第二军医大学学报  2016, Vol. 37 Issue (7): 815-820   PDF    
单壁碳纳米管的肺毒性及氧化应激机制
吕高建1, 汤莹2, 沈亚峰2, 雷长海2, 赵文茹1, 陈新1,3, 杨勇骥2     
1. 华东理工大学材料科学与工程学院, 超细材料制备与应用教育部重点实验室, 上海 200237;
2. 第二军医大学基础部生物物理学教研室, 上海 200433;
3. 中国科学院上海微系统与信息技术研究所, 信息功能材料国家重点实验室, 上海 200050
摘要: 目的 研究单壁碳纳米管(single-wall carbon nanotubes,SWCNTs)的肺毒性,并探讨其毒性机制,为安全生产和应用SWCNTs提供实验依据。 方法 A549细胞用质量浓度为0、25、50、100、150、200μg/mL的SWCNTs溶液孵育24 h,用CCK-8和乳酸脱氢酶(lactate dehydrogenase,LDH)试剂盒分别检测SWCNTs对A549细胞活性和细胞膜的影响,Hoechst 33342和PI荧光双染法检测细胞死亡情况,透射电镜(TEM)观察细胞超微结构变化,并检测细胞内活性氧(reactive oxygen species,ROS)水平、谷胱甘肽(glutathione,GSH)浓度和超氧化物歧化酶(superoxide dismutase,SOD)活力以评估氧化应激情况。分别将0.5 mg/mL和1 mg/mL的SWCNTs溶液通过气管灌流的方法使大鼠肺部染毒,3 d后取大鼠肺脏,常规H-E染色,检测肺组织病理学变化。 结果 SWCNTs对A549细胞表现出明显毒性,使细胞活性降低,死亡细胞增多,细胞膜和细胞结构损伤严重,细胞内ROS水平升高,GSH浓度和SOD活力降低。体内毒性检测结果表明SWCNTs在大鼠肺组织内积累,造成肺泡壁水肿增厚。 结论 体外细胞毒性检测和动物毒性检测结果表明SWCNTs具有较大的肺毒性,其主要毒性机制是氧化应激反应。
关键词: 单壁碳纳米管     肺毒性     氧化性应激     氧化还原平衡    
Pulmonary toxicity of single-wall carbon nanotubes and its oxidative stress mechanism
LÜ Gao-jian1, TANG Ying2, SHEN Ya-feng2, LEI Chang-hai2, ZHAO Wen-ru1, CHEN Xin1,3, YANG Yong-ji2     
1. Key Laboratory for Ultrafine Materials of Ministry of Education, School of Material Science and Engineering, East China University of Science and Technology, Shanghai 200237, China;
2. Department of Biophysics, College of Basic Medical Sciences, Second Military Medical University, Shanghai 200433, China;
3. State Key Laboratory of Functional Materials for Informatics, Shanghai Institute of Microsystem and Information Technology, Chinese Academy of Sciences, Shanghai 200050, China
Supported by National Science and Technology Pillar Program (2011BAK15B04 [31-1122ZCKF]), Project for Key Discipline and Key Laboratory of Shanghai (B502, 08DZ2230500), Program of Shanghai Science and Technology Committee (11nm0507000), and Open Project of National Key Laboratory on Functional Information Materials (SKL201306).
Abstract: Objective To systematically study the pulmonary toxicity of single-wall carbon nanotubes (SWCNTs) and to explore the related cytotoxicity mechanism, so as to provide a theoretical basis for the safe production and application of SWCNTs. Methods A549 cells were cultured in the media containing 0, 25, 50, 100, 150, and 200μg/mL SWCNTs for 24 h, and then the cell viability and degree of cell membrane damage were assessed by CCK-8 and lactate dehydrogenase (LDH) release assay kit, respectively; the ultrastructural alteration of A549 cells was detected by transmission electron microscope (TEM). The oxidative stress response was evaluated by assessing reactive oxygen species (ROS), glutathione (GSH) and superoxide dismutase (SOD). The rats were exposed to SWCNTs by intratracheal inhalation, and then the animals were sacrificed 3 days later and the pathological sections of lung tissue were examined. Results SWCNTs showed considerable toxicity to A549 cells, decreasing cell viability, causing severe damage of cell membrane and ultrastructure, increasing the intracellular ROS level, and decreasing GSH content and SOD activity. It was found that oxidative stress is the main mechanism of SWCNTs toxicity on A549 cells. In vivo toxicity results showed that SWCNTs accumulated in the lung tissue, causing alveolar wall edema. Conclusion In vitro and in vivo toxicity results have found that SWCNTs possess a significant pulmonary toxicity, with its main toxicity mechanism being oxidative stress.
Key words: single-wall carbon nanotubes     pulmonary toxicity     oxidative stress     redox homeostasis    

