随着糖尿病病程的进展，糖尿病并发症的发生严重影响人类的生活质量，其中糖尿病肾病作为糖尿病微血管并发症之一，是导致终末期肾功能衰竭的最常见原因^[1]。研究发现，虽然糖尿病患者循环内生长激素(growth hormone，GH)水平升高、胰岛素样生长因子1(insulin-like growth factor 1，IGF-1)水平降低，但其肾脏组织中GH、IGF-1水平均升高^[2]，两者具有促细胞增殖、分化等作用；同时高血糖刺激、GH等均可激活丝裂原活化蛋白激酶(mitogen-actived protein kinase, MAPK)家族信号通路，如胞外信号调节激酶(extracellular signal-regulated kianse, ERK)/ c-Jun氨基末端激酶(c-Jun N-terminal kinase, JNK)/p38^[3-4]，提示其与肾脏肥大、细胞外基质(ECM)增多有关。本研究旨在观察津力达颗粒对1型糖尿病大鼠肾脏组织GH、IGF-1水平的影响及对肾脏的保护作用。

津力达颗粒和通心络超微粉由石家庄以岭药业有限公司提供；二甲双胍(0.85 g/片)购自中美上海施贵宝有限公司；沙格列汀(5 mg/片)购自阿斯利康制药有限公司；链脲佐菌素(streptozocin, STZ)、羟甲基纤维素钠、柠檬酸及柠檬酸钠均购自美国Sigma公司；反转录试剂盒、SYBR Green PCR试剂盒、BCA蛋白定量试剂盒购自Thermo公司；RNaseⅠ购自Fermentas公司；PCR引物购自上海捷瑞生物工程有限公司；ERK/p-ERK抗体、JNK/p-JNK抗体、p38/p-p38抗体、GAPDH抗体购自美国CST公司；羊抗兔HRP标记二抗、羊抗鼠HRP标记二抗购自碧云天生物科技公司；石蜡购自中国石油化工有限公司；氯仿、异丙醇、甲醛、二甲苯、无水乙醇、氨水、冰醋酸、甘油、10%水合氯醛等购自上海国药集团；中性树脂、苏木精、伊红购自上海长岛生物技术有限公司；RIPA组织细胞快速裂解液、DEPC处理水、PBS、中性树脂购自上海基尔顿生物科技有限公司；Masson染色试剂盒购自南京凯基生物科技发展有限公司；AB-PAS染色试剂盒购自北京雷根生物技术有限公司；普通饲料由第二军医大学实验动物中心提供。

按照STZ诱导实验性糖尿病动物模型的方法制备1型糖尿病大鼠模型。60只成年雄性SD大鼠，体质量180~220 g，购自第二军医大学实验动物中心[许可证号：SCXK(沪)2012-0003]，适应性饲养3 d后，禁食不禁水12 h，随机抽取5只作为正常对照组(NC组)，其余大鼠则以60 mg/kg的STZ溶液腹腔注射(STZ溶于0.1 mmol/L柠檬酸钠缓冲液，pH 4.2~4.5，新鲜配制)。72 h后鼠尾静脉采血测血糖值，根据血糖≥16.7 mmol/L确定是否造模成功。将成模大鼠进行随机分组，分别为糖尿病模型组(DM组)、低剂量津力达组(JL组)、中剂量津力达组(JM组)、高剂量津力达组(JH组)、中剂量津力达+通心络组(JM+TXL组)、二甲双胍组(Met组)、沙格列汀组(Sax组)，每组5只(去除造模失败、死亡鼠)。

JL、JM和JH组分别给予0.75、1.5、3.0 g/kg的津力达颗粒，JM+TXL组给予1.5 g/kg津力达颗粒+0.4 g/kg通心络超微粉，Met组给予50 mg/kg二甲双胍，Sax组给予1 mg/kg沙格列汀。各组药物均溶于0.5%羟甲基纤维素钠后灌胃，DM组和NC组仅给予0.5%羟甲基纤维素钠(1 mL/100 g)灌胃。8周后全部大鼠(每组5只)禁食过夜后称量并记录。按0.4 mL/100 g的剂量腹腔注射10%水合氯醛麻醉大鼠，打开腹腔，迅速留取肾脏组织，部分放入10%甲醛液中固定，另一部分液氮速冻，－80℃保存。

取大鼠肾脏皮质组织，用标准TRIzol法提取总RNA，将RNA用反转录酶反转录为cDNA，SYBR Green法实时定量PCR检测肾脏GH及其受体(GHR)、IGF-1及其受体(IGF-1R)、胰岛素样生长因子结合蛋白1(IGFBP-1)的表达，管家基因GAPDH作为内参。引物序列见表 1。

表 1 (Tab 1)

