第二军医大学学报  2016, Vol. 37 Issue (8): 936-942   PDF    
引用本文
吴颖臻, 卢大儒, 程细祥, 蒋跃明 . 上海市438例体检者同型半胱氨酸水平与代谢关键酶基因多态性的关联分析[J]. 第二军医大学学报, 2016, 37(8): 936-942  
WU Ying-zhen, LU Da-ru, CHENG Xi-xiang, JIANG Yue-ming .Correlation of homocysteine levels with gene polymorphisms of metabolic enzyme in 438 adults taking physical examination in Shanghai, China[J]. Academic Journal of Second Military Medical University, 2016 , 37(8): 936-942 (in Chinese with English abstract)  
上海市438例体检者同型半胱氨酸水平与代谢关键酶基因多态性的关联分析
吴颖臻1, 卢大儒1, 程细祥2, 蒋跃明1     
1. 复旦大学生命科学学院现代人类学教育部重点实验室, 上海 200438;
2. 上海市仁爱医院检验科, 上海 200235
收稿日期: 2015-09-22    接受日期: 2016-04-21
作者简介: 吴颖臻,硕士生.E-mail:wy_zhen@126.com
通信作者(Corresponding author): 卢大儒,Tel:021-51630619,E-mail:drlu@fudan.edu.cn
摘要: 目的 研究上海市438例体检者的同型半胱氨酸（Hcy）水平与代谢相关酶基因多态性的关联。 方法 酶循环法检测上海市仁爱医院438例健康体检者的血浆总Hcy（tHcy）、电化学发光法检测叶酸，连接酶检测反应（LDR）进行基因分型。比较不同基因型的Hcy水平，并分析代谢相关酶的基因多态性与tHcy水平的关联。 结果 高同型半胱氨酸血症（HHcy）检出率为28.54%（125/438）。MTHFR C677T不同基因型的tHcy水平间差异有统计学意义（P<0.001）。MTHFR A1298C杂合型CA降低HHcy的患病风险[OR=0.49，95% CI：（0.26，0.92），P=0.027]。MTHFR C677T杂合型CT和突变纯合型TT均增加HHcy的患病风险[OR=2.15，95% CI：（1.06，4.36），P=0.035；OR=7.58，95% CI：（3.15，18.22），P<0.001]。MTR G905A、MTRR A66G、MTRR Ac.56+781C、MTR A2756G、CBS C551G并未发现与HHcy的患病风险有关联。 结论 MTHFR C677T杂合型CT和突变纯合型TT是HHcy患病的风险基因型；MTHFR A1298C杂合型CA可能有助于降低HHcy风险。
关键词: 同型半胱氨酸     高同型半胱氨酸血症     基因多态性     代谢    
Correlation of homocysteine levels with gene polymorphisms of metabolic enzyme in 438 adults taking physical examination in Shanghai, China
WU Ying-zhen1, LU Da-ru1, CHENG Xi-xiang2, JIANG Yue-ming1     
1. MOE Key Laboratory of Contemporary Anthropology, School of Life Sciences, Fudan University, Shanghai 200438, China;
2. Clinical Laboratory, Shanghai Ren-ai Hospital, Shanghai 200235, China
Abstract: Objective To investigate the correlation of homocysteine (Hcy) level with gene polymorphism of Hcy-metabolizing enzymes in healthy adults receiving physical examination in Shanghai, China. Methods Totally 438 participants who were receiving physical examination in Shanghai Ren-ai Hospital were included in this study. The plasma total Hcy (tHcy) levels and serum folate levels were measured by enzymatic cycling methods and electrochemiluminescence, respectively. Genetic typing was determined by ligase detection reaction(LDR). The plasma tHcy levels were compared between different genotypes, and the association of plasma tHcy levels with genetic polymorphisms was analyzed. Results The incidence of hyperhomocysteinemia (HHcy) was 28.54% (125/438) in the present study. There was significant difference in the levels of plasma tHcy among the three genotypes of MTHFR C677T (P<0.001).Heterozygous genotype CA of MTHFR A1298C was associated with a significantly reduced risk of HHcy (OR=0.49, 95% CI: 0.26-0.92,P=0.027); heterozygous genotype CT of MTHFR C677T was associated with a significantly increased risk of HHcy (OR=2.15, 95% CI: 1.06-4.36, P=0.035), and homozygous genotype TT was also associated with a significantly increased risk of HHcy (OR=7.58, 95% CI: 3.15-18.22, P<0.001). No correlation was found for HHcy risk with MTR G905A, MTRR A66G, MTRR Ac.56+781C, MTR A2756G, or CBS C551G. Conclusion TT and CT genotype of MTHFR C677T have been found to be the risks for HHcy; CA genotype of MTHFR A1298C may help to decrease the risk to HHcy.
Key words: homocysteine     hyperhomocysteinemia     gene polymorphism     metabolism    