碳纳米管(carbon nanotubes, CNTs)是碳的一种同素异形体,呈圆筒状,直径尺寸在纳米级别,长度通常为微米级。按组成碳原子层的数目,可将CNTs分为2种:单壁碳纳米管(single-wall carbon nanotubes, SWCNTs)和多壁碳纳米管(multi-wall carbon nanotubes, MWCNTs)[1]。因为CNTs具有优良的导电、导热、机械性能和生物相容性,被广泛应用在电子、催化剂、材料和生物医药领域[2-4]。随着CNTs的生产规模和应用范围不断扩大,人类和动物与之接触的概率也不断增加,在应用CNTs材料的同时,不能忽略其毒性研究[5]。CNTs质量较轻,容易在空气中漂浮并随之扩散,有研究表明空气中的CNTs可以通过呼吸的方式进入到肺泡内[6],因此研究CNTs的肺毒性具有十分重要的意义。本研究结合体外细胞毒性检测和动物体内毒性检测2种方法,较系统地评估SWCNTs的肺毒性大小,并从氧化应激角度初步探讨SWCNTs肺毒性的机制。

1 材料和方法 1.1 材料

SWCNTs来自国家纳米科学中心,直径1~2 nm,长度< 5μm,纯度90%;A549细胞购自武汉大学保藏中心;细胞高糖DMEM培养基、胎牛血清(fetal bovine serum, FBS)、胰酶、青霉素和链霉素购于Invitrogen公司;CCK-8细胞活性检测试剂盒为东仁化学公司产品;乳酸脱氢酶(lactate dehydrogenase, LDH)、活性氧(reactive oxygen species, ROS)、谷胱甘肽(glutathione, GSH)和超氧化物歧化酶(superoxide dismutase, SOD)检测试剂盒购自碧云天生物科技公司;Hoechst 33342和碘化丙啶(propidium iodide, PI)为Sigma-Aldrich公司产品;其他化学试剂均为分析纯。

1.2 SWCNTs形貌检测

在毒性检测前,先利用透射电镜(transmission electron microscope, TEM)观察SWCNTs形貌。SWCNTs经超声和震荡处理后充分分散在双蒸水中,取少量分散液滴到有碳膜的铜网上,待水分蒸发完毕,利用TEM (H-7650, 日立)观察样品。

1.3 细胞毒性检测

选体外培养A549细胞作为检测SWCNTs毒性的体外模型。每天更换细胞培养液1次,每2 d将细胞传代1次。细胞培养液为含10% FBS的DMEM,利用该培养液配制不同浓度的SWCNTs分散液。

1.3.1 CCK-8法检测细胞活性

按每孔5 000个细胞的密度将A549细胞接种到96孔培养板中,然后利用质量浓度为0、25、50、100、150、200μg/mL的SWCNTs溶液孵育细胞24 h,最后用CCK-8试剂检测细胞活性,用酶标仪测定450 nm波长下的光密度(D)值,计算细胞活性。

1.3.2 LDH释放法检测细胞膜损伤

LDH是细胞内一种稳定的酶,当细胞膜损伤或破裂时,LDH会释放到细胞外的培养液中,通过检测培养液中LDH的浓度可评估细胞膜的损伤程度。将不同浓度的SWCNTs处理的细胞孵育24 h后,利用LDH试剂盒检测培养液中LDH浓度。未处理的细胞作为阴性对照组,LDH释放液处理过的细胞作为阳性对照组,测定波长为490 nm下的D值,计算LDH释放率。

1.3.3 Hoechst 33342和PI荧光双染检测细胞死亡

Hoechst 33342和PI是2种不同的核酸荧光探针,Hoechst 33342可以透过活细胞的细胞膜进入到细胞内,从而对细胞核染色;PI不能透过活细胞的细胞膜,所以只有当细胞膜损伤严重或细胞死亡时才能进入细胞,对核酸染色。将细胞接种到无菌盖玻片上,在SWCNTs溶液中孵育24 h后,利用Hoechst 33342和PI两种荧光探针对细胞染色,充分漂洗后封片,荧光显微镜下观察。

1.3.4 TEM观察细胞超微结构损伤

实验细胞经胰酶消化后,4%多聚甲醛固定,梯度乙醇和丙酮脱水,812树脂包埋,切成70 nm薄片,醋酸铀和硝酸铅染色,利用TEM观察。

1.4 细胞氧化应激反应检测 1.4.1 DCFH-DA法检测细胞内ROS含量

DCFH-DA是检验ROS常用的一种试剂,它可进入细胞内通过酶分解和ROS氧化生成具有荧光的DCF,检验荧光强度用来评估ROS浓度。将细胞在SWCNTs溶液中孵育4 h,经DCFH-DA荧光探针染色,充分漂洗,利用荧光酶标仪检测荧光强度(激发波长:488 nm,发射波长:525 nm)。

