骨关节炎(osteoarthritis，OA)是临床常见的一种退变性疾病，它不仅影响患者的关节功能及生活质量，也严重影响整个社会健康水平^[1-2]。关节软骨退变和软骨缺损为OA的主要病理改变，在软骨缺损区重建透明软骨、实现关节软骨的功能是治疗该疾病的难点^[3]。用组织工程的方法可在缺损区形成真正的透明软骨，实现关节软骨功能，其中将滑膜间充质干细胞(synovium-derived stem cells，SDSCs)作为种子细胞来修复软骨缺损是目前研究的主流方向^[4-7]。该方法首先在体外培养SDSCs并进行软骨诱导分化，然后植入OA关节的软骨缺损区，诱导分化后的细胞将会受到周围关节液的影响。目前研究证明，急性膝关节损伤的关节液可促进软骨形成，而慢性损伤的关节液对软骨形成起抑制作用^[8]。OA是关节表面退行性疾病，关节液中含有多种炎症介质和细胞因子。本研究采用体外实验，将OA关节液加入诱导后SDSCs的培养液中，模拟体内的OA关节环境，观察OA关节液对SDSCs的软骨分化能力的影响，进一步验证SDSCs作为修复OA关节软骨缺损的种子细胞的可能性。

选取因膝关节OA Ⅳ期行膝关节置换的病例12例，其中男4例，女8例，平均年龄(64.4±5.1)岁。术前向患者交代实验目的，所有入选患者均签署知情同意书。保存手术中切除的滑膜组织标本，并抽取关节液备用。将标本置入加有PBS的培养皿中，剪除脂肪和结缔组织，分离出滑膜组织，用PBS冲洗3次。用小组织剪将滑膜片剪成1~2 mm大小的小碎块后移入直径为35 mm的培养皿中，加入Ⅰ型胶原酶(0.4 g/100 mL，Biosharp)4 mL，在37℃、5%CO₂培养箱中消化4 h。将组织消化液经120目尼龙网(70 μm)过滤，用移液管将过滤液移入离心管中，560×g离心10 min后弃去上清液。获得的细胞用PBS重悬，560×g离心10 min，重复3次，弃去含胶原酶的上清液。使用含10%胎牛血清(FBS，Hyclone)的DMEM培养液培养细胞，在37℃、5%CO₂培养箱中培养24 h，弃去未贴壁细胞，贴壁细胞即为原代SDSCs。继续培养约7 d，用0.05%胰蛋白酶-0.02%EDTA消化后进行传代培养。

取培养后第4代SDSCs，弃去原有培养液，用PBS漂洗2次，加入1 mL 0.25%胰蛋白酶。镜下观察，当细胞稍微变圆时，加入含血清培养液终止反应，离心收集细胞；加入固定液，重悬细胞，摇床摇动30 min，离心收集细胞，PBS漂洗2次，去除多余固定液；最后用PBS重悬细胞，使细胞密度达到1×10⁷/mL。流式管中加入带有FITC或PE标记的CD44、CD45、CD90、CD105抗体(均购自eBioscience)，冰上孵育30 min，离心收集细胞，小心吸尽上清，PBS漂洗2次。用1%多聚甲醛 500 μL 重悬细胞，上流式细胞仪检测。

配制诱导培养液：高糖DMEM培养液(Gibco)+100 mg/mL丙酮酸钠+40 mg/mL脯氨酸+50 mg/mL抗坏血酸+100 mmol/L地塞米松+10 ng/mL转化生长因子β₃(TGF-β₃)+1 mg/mL牛血清白蛋白+10% FBS。选择生长状态良好的第4代SDSCs，PBS清洗2次，加入0.25%的胰蛋白酶消化，室温消化1 min左右；加入DMEM完全培养液终止反应，收集细胞混合液，560×g离心3 min。离心后去上清，加入1 mL的DMEM完全培养液，重悬细胞，制成细胞悬液，并进行计数。以8×10⁵个细胞/管将细胞接种至15 mL离心管中，672×g离心3 min，去上清，加入成软骨诱导液5 mL。同时再以1×10⁵个细胞每孔将细胞接种至24孔板中，培养诱导，待细胞贴壁后(此时细胞密度达70%)，加入成软骨诱导液1 mL，每3 d换液1次，诱导21 d。将成软骨诱导分化21 d所得组织经4%甲醛溶液固定，常规脱水，石蜡包埋，切片厚度4 μm，进行阿利辛兰染色和番红O染色，显微镜下观察。

第4代SDSCs经成软骨诱导分化21 d后，分为实验组和对照组。将实验组中5%的培养液更换为OA关节液，每3 d换液1次，处理16 d；对照组不更换含OA关节液的培养液，其余同实验组。