同型半胱氨酸(homocysteine, Hcy)已被证实与心脑血管疾病[1-2]、出生缺陷及癌症[3]等密切相关。当人体血浆Hcy浓度升高到一定水平就会出现高同型半胱氨酸血症(hyperhomocysteinemia,HHcy)，这是一种备受关注的多基因多因素疾病。除叶酸、维生素B6和B12外[4]，影响Hcy在人体血浆浓度的重要因素还包括代谢相关酶的基因多态性[5]。然而，关于代谢相关酶的基因多态性对Hcy水平和HHcy患病风险的影响，各地报道的结论不一[6-7]，且不尽全面，因而一直存在争议。本研究检测上海市仁爱医院体检者的Hcy代谢相关酶的基因多态性，并分析不同基因型与Hcy水平的关联，为健康人群早期有效预防HHcy提供科学依据。

1 资料和方法 1.1 研究对象

采用横断面研究，收集2014年10月27日至31日上海市仁爱医院健康体检门诊全部体检者资料，排除孕妇、哺乳期妇女和严重慢性疾病、肝肾功能不全者。所有研究对象均为无血缘关系的成年人(年龄≥18周岁)，平均年龄为(38.0±8.6)岁。本研究通过仁爱医院医学伦理委员会讨论审核，符合患者知情同意的相关规定。根据美国心脏协会标准，将健康体检者血浆Hcy水平≥15 μmol/L定义为HHcy[8]，设为病例组；将来自同一体检人群，血浆Hcy水平<15 μmol/L者设为对照组。两组研究对象均无其他器官恶性肿瘤史。

1.2 样本采集和检测

采集晨起空腹外周静脉血置于乙二胺四乙酸(ethylene diamine tetraacetic acid，EDTA)-K2抗凝管(2 mL)和无添加剂管(5 mL)。无添加剂管血样标本离心10 min (1 500×g)，分离血清后，于30 min内按统一的实验室标准操作规程(standard operating procedures，SOP)要求使用全自动生化分析仪(HiTaChi 7600)进行循环酶法测定血浆总Hcy(tHcy)水平，电化学发光仪(Siemens ADVIA Centaur XP)检测叶酸水平。EDTA-K2抗凝管标本送至复旦大学生命科学院实验室作DNA抽提。

1.3 基因提取和检测

引物设计软件为Assay Design 3.1，采用饱和氯化钠法提取DNA，由上海翼和应用生物技术有限公司采用连接酶检测反应(ligase detection reaction，LDR)方法进行基因分型。聚合酶链反应(polymerase chain reaction，PCR)扩增所用仪器为GeneAmp PCR System 9700；PCR扩增引物序列见表 1；PCR反应总体积25 μL：基因组DNA溶液2 μL，含引物(20 pmol/μL)各0.5 μL，2.5 mmol/L的4×dNTP 0.5 μL、5 U/μL Taq酶0.1 μL，MgCl2 2.0 mmol/L，10×PCR Buffer 2.5 μL；PCR扩增条件为：95℃预变性5 min，94℃ 1 min、60.5℃ 1 min、72℃ 1 min，共35个循环，最后72℃延伸5 min。