1.4.2 GSH和SOD试剂盒检测细胞内GSH含量和SOD活力

细胞与SWCNTs溶液作用24 h后,将细胞裂解后离心取上清液,分别按照试剂盒说明书要求检测GSH浓度和SOD活力。

1.5 大鼠肺毒性检测

健康雄性SD大鼠购自第二军医大学实验动物中心[许可证号:SCXK (沪) 2012-0003],标准化饲养,待体质量达220~250 g时可进行毒性检测。分别将1 mL生理盐水、0.5 mg/mL SWCNTs和1 mg/mL SWCNTs通过气管灌流的方法,使大鼠肺部染毒(若每只大鼠体质量按250 g计算,则0.5 mg/mL剂量可换算成2 mg/kg,1 mg/mL剂量为4 mg/kg)。具体实验操作如下:(1)腹腔注射麻药将大鼠麻醉,插入中空玻璃细管到大鼠气管;(2)将三叉管的一端连接到中空玻璃细管,一端连接动物呼吸机,材料分散液则通过三叉管的第三端接口注射到大鼠肺脏中;(3)SWCNTs溶液要随着大鼠的呼吸频率注射,使材料能够充分进入大鼠肺脏。染毒结束后大鼠自由进食。3 d后麻醉大鼠并取出肺脏,经4%多聚甲醛固定,按常规方法制成组织病理切片,常规H-E染色,光镜下观察。

1.6 统计学处理

采用SPSS 21.0软件分析数据。所有数据均用±s表示,使用单因素方差分析(one-way ANOVA)比较组间差异,检验水准(α)为0.05。

2 结果 2.1 SWCNTs的表征

SWCNTs的基本信息由生产商提供。在毒性测试前,先利用TEM观察SWCNTs的形貌和分散状态,可见镜下SWCNTs呈分散的管状(图 1)。

图 1 透射电镜观察SWCNTs形貌 Fig 1 Appearance of SWCNTs under transmission electron microscope

2.2 SWCNTs对A549细胞的毒性

A549细胞活性检测结果(图 2A)显示,细胞在SWCNTs溶液中孵育24 h后,细胞活性随着SWCNTs浓度的增加而逐渐减小,在100μg/mL质量浓度下为69.0%,在200μg/mL质量浓度下降至42.3%。LDH释放检测结果(图 2B)显示,细胞外LDH浓度随着SWCNTs浓度增加呈上升趋势,在50μg/mL质量浓度下LDH释放率为26.8%,表明细胞膜在该浓度下明显受到损伤;在200μg/mL质量浓度下LDH释放率高达73.4%,表明此时细胞膜损伤严重。为了进一步研究SWCNTs对A549细胞的毒性,采用Hoechst 33342和PI荧光双染的方法检测细胞死亡情况,结果(图 3)显示,对照组细胞几乎无红色荧光(PI),随着SWCNTs浓度增加,被PI着色的细胞比例增加,且红色荧光强度也增强,表明随着SWCNTs浓度增加,死亡细胞越来越多。采用TEM检测细胞超微结构变化,结果(图 4)显示,A549细胞在100μg/mL的SWCNTs溶液中孵育24 h后,SWCNTs主要以团聚的形式存在于细胞质中,细胞核中没有发现CNTs的存在;细胞超微结构受到严重损伤,线粒体出现明显肿胀,线粒体嵴溶解。

图 2 SWCNTs对A549细胞活性(A)和LDH释放(B)的影响 Fig 2 Effects of SWCNTs on cell viability (A) and LDH leakage (B) of A549 cells

图 3 SWCNTs对A549细胞死亡的影响 Fig 3 Effects of SWCNTs on death of A549 cells

图 4 SWCNTs对A549细胞超微结构的影响 Fig 4 Effects of SWCNTs on ultrastructure of A549 cells

2.3 SWCNTs对A549细胞氧化应激反应的影响

由荧光酶标仪检测结果(图 5A)可见,A549细胞在SWCNTs溶液中培养4 h后,细胞内ROS含量明显增加,SWCNTs质量浓度为50μg/mL时ROS含量为207.2%,SWCNTs质量浓度为100μg/mL时ROS含量增高至345.6%。总体上,随着SWCNTs浓度增加,ROS含量呈现先增加后保持不变的趋势。由图 5B可见,细胞与不同浓度的SWCNTs作用24 h后,细胞内GSH含量随着SWCNTs浓度增加而降低,在150μg/mL质量浓度下GSH相对含量为70.0%,在200μg/mL质量浓度下GSH相对含量降低至65.2%。由图 5C可见,SOD活力随着SWCNTs浓度增加而逐渐降低,在200μg/mL质量浓度下SOD活性降至50.6%。

