2016, Vol. 37
β-淀粉样蛋白(β-amyloid peptides, Aβ)是老年斑的主要成分，具有广泛的细胞毒作用。Aβ可调节抗凋亡及促凋亡蛋白的表达，引起细胞凋亡[1]；产生或诱导大量自由基，加剧氧化应激[2]；分泌促炎因子，介导炎症损伤[3]。近期研究发现自噬也参与了Aβ的细胞毒作用[4]。当自噬溶酶体功能障碍时，Aβ降解减少，导致Aβ在脑内异常聚集；Aβ的异常聚集又进一步加重自噬溶酶体功能障碍，形成恶性循环[5]。硫化氢(hydrogen sulfide，H2S)是一种气体信号分子，可以通过调节多种信号途径对Aβ诱导的细胞毒性起到保护作用[6-8]。然而，H2S对Aβ诱导的自噬是否具有保护作用还未见报道。本实验拟通过使用Aβ25-35及H2S供体硫氢化钠(NaHS)干预鼠成神经细胞瘤细胞Neuro-2a，观察其对细胞存活率、自噬蛋白表达及磷脂酰肌醇3-激酶(PI3K)/蛋白激酶B(Akt)/哺乳动物雷帕霉素靶蛋白(mTOR)信号通路的影响，从而探讨H2S对Aβ25-35诱导的Neuro-2a细胞自噬的影响及其潜在机制。
1 材料和方法 1.1 主要试剂和仪器MEM、DMEM高糖培养基、10%澳洲胎牛血清及0.5%青霉素、链霉素购自Gibco公司，Aβ25-35购自生工生物工程(上海)股份有限公司。NaHS、LY294002、3-甲基腺嘌呤(3-MA)及抗LC3B抗体购自Sigma公司，抗Beclin-1、P62抗体购自Abcam公司，抗p-Akt、p-mTOR、GAPDH抗体购自CST公司。MTT细胞毒性检测试剂盒购自碧云天生物技术研究所。辣根过氧化酶标记的二抗及荧光二抗购自武汉博士德生物公司，其余均为国产分析纯试剂。3111型恒温CO2培养箱购自美国Thermo公司，IX71型倒置相差显微镜购自日本Olympus公司，Axio ObserverZI型荧光显微镜购自德国Carl Zeiss公司，Hitachi-7500透射电镜购自日本Hitachi公司。
1.2 细胞培养、分组及药物处理鼠神经瘤母细胞株Neuro-2a购自中国科学院上海生命科学研究院细胞资源中心。细胞培养于含10%胎牛血清的MEM+DMEM高糖培养基中，在37℃、5% CO2培养箱中培养，每2 d更换1次培养基，取对数生长期细胞用于实验。细胞被分为空白对照组、20μmol/L Aβ25-35处理组(Aβ25-35组)、20μmol/L Aβ25-35+100μmol/L NaHS处理组(Aβ25-35+ NaHS组)、20μmol/L Aβ25-35+5μmol/L 3-MA处理组(Aβ25-35+ 3-MA组)、100μmol/L NaHS处理组(NaHS组)及20μmol/L Aβ25-35+100μmol/L NaHS+20μmol/L LY294002处理组(Aβ25-35+ NaHS+ LY294002组)。3-MA及NaHS预处理2 h后加用Aβ25-35继续处理24 h，LY294002在Aβ25-35处理前0.5 h加入。Aβ25-35在使用前置于37℃孵箱中孵育7 d，以获得凝聚态Aβ25-35。Aβ25-35及NaHS的合适工作浓度通过参考文献[8]及前期预实验确定。
1.3 MTT法检测细胞存活率取对数生长期的细胞，以5×103/孔的密度种植至96孔细胞培养板中，贴壁分化后各组分别加入各试剂孵育，24 h后每孔加入10μL的MTT试剂，37℃避光孵育4 h后加入100μL DMSO，15 min后于ELx800多功能酶标仪(BioTek)上测定光密度值，设定波长为560 nm。扣除空白孔中本底的光密度值后，以各处理组与空白对照组的比值表示相对细胞存活率。独立实验重复3次。
1.4 蛋白质印迹法检测相关蛋白表达取对数生长期的细胞，加入蛋白提取裂解液和蛋白酶抑制剂后，在冰上放置30 min，然后4℃条件下14 000×g离心10 min。BCA法测定蛋白浓度，取等量总蛋白与5×SDS上样缓冲液混合，95℃变性5 min，行SDS-PAGE后将蛋白转移至PVDF膜上，5%脱脂奶粉封闭1~2 h，膜孵育一抗(1∶1 000)4℃过夜。TBST洗涤3次，37℃孵育相应二抗(1∶1 000)2 h，于VILBER FUSION FX7 Spectra凝胶成像分析系统上检测并分析蛋白条带。
1.5 免疫荧光检测LC3表达细胞接种于96孔板，经药物处理24 h后，4%多聚甲醛固定共培养的细胞，PBS冲洗，5%山羊血清封闭30 min，加入抗LC3抗体后4℃孵育过夜。PBS冲洗后，加入荧光二抗，37℃避光孵育2 h，DAPI染色后荧光显微镜下观察。
1.6 透射电镜法观察自噬体的形成细胞经药物处理后，用胰酶消化并收集细胞，于4℃离心5 min，弃上清，将标本经2.5%戊二醛固定过夜，加入1%四氧化锇后再次固定2 h。乙醇逐级脱水，环氧树脂包埋。应用切片机切成超薄切片，1%水化醋酸铀和枸橼酸铅染色。于Hitachi-7500透射电镜下观察细胞内自噬体的形成及分布。