表 1 实时定量PCR所用引物序列 名称 序列 GH F：5′-AGTTCGAGCGTGCCTACATTCC-3′ R：5′-CAGCGAGAAGCGAAGCAATTCC-3′ GHR F：5′-TGCTTTGCCTTTGCCTGAC-3′ R：5′-ACATTCACTCTCACGCTCTCC-3′ IGF-1 F：5′-CAAAGTCAGCTCGTTCCATCC-3′ R：5′-GGTCTTGTTTCCTGCACTTCC-3′ IGF-1R F：5′-GAGGAGGTGACAGGAACAAAG-3′ R：5′-GGAGGTGAAACGGAGAACATC-3′ IGFBP-1 F：5′-CCCAGCGAGCATTGAACAC-3′ R：5′-TACGCGAACCTGGAAGGAC-3′ GAPDH F：5′-GTCGGTGTGAACGGATTTG-3′ R：5′-TCCCATTCTCAGCCTTGAC-3′   GH:生长激素; GHR:生长激素受体; IGF-1:胰岛素样生长因子1; IGF-IR:胰岛素样生长因子1受体; IGFBP-1:胰岛素样生长因子结合蛋白1

表 1 实时定量PCR所用引物序列

分离肾脏皮质组织，剪碎、匀浆，提取组织样品并进行蛋白定量(562 nm)。PAGE分离蛋白样品，转膜，5%脱脂奶粉封闭，加入相应ERK、p-ERK、JNK、p-JNK、p38、p-p38、FN抗体孵育，显色。使用蛋白灰度分析软件检测目的蛋白条带灰度值并定量，结果以目的条带灰度值与内参GAPDH条带灰度值的比值来表示。

用10%甲醛固定部分肾脏组织，常规洗涤、脱水、透明、浸蜡、包埋、切片后，分别行H-E染色、Masson染色和PSA染色，显微镜下观察组织并拍照。

应用SPSS 19.0软件进行数据分析，数据用x±s表示，多组间比较采用单因素方差分析；两组间比较采用Dunnett-t检验，方差不齐时为Dunnett’s T3检验，检验水准(α)为0.05。

大鼠腹腔注射STZ 3 d后，鼠尾静脉血糖值高于16.7 mmol/L者可确定成模，本实验成模率100%。成模大鼠摄食量、饮水量增加，二便排泄增多，精神差，反应迟钝，毛发黯淡杂乱。随后每周监测大鼠血糖及体质量，血糖值均≥16.7 mmol/L，且体质量减轻。

与NC组相比，DM组大鼠肾脏GH、GHR、IGF-1、IGF-1R、IGFBP-1 mRNA的表达升高(P < 0.01)。与DM组相比，JM组、JH组、JM+TXL组、Met组肾脏GH和IGF-1 mRNA的表达降低(P < 0.01)，所有治疗组肾脏GHR mRNA的表达均降低(P < 0.01)，JL组、JM组、JH组、JM+TXL组、Met组肾脏IGF-1R mRNA的表达均降低(P < 0.05，P < 0.01)，JM+TXL组IGFBP-1 mRNA的表达降低(P < 0.05)。见图 1。

图 1 各组大鼠肾脏GH、GHR、IGF-1、IGF-1R、IGFBP-1 mRNA的表达水平 NC:正常对照组; DM:糖尿病组; JL: 0.75 g/kg津力达组; JM: 1.5 g/kg津力达组; JH: 3.0 g/kg津力达组; JM+T: 1.5 g/kg津力达颗粒+0.4 g/kg通心络超微粉组; Met: 50 mg/kg二甲双胍组; Sax: 1 mg/kg沙格列汀组. GH:生长激素; GHR:生长激素受体; IGF-1:胰岛素样生长因子1; IGF-1R:胰岛素样生长因子1受体; IGFBP-1:胰岛素样生长因子结合蛋白1. *P < 0.05, **P < 0.01与DM组比较; △△P < 0.01与NC组比较. n=5, x±s

与NC组相比，DM组肾脏p-ERK/ERK、p-JNK/JNK比值和FN表达均升高，p-p38/p38比值降低。与DM组相比，JM、JH、JM+TXL、Met和Sax组p-ERK/ERK、p-JNK/JNK的比值均降低；所有治疗组p-p38/p38的比值均升高，而FN的表达均降低。见图 2。

图 2 各组大鼠肾脏MAPK系统通路相关蛋白、FN的表达 NC:正常对照组; DM:糖尿病组; JL： 0.75 g/kg津力达组; JM: 1.5 g/kg津力达组; JH: 3.0 g/kg津力达组; JM+TXL: 1.5 g/kg津力达颗粒+0.4 g/kg通心络超微粉组; Met: 50 mg/kg二甲双胍组; Sax: 1 mg/kg沙格列汀组. ERK:胞外信号调节激酶; JNK: c-Jun氨基末端激酶; FN:纤维连接蛋白