图 5 SWCNTs对A549细胞氧化应激反应的影响 Fig 5 Effects of SWCNTs on oxidative stress of A549 cells

2.4 SWCNTs对大鼠肺组织病理的影响

通过气管灌流的方法使大鼠染毒不同剂量的SWCNTs,饲养3 d后,大鼠体质量和毛发未发生明显变化,且没有出现死亡和异常行为。切取大鼠肺组织进行病理学检测,结果(图 6)显示,SWCNTs能进入到肺泡内,并在肺组织中积累,使肺泡壁出现明显水肿增厚,从而使得肺泡空间减小。

图 6 SWCNTs对大鼠肺组织病理的影响 Fig 6 Effects of SWCNTs on pulmonary pathology of rats

3 讨论

由于具有特殊的物理化学性能,SWCNTs被应用在多个科学领域[7],人类通过呼吸接触到SWCNTs的概率也随之增大,因此不能忽视对其肺毒性的研究[8-9]。本研究通过细胞毒性检测和动物实验,比较系统地研究了SWCNTs对肺毒性的大小,并针对SWCNTs的毒性机制进行探究。

A549作为肺上皮细胞系,被广泛应用在体外肺毒性的评估中[10-11]。本研究发现,当A549细胞暴露在不同剂量的SWCNTs溶液中24 h后,细胞活性随着SWCNTs浓度增加而降低,在高浓度(100~200μg/mL)下细胞活性显著降低。SWCNTs不仅能引起A549细胞活性降低,还能破坏细胞膜和细胞超微结构。LDH释放能反映细胞膜的损伤[12],SWCNTs在较低的剂量下能引起LDH明显释放,表明细胞膜容易被SWCNTs损伤。Hoechst 33342/PI荧光双染结果发现,随着SWCNTs剂量增加,死亡细胞也逐渐增加,表现为细胞红色荧光增强。此外,暴露在SWCNTs环境下,A549细胞结构也发生了较大变化,细胞质内有大量团聚的SWCNTs,线粒体受损严重,出现明显肿胀,线粒体内嵴基本溶解。作为细胞内重要的一种细胞器,线粒体的主要功能是为细胞提供ATP,线粒体结构损伤势必会影响到正常生理功能,进而引起细胞死亡。

研究表明CNTs通过损伤线粒体引发ROS产生[13],细胞内ROS具有较高的反应活性,可以对细胞产生多种危害,包括引发炎症反应、产生基因毒性、影响信号通路、诱发细胞凋亡等[14-16]。细胞内ROS的产生往往早于其他变化[17],本研究检测了SWCNTs暴露4 h内细胞内ROS含量变化,发现ROS浓度明显升高。GSH和SOD作为细胞内2种重要的抗氧化剂,它们的含量和活力与ROS浓度有密切关系。实验结果也显示,高浓度的SWCNTs会引起细胞内GSH含量和SOD活力显著降低。有文献报道,CNTs引发细胞内ROS产生,进而使脂质过氧化物(lipid peroxidation, LPO)浓度升高,使SOD活力和GSH浓度发生变化[18-19]。细胞内ROS含量明显增加,抗氧化剂GSH和SOD明显降低,使得细胞内氧化能力强于还原能力,细胞氧化还原平衡被打破,细胞氧化还原能力失衡后引起细胞死亡[20-21]。综合上述结果,我们认为氧化应激反应是SWCNTs引发A549细胞毒性的主要机制。

本研究通过大鼠体内毒性检测,发现SWCNTs可以在肺泡内积累,大多数CNTs被肺泡壁包裹。与正常大鼠相比,染毒SWCNTs的肺泡壁出现明显水肿增厚,肺泡体积明显减小。CNTs化学性能较稳定,很难在人体内分解,文献报道,CNTs在肺组织内长期积累,能引发肺纤维化、肉芽瘤和细胞癌变[5, 22]。长期接触CNTs可能会使CNTs在肺组织内不断积累,从而造成肺脏发病率升高,甚至引发肺癌。积累在肺组织中的SWCNTs可能会穿过毛细血管壁,进入到血液中,对血液中的蛋白质和血细胞产生不利影响,同时还能借助血液循环扩散到其他器官,比如肾脏、脾脏和肝脏等。因此,在CNTs工业生产和大量应用中,应尽量全面通风,穿戴工作服、防尘口罩和手套,避免直接接触CNTs;高浓度环境下需佩戴防护眼镜,并注意个人卫生,避免长时间接触CNTs。

本研究发现无论是体外毒性检测还是体内毒性检测,SWCNTs都表现出明显的肺毒性,其主要毒性机制是氧化应激反应。本研究内容和结果为安全生产和应用SWCNTs提供了实验依据。

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