求。James等[52]将DA与荧光显色剂NBD-F反应，生成荧光DA衍生物，该方法检测限为6 ng/g贝类组织。Maroulis等[53]对该方法进行了改进，用NBD-Cl替换NBD-F，结果显示改进后的方法检测限低至25 ppb。Chan等[54]对该方法预处理过程进行了改进，即在SPE柱中加入TiO2，可以更好地吸附DA，并探讨了最佳pH值。Prassopoulou等[32]采用MBA、PP2A法以及HPLC-FLD 3种方法，首次检测了希腊贻贝中OA的酯化形式，实验结果表明，3种方法的结果具有较好的相关性，其中HPLC-FLD的检测限为5.86 μg/kg。
6 毛细管电泳(capillary electrophoresis, CE)法CE是近年来发展速度最快的高效技术之一，它是一类以毛细管为分离通道、以高压直流电场为驱动力、以样品的多特征(如电荷、大小、等电点、极性、亲和行为等)为依据的液相微分离分析技术。CE是继HPLC之后的又一重大进展[55]。
CE技术最初为配有紫外检测器的毛细管胶束电动电泳。Li等[56]优化了该方法的实验条件，建立了检测OA与DTX-2的毛细管胶束电动色谱技术，该方法检测限为3.25 μg/mL。李大志等[57]通过萃取、离子交换等技术，建立了毛细管电泳/紫外检测法分析ASP的主要成分DA的方法，结果表明DA在0.2～50 mg/L时具有良好的线性关系，检出限为0.063 mg/L。利用该方法对5种经济贝类样品进行了测定，该方法简单、灵敏、高效、成本低，对DA的检测和监控具有重要意义。
Keyon等[58]将CE分别与电容耦合非接触电导(capacitively coupled contactless conductivity, C4D)、FLD、UV吸收检测和MS联用进行检测。考虑到氧化后的毒素是中性的，一般采用胶束动电毛细管色谱法(MEKC)进行海洋毒素的分离检测。Keyon等[58]比较了CZE-UV、CZE-C4D、CZE-MS和MEKC-FLD检测PSP的能力，样品中PSP含量在800 ng/mL左右，CZE-UV和CZE-MS在检测范围上不能满足PSP的检测要求，CZE-C4D和MEKC-FLD的检测可基本满足要求。CZE-C4D可在几分钟内检测出大部分样品，但是由于背景干扰过强，无法应用于PSP的检测。此外，由于CZE本身的特性使得CZE无法检测分离C1和C2毒素。MEKC-FLD可检测各种PSP样本包括C1和C2。与HPLC-FLD相比，尽管MEKC-FLD灵敏度低，但是MEKC-FLD可以直接定量检测3种毒素，而HPLC-FLD一次只能检测一种毒素。MEKC-FLD可作为一种快速大批量的筛选手段。李大禹[59]通过CE法对CTX的3个不同半胱氨酸保护策略线形肽空气氧化成单环肽进行跟踪检测，得到反应动力学数据及其方程；还通过图形工作站的构相预测软件对其结构及其单环肽进行了结构预测，得到了低能量下的构象。
7 拉曼光谱法表面增强拉曼散射(surface-enhanced Raman scattering, SERS)技术因其灵敏、快速、便携等特性，在化学恐怖物质的侦检领域逐渐受到重视。目前的便携式拉曼光谱仪一般以近红外激光为光源，仅针对样品表面做无接触、无损探测，能够提供仅与样品振动转动有关的特征性拉曼光谱，其特异性可与MS媲美，且谱峰清晰尖锐，更适合定量和数据库搜索，是突发事件应急检测的重要工具之一。
2008年，Pearman等[60]以银纳米粒子为基底进行了STX的SERS检测，其检测限为3 nmol/L，定量限为20 nmol/L，显示出SERS技术在低浓度海洋生物毒素水溶液检测中的潜力。2009年，Lin等[61]以平板印刷技术制得的尺寸、形状、形状可控的纳米阵列为基底，进行了TTX的SERS检测，检测限可达0.9 μg/L，并对SERS谱图的主要峰位进行了归属。2012年，Zhu等[62]建立了一种全新、快速、超灵敏的对微囊藻毒素LR的SERS免疫检测方法。以金纳米棒作为SERS活性基底，金纳米棒通过其上配基的免疫识别富集形成链状结构，修饰在金纳米棒上的探针分子由于金纳米棒之间的热点的SERS增强作用而被检测。利用该法，微囊藻毒素LR的线性范围为0.01~5 μg/L，最低检测限可达5 ng/L，具有较高的灵敏度，极具应用价值。
表面等离子体共振(surface plasmon resonance, SPR)与SERS均具有强烈的纳米尺寸依赖性，研究认为SERS与SPR具有一定的关联性[63]。Campbell等[64]开发了分子作用仪和SPR技术，并用来检测藻类毒素以及新毒素——海葵毒素。结果表明，由于时间限制，分子作用仪不适用于藻类毒素以及海葵毒素的检测；SPR技术可较好地检测藻类毒素以及海葵毒素，该仪器还具有GPS芯片，可完成远程样品分析。Garibo等[65]通过SPR免疫传感器检测贻贝中的OA，该方法只需少量的样本以及较短的时间就可检测出样本中的OA含量，且与LC-MS/MS结果有较好相关性；但该方法的主要缺点是灵敏度较低。Stevens等[66]建立了一个SPR生物传感器系统，该系统可检测贝类、藻类以及海水中4~60 ppb的DA。
8 结语已报道的海洋生物毒素检测技术由于检测原理不一，优缺点也各不相同(表 1)。MBA法虽然灵敏度较低且需要大量动物，但是具有可靠性强、有历史数据、仪器要求低、使用广泛等优点。此外，MBA法是检测不常见毒素和新毒素必需的方法。HPLC具有准确、灵敏、可靠、能确定各种毒素成分等优点，已成为国际标准方法，是对海洋生物毒素进行准确定性鉴别的有力工具。但是该方法也存在仪器设备要求较高、需要专门的技术人员等不足，在一定程度上限制了该方法的推广和运用。免疫分析法具有快速、特异性强、可实现大批量样品检测、操作简单等优点，但该方法存在交叉反应，不能全面体现出样本的毒性。研究者们陆续开发出的一些新技术如细胞毒性试验、酶活力抑制分析法、CE法、拉曼光谱法等，各有优势，但也都还存在各自的不足之处，仍需进一步改进和完善。
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表 1 海洋生物毒素检测方法的优缺点和适用环境比较 |
海洋生物毒素毒性强烈，对国家公共安全以及人民健康构成较大威胁，因此海洋生物毒素的检测方法研究尤其重要。未来此领域的研究将主要集中于以下2个方面：一是高灵敏度、高稳定性、重复性好、普适性强的HPLC-MS研究。海洋生物毒素具有毒性强、半数致死量低的特点，所以建立灵敏度高、稳定性好的检测方法是海洋生物毒素检测发展的重要方向。HPLC-MS因具有灵敏度高、专一性强、准确性高、分离效果好、结果稳定重复性好、能够全面提供毒素信息等优势，现已成为国际标准方法。另一方面则是便携性好、操作简便、抗干扰能力强、可自动调谐的适用于现场工作的SERS光谱仪的研制。SERS技术以其快速、便携等特性，在海洋生物毒素的现场侦检中具有显著优势，极具开发潜力。
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