甲状腺相关性眼病(thyroid-associated ophthalmopathy，TAO)是一种以炎症反应紊乱为特征的器官特异性自身免疫性疾病^[1]，与Graves病(Graves disease,GD)密切相关，是GD最常见、最重要的甲状腺外器官损害。TAO活动期主要病理特征为眼外肌和球后结缔组织中大量淋巴细胞浸润，其中大多数为CD4⁺T细胞，其次为CD8⁺T细胞，并伴随少量B细胞、巨噬细胞等浸润，提示T淋巴细胞在TAO发病中起重要作用^[2]。程序性死亡蛋白1(programmed death-1，PD-1)属于负性共刺激分子，主要表达在活化的CD4⁺、CD8⁺T细胞表面，它通过与其配体结合从而发挥负性调控T细胞的活化及维持免疫耐受的作用^[3]。Newby等^[4]对英国高加索人群进行单核苷酸多态性(single nucleotide polymorphism，SNP)检测后发现，PD-1基因的多态性可能与GD发病相关，但是关于PD-1在TAO中的表达及其意义尚不明确。本研究通过观察TAO患者外周血单个核细胞(peripheral blood mononuclear cell，PBMC)中CD4⁺、CD8⁺T细胞百分比和细胞表面PD-1表达水平的改变及其与病程、实验室指标、疾病活动性、疾病严重程度之间的关系，初步探讨PD-1在TAO发病机制中的意义与诊断价值。

TAO组：2015年3月至2015年10月在第二军医大学长征医院内分泌科初诊住院的TAO患者，均符合Bartlay诊断标准，根据EUGOGO标准^[5]进行临床活动性评分(CAS评分)及严重程度分级。GD组：同期经本院门诊初诊且未接受药物治疗的GD患者，临床诊断符合美国甲状腺学会标准，眼眶MRI排除眼部改变。健康对照组：同期在本院体检的健康者。3组人群在采集血标本前3个月内均未接受过免疫抑制剂和糖皮质激素的治疗，且排除其他自身免疫性疾病、过敏性疾病和严重感染等情况；育龄女性尿妊娠试验阴性。本研究经第二军医大学长征医院医学伦理委员会批准，所有受试者均签署知情同意书。

TAO活动性临床评分标准(EUGOGO CAS评分，7分法)：(1) 自发性眼球疼痛；(2) 眼球凝视时疼痛；(3) 眼睑水肿；(4) 眼睑红斑；(5) 结膜充血；(6) 球结膜水肿；(7) 肉阜肿胀。上述每项临床表现积1分，CAS评分≥3分为TAO疾病活动期。TAO严重程度分级标准(EUGOGO)：(1) 轻度，即眼睑挛缩＜2 mm，轻度软组织受累，眼球突出度＜25 mm，无或一过性复视，无角膜外露或视神经受累；(2) 中重度，即眼睑挛缩≥2 mm，或中重度软组织受累，或眼球突出度≥25 mm，或持续性、非持续性复视，或角膜轻度外露，无视神经受累；(3) 威胁视力，即重度角膜外露或视神经受累。

FITC标记的抗人CD4、CD8a抗体、PE标记的抗人PD-1抗体均购自美国eBioscience公司，人淋巴细胞分离液购自美国CEDARLANE公司，Accuri C6流式细胞仪购自美国BD公司。人游离三碘甲状腺原氨酸(FT3)、游离甲状腺素(FT4)、促甲状腺激素(TSH)检测试剂盒(电化学发光法)及人促甲状腺素受体抗体(TRAb)、过氧化物酶抗体(TPOAb)、甲状腺球蛋白抗体(TgAb)检测试剂盒(电化学发光法)和Cobas E601型全自动电化学发光免疫分析仪均购自德国Roche公司。

EDTA-K₂抗凝管收集各组受试者清晨空腹状态下外周静脉血2 mL，加入2 mL PBS稀释，轻轻混匀后加到预先加有4 mL人淋巴细胞分离液的离心管上层，2 560×g离心10 min。取中间白膜层(即PBMC层)，PBS清洗3次，加入1 mL含1%胎牛血清的RPMI1640培养基重悬细胞，即得PBMC悬液。