表 1 PCR扩增引物序列 Tab 1 PCR of all used primer pairs

1.4 统计学处理

数据采用Excel 2010软件进行双人核对录入，SPSS 17.0软件进行统计学分析。符合正态分布的连续性变量用x±s表示，组间比较采用成组t检验或方差分析；非正态分布的连续性变量的数据特征表示为中位数(最小值～最大值)，组间比较采用非参数Kruskal-Wallis检验。率的比较采用χ2检验。单因素logistic回归分析等位基因多态性对HHcy患病风险的影响及不同基因型的HHcy患病风险。应用Hardy-Weinberg平衡分析软件检验基因型分布是否符合Hardy-Weinberg遗传平衡定律。检验水准(α)为0.05。

2 结 果 2.1 研究对象的Hcy水平

本研究共收集452份体检资料，剔除资料不完整者和严重肝肾功能不全者共14例，最终获得研究资料438份，其中男性181例(41.32%)，女性257例(58.68%)；HHcy患者125例(28.54%)。研究对象tHcy总体上呈偏态分布，tHcy中位数为12.9(3.3～60.6) μmol/L；男性为15.1(8.0～60.6) μmol/L，女性为11.9(3.3～32.5) μmol/L，男性的tHcy平均水平高于女性(P<0.001)。

2.2 等位基因频率及对HHcy的患病风险分析

对照组MTR G905A、MTHFR A1298C、MTHFR C677T、MTRR A66G、MTRR Ac.56+781C、MTR A2756G和CBS C551G的突变等位基因频率依次为0.203、0.198、0.361、0.275、0.379、0.085和0.313。Hardy-Weinberg 遗传平衡吻合度检验结果显示，对照组的等位基因频率分布均符合 Hardy-Weinberg 遗传平衡定律(均P>0.05)，说明本研究纳入的体检者各单核苷酸多态性(single nucleotide polymorphism, SNP)位点基因频率分布处于平衡状态，具有群体代表性且不存在分型错误。7个SNP位点基本信息见表 2。

表 2 各位点的基本信息 Tab 2 Information of SNPs of genes

Logistic回归分析发现，MTHFR C677T的等位基因T可增加HHcy患病风险，T等位基因人群患HHcy的风险是C等位基因的2.44倍[OR=2.44(1.81，3.30)，P<0.001]。具体结果见表 3。

表 3 等位基因在病例组和对照组的频率及与HHcy患病风险的关联 Tab 3 Allele frequencies of 7 SNPs between cases and controls and their association with hyperhomocysteinemia (HHcy) risk

2.3 不同基因型的tHcy平均水平比较

进一步用独立样本的非参数检验比较MTHFR C677T不同基因型的tHcy水平，结果显示MTHFR C677T不同基因型的tHcy水平间差异有统计学意义(P<0.001)，突变纯合型TT携带者tHcy平均水平最高，可达16.0 (8.8～60.6) μmol/L，突变杂合型CT携带者的tHcy平均水平[13.0 (3.3～57.8) μmol/L]较低，而野生型CC携带者的tHcy水平[12.2 (7.3～24.6) μmol/L]最低。此外，若校正性别、年龄、叶酸、尿酸和肌酐这些因素后，则发现MTR G905A不同基因型的tHcy之间也有统计学差异(P=0.042)，但其他位点并未发现不同基因型上存在tHcy水平的差异。具体结果见表 4。

表 4 各位点的基因型上Hcy平均水平比较 Tab 4 Comparison of Hcy levels between different genotypes

2.4 多态性基因对HHcy的患病风险分析

应用logistic回归模型分析不同的遗传模式和基因型与HHcy患病风险的相关性。在共显性遗传模型、显性遗传模型、隐性遗传模型和加性遗传模型中，基因型MTHFR A1298C和MTHFR C677T与HHcy的患病风险相关。MTHFR A1298C突变CA基因型能降低HHcy的患病风险[OR=0.49,95% CI: (0.26，0.92),P=0.027]；MTHFR C677T的突变CT和TT基因型均增加HHcy的患病风险[分别是OR=2.15,95% CI: (1.06，4.36),P=0.035和OR=7.58,95% CI: (3.15，18.22),P<0.001]。其余位点均未能发现与HHcy患病风险相关的基因型。具体结果见表 5。

表 5 不同遗传模式及基因型在病例组和对照组的频率及与HHcy患病风险的关联 Tab 5 Genotype frequencies and genetic models of SNPs between cases and controls and their associations with hyperhomocysteinemia (HHcy) risk