H-E染色(图 3A)镜下示NC组大鼠肾小球轮廓及周围肾小管结构清晰，细胞间界限清晰；DM组皮质变薄，肾小球轮廓不清、数量减少，肾小管结构模糊、细胞界限不清。Masson染色(图 3B)镜下示DM组相对于NC组肾小管-间质中蓝染部分增加，即发生胶质沉积和间质纤维化。PAS染色(图 3C)镜下示DM组肾小球内紫红色面积增加，肾小球系膜区增生，基底膜增厚。由各染色结果可见，JM、JL、JM+TXL组大鼠肾脏组织形态相较于DM组均有不同程度的改善。

图 3 各组大鼠肾脏组织H-E染色(A)、Masson染色(B)及PAS染色(C)结果 A1，B1，C1:正常对照组; A2, B2, C2:糖尿病组; A3, B3, C3: 0.75 g/kg津力达组; A4, B4, C4: 1.5 g/kg津力达组; A5, B5, C5: 3.0 g/kg津力达组; A6, B6, C6: 1.5 g/kg津力达颗粒+0.4 g/kg通心络超微粉组; A7, B7, C7: 50 mg/kg二甲双胍组; A8, B8, C8: 1 mg/kg沙格列汀组. Original magnification: ×200

糖尿病肾病作为糖尿病微血管并发症之一，其肾脏病理损伤包括早期肾小球高滤过、肾小球肥大、细胞外基质增厚、晚期肾小球纤维化等^[5]。糖尿病肾病的发生和发展涉及多种机制，已有证据表明，GH和IGF在糖尿病肾病的发展中有重要作用^[6]。GH/IGF-1系统各组成部分在肾脏中均有表达，通过多种途径参与糖尿病肾病的发生，如IGF-1可抑制NO合酶，降低肾小动脉阻力，增加肾小球滤过率^[7]；还可刺激肾小球系膜细胞有丝分裂，诱导细胞迁移及蛋白多糖、FN、Ⅳ型胶原纤维的合成^[8-9]。虽然GH不直接影响肾脏血流动力学、细胞增殖及细胞外基质的产生，但其可通过IGF-1发挥作用^[10]。此外，GH还存在一些IGF-1非依赖性作用，可能与肾小球硬化相关^[11]。GH/IGF-1可激活Akt、MAPK、PI3K等多条信号通路，其中MAPK家族系统是促进细胞增殖和传导应激信号的主要通路，与糖尿病肾病的发生机制相关^[12]。MAPK家族系统包括ERK、JNK、p38等蛋白，高血糖、生长因子、氧化应激、牵张刺激等均可激活MAPK通路，通过磷酸化作用激活下游转录因子(如STAT，c-jun，AP-1等)，进而调节转化生长因子-β1(TGF-β1)等表达，影响细胞增殖、FN及Ⅳ型胶原的合成，从而促进糖尿病肾病的发生和发展^[13-14]。

中医认为“消渴病”(糖尿病)起于“中焦”(脾，包含胰腺概念)，脉络学认为“孙络-微血管”损伤时易壅滞、积瘀，从而导致孙络所处脏器组织发生病变^[15]。津力达颗粒重在改善“脾”运化功能失调，继而使水津沿“孙络-微血管”输布至脏器，治疗微血管病变^[16]。

本研究通过检测大鼠肾脏组织中GH、GHR、IGF-1、IGF-1R、IGFBP-1 mRNA的水平来反映GH/IGF-1系统在肾脏中的表达情况，发现DM组肾脏组织内GH、GHR、IGF-1、IGF-1R、IGFBP-1 mRNA的表达与NC组比较均升高，中或高剂量津力达颗粒治疗后，GH、GHR、IGF-1、IGF-1R mRNA的表达水平降低，表明GH、IGF-1及相关受体的高表达可能与糖尿病肾脏改变相关。此外，本研究通过检测大鼠肾脏组织MAPK通路相关蛋白及FN蛋白的表达来反映肾脏组织MAPK家族的激活状态及纤维化程度，发现DM组pERK/ERK、pJNK/JNK比值及FN蛋白的表达与NC组比较均升高，而加入中、高剂量津力达颗粒治疗后，ERK、JNK的磷酸化水平及FN蛋白的表达均降低，表明津力达颗粒可能通过抑制ERK、JNK通路的激活来减少细胞外基质(包括FN)的生成。本研究3种肾脏病理染色结果均表明津力达颗粒可抑制肾小球细胞增殖、基底膜增厚及肾小球纤维化。另JM+TXL组对肾脏GH、GHR、IGF-1、IGF-1R、IGFBP-1 mRNA表达的抑制作用大于JM组，提示通心络可能也具有与津力达颗粒相似的作用，两药合用具有协同作用。

综上所述，津力达颗粒可降低糖尿病大鼠肾脏GH、IGF-1表达，抑制ERK、JNK通路的激活从而减少细胞外基质的生成，具有肾脏保护作用。