测量两组细胞团培养形成的软骨小球的最大直径和最小直径，取其平均值作为软骨小球直径。

采用实时定量PCR检测两组成软骨相关基因COL Ⅱ、Aggrecan、SOX9 mRNA的表达。提取细胞总RNA，用SuperScript^TM试剂盒(Invitrogen)合成cDNA。引物序列COL Ⅱ： F 5′-CAA GAA CAG CAT TGC CTA TCT G-3′，R 5′-CCA TCC TTC AGG GCA GTG TA-3′;SOX9： F 5′-TAA AGG CAA CTC GTA CCC AAA T-3′，R 5′-GTC CAG TTT CTC GTT GAT TTC G-3′; Aggrecan： F 5′-CAC CTA CAA ACG CAG ACT ACA GA-3′，R 5′-AAA GCG ACA AGA AGA GGA CAC C-3′; β-actin： F 5′-CTT AGT TGC GTT ACA CCC TTT CTT G-3′，R 5′-CTG TCA CCT TCA CCG TTC CAG TTT-3′。实时定量PCR反应体系：SYBR Green PCR Master Mix 21 μL，上游引物和下游引物各1 μL，cDNA模板2 μL。利用Exicycler^TM 96荧光定量仪(韩国BIONEER公司)进行荧光定量分析。

采用蛋白质印迹法检测关节软骨标志性蛋白COL Ⅱ、Aggrecan、SOX9蛋白的表达。用NP-40裂解液(碧云天生物技术研究所)裂解细胞，提取蛋白质，BCA蛋白浓度测定试剂盒(碧云天生物技术研究所)定量。行SDS-PAGE，转膜，脱脂奶粉封闭。加入一抗(COL Ⅱ、Aggrecan抗体购自Santa Cruz,SOX9抗体购自Abcam,β-actin抗体购自康成生物工程有限公司)孵育，加入二抗孵育。ECL化学发光染色。

采用SPSS 11.0软件对各组数据进行统计学分析。结果以x±s表示，采用两样本均数比较的t检验比较两组之间的差异，检验水准(α)为0.05。

采用流式细胞术鉴定第4代SDSCs的相关表面标记物CD44、CD45、CD90、CD105，结果显示CD45阴性，CD44、CD90、CD105阳性，与SDSCs的特点相符(图 1)。经成软骨诱导后，细胞团逐渐变大，形成透明样软骨小球，阿利辛兰染色可见细胞外基质中的蛋白聚糖被染成深蓝色(图 2A)，番红O染色显示细胞外基质中的蛋白聚糖被染成红色(图 2B)，表明本研究分离培养的SDSCs具备成软骨分化能力。

图 1 流式细胞术显示滑膜间充质干细胞(SDSCs)表面CD45阴性，CD44、CD90、CD105阳性

图 2 滑膜间充质干细胞(SDSCs)成软骨诱导后阿利辛兰染色(A)和番红O染色(B)结果

实验组成软骨诱导生成的软骨小球经OA关节液处理16 d后，肉眼观察发现其直径大于对照组，而且形状更规则，表面更光滑。经测量，实验组软骨小球直径大于对照组(P<0.05，图 3)。

图 3 两组软骨小球肉眼观及直径的比较 *P<0.05与对照组比较. n=6,x±s

实时定量PCR结果显示，实验组细胞经OA关节液处理16 d后，其关节软骨常用标志性基因COL Ⅱ、Aggrecan、SOX9 mRNA的表达高于对照组(P<0.05，图 4A₁~4A₃)；蛋白质印迹结果与此一致(图 4B₁~4B₃)。说明OA关节液促进了COL Ⅱ、Aggrecan、SOX9的合成，对SDSCs的软骨形成能力有促进作用。

图 4 两组细胞COL Ⅱ、Aggrecan、SOX9 mRNA和蛋白的表达 A1~A3： 实时定量PCR检测mRNA表达； B1~B3： 蛋白质印迹分析检测蛋白表达. *P<0.05与对照组比较. n=6,x±s

OA患者的关节液中含有多种成分，包括多种基质成分(如糖胺聚糖、硫酸软骨素、透明质酸等)、结晶(如焦磷酸钙盐、磷灰石)及多种细胞因子和炎症因子^[9-10]。研究表明，有些细胞因子及炎症因子可对SDSCs的软骨分化能力起到促进作用。TGF具有诱导SDSCs向软骨细胞分化、合成软基质的作用，可提高COL Ⅱ的合成；胰岛素样生长因子同样有促进SDSCs软骨分化的作用，而且与TGF联合应用，其促进作用大于两种因子的单独使用，可以产生更多的透明软骨细胞外基质成分糖胺聚糖^[11]。骨形态发生蛋白(BMP)家族中的BMP-2和BMP-7对SDSCs软骨分化的促进作用大于TGF-β₁，其中BMP-7和TGF-β₁的协同应用可提高SDSCs的软骨分化能力^[12]。

本研究结果显示，采用OA关节液处理的实验组软骨小球直径大于对照组，而且实验组形成的软骨小球形状比对照组更加规则、表面更加光滑，说明OA关节液有促进SDSCs软骨分化后软骨基质合成的作用；实验组细胞表面COL Ⅱ、Aggrecan、SOX9 3种透明软骨标志性基因的表达量及蛋白的合成量明显高于对照组，说明OA关节液有上调COL Ⅱ、Aggrecan、SOX9 3种基因表达及蛋白合成的作用，进一步证明OA关节液能够促进SDSCs软骨形成。以上实验结果说明OA关节液有促进SDSCs软骨分化的作用，提示SDSCs可作为修复OA关节软骨缺损的种子细胞。但OA关节液中含有各种成分和因子，其促进SDSCs软骨分化的机制可能较为复杂，有待深入研究。