1.7 统计学处理所有数据采用SPSS 17.0软件进行统计分析，数据以±s表示，组间比较采用LSD法。检验水准(α)为0.05。
2 结果 2.1 NaHS对Aβ25-35处理后细胞存活率的影响细胞活力检测结果(图 1)显示，与空白对照组相比，Aβ25-35组细胞存活率降低(P < 0.05);而经自噬抑制剂3-MA处理后，细胞存活率增加(P < 0.05)，说明自噬可能是Aβ25-35引起细胞损伤的原因之一。NaHS组细胞存活率与空白对照组相比未见明显差异，而Aβ25-35+NaHS组细胞存活率与Aβ25-35组相比升高(P < 0.05)。表明100μmol/L NaHS无细胞毒作用，且可以改善Aβ25-35引起的细胞损伤。
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图 1 MTT法检测Neuro-2a细胞活性 Fig 1 Viability of Neuro-2a cells was detected by MTT assay in each group |
2.2 NaHS对Aβ25-35引起的自噬的影响
20μmol/L Aβ25-35作用细胞24 h后，Beclin-1的表达及LC3-Ⅱ/ LC3-Ⅰ比值均高于空白对照组，P62表达低于空白对照组(P < 0.05)；加入3-MA后Beclin-1及LC3-Ⅱ的表达被抑制，表明Aβ25-35能诱导自噬发生；而NaHS组与正常对照组相比无明显改变。与Aβ25-35组相比，Aβ25-35+ NaHS组Beclin-1表达及LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ比值降低，P62表达增高(P < 0.05, 图 2)。上述结果表明外源性H2S可以降低Aβ25-35引起的自噬活性，但其对自噬的抑制强度弱于3-MA。
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图 2 蛋白质印迹法检测Beclin-1、LC3及P62的表达 Fig 2 Expression of Beclin-1, LC3 and P62 proteinwas determined by Western blotting analysis in each group |
2.3 细胞免疫荧光观察LC3的表达和分布
用荧光标记的抗LC3抗体染色后，在荧光显微镜下观察代表自噬体的荧光斑点，结果在空白对照组细胞质内可观察到散在斑点状结构(图 3A)；Aβ25-35作用细胞后，胞质内斑点状结构明显增多，且簇集融合呈斑块状(图 3B)，表明自噬体增多；3-MA抑制自噬后自噬斑点明显减少(图 3C)。而经NaHS干预后，胞质中荧光斑点较Aβ25-35组减少(图 3D)，说明外源性H2S能抑制Aβ25-35引起的自噬活化。
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图 3 免疫荧光法观察细胞内LC3的表达和分布 Fig 3 Expression and distribution of LC3 by immunofluorence in cells of each group |
2.4 透射电镜下观察自噬体的变化
透射电镜下空白对照组细胞中可见细胞核、线粒体等正常细胞器形态，未见自噬体(图 4A)。Aβ25-35组细胞内可见特征性的双层膜结构自噬体，内含待降解细胞器成分(图 4B)；而Aβ25-35+3-MA组及Aβ25-35+NaHS组细胞内自噬体数量较Aβ25-35组明显减少(图 4C、4D)。
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图 4 透射电镜下观察自噬体的形成 Fig 4 Autophagosome formation under transmission electron microscope |
2.5 NaHS对PI3K/Akt/mTOR通路的影响
蛋白质印迹结果表明，与空白对照组相比，Aβ25-35组细胞中p-Akt/Akt及p-mTOR/mTOR比值降低，p-Akt及p-mTOR的表达减少(P < 0.05)；而Aβ25-35+ NaHS组细胞p-Akt/Akt及p-mTOR/mTOR比值较Aβ25-35组均升高(P < 0.05)，但仍未恢复到正常水平(图 5)。当Aβ25-35、NaHS与PI3K/Akt通路特异抑制剂LY294002共孵育细胞时，NaHS对p-Akt及p-mTOR的活化作用被LY294002抑制(P < 0.05，图 5)；而NaHS对LC3-Ⅱ表达的降低作用也受到LY294002抑制(P < 0.05，图 6)。上述结果提示外源性H2S可能通过活化PI3K/Akt/mTOR通路来抑制Aβ25-35引起的自噬。