3 讨 论

本研究中HHcy患病率为28.54%，与早期国内报道的社区人群HHcy患病率(23.94%)[9]接近，但低于对赣州、昆明等地区的报道[10-11]。至今尚未明确造成血浆tHcy在不同国家和地区间存在差异的原因，推测可能与遗传异质性和不同地区的饮食结构情况有关。

C677T和A1298C是已确定的2个MTHFR基因多态性。MTHFR C677T的错义突变是导致酶活性降低和(或)热稳定性改变的主要机制[12]。MTHFR C677T突变，会导致一个高度保守的丙氨酸(A)被缬氨酸(T)替换，致使MTHFR的热敏感性降低，进而产生AA(野生型)、AT(杂合型)和 TT(纯合型)3 种基因型，并可导致体内Hcy水平升高[13]，本研究结果与此理论相符。MTHFR A1298C是1998年新确认的对MTHFR酶活性有影响意义的另一常见突变位点，该位点核苷酸纯合突变可导致MTHFR酶的活性降低。本研究中MTHFR A1298C位点的C等位基因频率在对照组中为19.8%，远低于2000年美国学者研究报道的40.1%[14]，提示该位点突变可能存在种族和群体的差异。此外，本研究结果表明MTHFR A1298C杂合型CA的HHcy患病率是野生型AA的0.49倍(P=0.027)，这与韩越等[15]研究认为“MTHFR A1298C有可能是非综合征型唇腭裂(NSCL/P)发生的保护因素”的结论相近。

MTRR基因定位于5p15.2～15.3，是蛋氨酸合成酶的辅助因子，催化甲基钴胺再生。国内外有研究认为MTRR多态性与血浆半胱氨酸水平相关，G等位基因可能是HHcy的遗传易感标志[16-17]。但本研究尚未发现MTRR A66G基因位点对HHcy的患病风险有影响。而以往关于MTRR Ac.56+781C的研究多集中在先天性心脏病及神经管缺陷方面，本研究率先在普通体检人群中进行该位点的研究，但未发现MTRR Ac.56+781C基因位点对HHcy的患病风险有影响。

MTR基因定位于1p43的Ms基因的A2756G突变最为常见，这种突变使第919位天冬氨酸转变为甘氨酸，然而大部分研究者认为这种突变不能提高血浆Hcy水平[18]，本研究结论与上述观点一致，即MTR A2756G突变对HHcy的患病风险无统计学意义。曾有研究报道位于3′-UTR的MTR G905A多态的A等位基因为先天性心脏病的风险因子[19]，但在本研究中，未发现MTR G905A基因位点对HHcy的患病风险有影响。

胱硫醚-β合成酶(CBS)基因位于21号染色体(21q22.3)。CBS C551G和G919A是CBS最常见的基因突变，均可引起CBS酶活性的部分丧失，使Hcy和丝氨酸的缩合反应被影响，导致体内Hcy水平升高。但有研究表明CBS C551G位点突变等位基因A对血清tHcy水平无明显影响[20]。本研究结果表明，CBS C551G位点的突变对HHcy的患病风险无影响，有别于其他研究发现CBS C551G是先天性心脏病患病的保护型位点[21]。

本研究之所以出现不同于国内外相关研究的结论，可能与研究对象选择标准、群体遗传结构、群体疾病易感性、相关疾病诊断标准、研究方法和样本量大小等有关。因此，有必要进行多项大样本、多中心合作的研究来探索代谢相关酶的基因多态性与血浆tHcy水平的关联。HHcy是多因素多基因的疾病，是遗传、环境、营养因素共同作用和交互影响的结果，候选基因可能通过与环境之间的交互作用而影响疾病的发生风险和病情程度，因此不能用一种单一原因解释该疾病的发生。有研究表明，Hcy水平升高35%是由低叶酸、低维生素B12引起，而9%由基因突变引起[22]。考虑基因-环境的交互作用，对于准确评估基因与疾病之间的关联非常重要。研究需要进一步纳入更多的影响因素，深入研究基因多态性的影响意义，并综合分析各影响因素的交互作用。

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