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图 5 蛋白质印迹法检测p-Akt及p-mTOR的表达 Fig 5 Expression of p-Akt and p-mTOR was measured by Western blotting analysis in each group |
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图 6 蛋白质印迹法检测LC3的表达 Fig 6 Expression of LC3 was measured by Western blotting analysis in each group |
3 讨论
Aβ25-35是Aβ-40和Aβ1-42的核心片段，具有片段小、易合成、毒性强、更容易透过细胞膜等特点[9]，是研究Aβ毒性作用的常用片段。既往研究通过免疫染色法发现，Aβ及其产生途径中的关键酶和肽段存在于神经元自噬溶酶体中，提示自噬体可能是Aβ产生的场所[10]。此外，在早期阿尔茨海默病患者的脑组织中发现Beclin-1蛋白的表达是降低的，在体外培养的神经元和小鼠在体实验中，过表达或沉默Beclin-1也可引起Aβ表达水平的改变[11]。这些研究表明，自噬与Aβ的病理作用密切相关。
本实验结果显示，Aβ25-35降低了细胞存活率，同时诱导自噬蛋白表达增加；而自噬抑制剂3-MA能降低自噬活性，并改善细胞活力，说明Aβ25-35诱导的自噬介导了细胞损伤。有研究者通过向正常小鼠海马中注入Aβ25-35，2周后通过透射电镜发现大量堆积的自噬囊泡，表明毒性Aβ蛋白可以过度活化自噬[12-13]，而自噬活性的改变可以损伤溶酶体中底物的降解，引起溶酶体膜通透性增加，组织蛋白酶释放；也可损伤线粒体自噬引起坏死线粒体堆积，线粒体膜通透性增加，最终致神经细胞死亡[14]。
H2S具有重要的生物活性，在体内主要以H2S气体形式和NaHS形式存在，并形成动态平衡。而NaHS溶液较气体H2S更容易确定浓度，方便实验操作，常作为H2S的供体应用于实验[15]。体内外研究证实, H2S对细胞凋亡[16]、炎性损伤[17-18]、氧化应激[8]等均有调节作用。在一项心肌缺血再灌注损伤的动物模型研究中，研究者发现H2S可以通过重建自噬流保护心肌缺血再灌注损伤[19]。Zhang等[20]研究发现H2S可以抑制自噬活性从而对创伤后的脑损伤起到保护作用，表明H2S可能对自噬具有调节作用。自噬是将细胞内长寿命蛋白、受损细胞器等物质转运到溶酶体进行降解并重新利用的生物过程，它区别于蛋白酶体，后者只能降解蛋白质[21]。自噬发生时，Beclin-1、LC3及P62蛋白分别参与了自噬的起始、延长、降解等阶段。其中，LC3是自噬活性的标志蛋白，胞质型LC3-Ⅰ经酶解转化为膜型LC3-Ⅱ，其转化比值可反映自噬水平。P62是一种受体蛋白，介导细胞选择性自噬，其表达水平与自噬活性呈负相关[22]。我们前期实验发现，100μmol/L的外源性H2S对细胞保护作用最为明显，这与既往研究报道哺乳动物脑内H2S的生理浓度约为50～160μmol/L相一致[23]。本实验用100μmol/L NaHS预处理细胞后，Beclin-1表达及LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ比值降低，P62表达增高，说明Aβ25-35引起的自噬活化被抑制。
既往实验发现，Aβ25-35可以下调PI3K/Akt/mTOR信号通路[24]，而H2S可以通过活化PI3K/Akt通路减少Aβ的产生[25]。PI3K/Akt被认为是细胞内最重要的抗凋亡、促存活的信号转导通路。PI3K家族包括PI3K-Ⅰ、-Ⅱ和-Ⅲ，其中PI3K-Ⅰ和PI3K-Ⅲ分别参与了抑制和促进自噬[26]；mTOR是自噬调控的关键蛋白，其活化后可以抑制自噬起始分子的功能，从而负性调节自噬的活性；Akt是PI3K的下游效应分子，它的激活可促使mTOR活化，可能是联系促细胞生存信号通路与自噬抑制通路的关键蛋白[27]。Aβ25-35导致PI3K/Akt/mTOR通路失活，从而启动自噬过程，改变细胞内的各种能量代谢过程[11]。本研究显示外源性H2S能具有上调p-Akt和p-mTOR的表达，改善Aβ25-35对PI3K/Akt/mTOR通路的抑制作用，而PI3K/Akt/mTOR特异抑制剂LY294002可以部分地阻断外源性H2S对该通路及自噬活性的调节作用，表明外源性H2S抑制Aβ25-35引起的自噬性死亡可能与活化PI3K/Akt/mTOR信号转导通路有关。近期一项针对心肌纤维化的动物实验也证实了H2S具有上调PI3K/Akt通路抑制自噬的作用[28]。
本实验探讨了外源性H2S对Aβ25-35诱导的自噬性细胞死亡的影响，结果发现Aβ25-35下调PI3K/Akt/mTOR信号通路，导致细胞损伤；而外源性H2S通过上调PI3K/Akt/mTOR细胞信号通路使自噬保持低水平状态，从而具有细胞保护作用。下一步研究将通过调节内源性H2S表达及在体实验进一步验证上述结果。
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