对PBMC悬液进行细胞计数，PBS稀释，调整待测细胞密度为10⁶/mL。取200 μL细胞悬液，853×g离心5 min(4℃)，取沉淀用预冷PBS 1 mL润洗2次，重悬于100 μL PBS；分别加入相应的抗体5 μL，轻轻混匀，4℃避光孵育1~2 h，同时以不加抗体作为阴性对照。2 560×g离心10 min，弃上清，沉淀加入200 μL PBS重悬，用流式细胞仪进行检测。

使用FT3、FT4、TSH、TRAb、TPOAb、TgAb电化学发光法检测试剂盒，严格按照试剂盒说明书操作，用第二军医大学长征医院生化实验室Cobas E601型全自动电化学发光免疫分析仪进行检测。

采用SPSS 16.0软件完成所有统计分析。计量资料采用x±s描述，分类变量以百分率(%)描述。计量资料的组间比较，如果数据资料为正态分布且方差齐采用方差分析或t检验，否则采用秩和检验；计数资料的组间比较采用χ²检验。为了控制混杂因素的影响应用偏相关进行分析，采用Pearson法进行相关性分析。检验水准(α)为0.05。

TAO组患者21例，GD组患者21例，健康对照组受试者20例，3组人群性别构成、年龄、眼病病程、吸烟情况、甲状腺功能、甲状腺相关抗体水平等见表 1。3组组间性别构成、年龄、吸烟情况比较差异均无统计学意义(P>0.05)，具有可比性。TAO组与健康对照组受试者之间眼病病程、FT3、TSH、TRAb、TPOAb水平差异有统计学意义(P<0.05)；GD组与健康对照组之间FT3、FT4、TSH、TRAb、TPOAb、TGAb水平差异均有统计学意义(P<0.05)；TAO组与GD组之间眼病病程、FT3、FT4、TSH、TPOAb、TGAb水平差异有统计学意义(P<0.05)。

表 1 (Tab 1)

表 1 3组研究对象基线特征比较 Tab 1 Baseline characteristic of the participants in three groups General data Healthy volunteer group N=20 GD group N=21 TAO group N=21 Age (year)，x±s 44.9±12.4 41.5±15.7 44.8±12.7 Female n(%) 12(60.0) 16(76.2) 16(76.2) Smoking n(%) 7(35.0) 5(23.8) 4(19.0) Duration of TAO t/month，x±s 0 0 27±52*△ FT3 cB/(pmol·L-1)，x±s 4.40±0.72 18.71±11.81* 11.54±13.06*△ FT4 cB/(pmol·L-1)，x±s 16.02±1.92 46.73±22.21* 31.42±31.07△ TSH zB/(mIU·L-1)，x±s 1.94±0.99 0.01±0.01* 5.07±19.25*△ TRAb zB/(IU·L-1)，x±s 0.45±0.21 12.31±12.15* 14.94±12.46* TPOAb zB/(IU·L-1)，x±s 12.95±7.46 302.21±226.73* 108.97±193.19*△ TGAb zB/(IU·mL-1)，x±s 32.62±25.47 473.25±643.12* 570.43±1 225.28△ GD: Graves disease; TAO: Thyroid-associated ophthalmopathy; FT3: Free 3,5,3-triiodothyronine; FT4: Free thyroxine; TSH: Thyroid stimulating hormone; TRAb: Thyroid-stimulating hormone receptor antibody; TPOAb: Anti-thyroperoxidase antibody; TGAb: Anti-thiyroglobulin antibody. *P<0.05 vs healthy volunteer group; △P<0.05 vs GD group

表 1 3组研究对象基线特征比较 Tab 1 Baseline characteristic of the participants in three groups

TAO组患者PBMC中CD4⁺、CD8⁺T细胞所占百分比分别为(35.9±14.5)%、(22.2±8.4)%，GD组分别为(33.1±13.1)%、(18.6±9.2)%，均高于健康对照组[(17.4±7.4)%、(7.7±4.8)%]，差异有统计学意义(P<0.01)；TAO组与GD组之间差异无统计学意义(P>0.05，图 1)。

图 1 3组受试者PBMC中CD4+、CD8+T细胞百分比 Fig 1 Proportions of CD4+,CD8+T cells of PBMC in three groups

TAO组和GD组患者PBMC中CD4⁺T细胞表面PD-1的表达率分别为(8.3±6.4)%和(28.0±26.6)%，均低于健康对照组[(52.2±28.6)%]，且TAO组低于GD组，差异均有统计学意义(P<0.01，P<0.05)。TAO组和GD组患者PBMC中CD8⁺T细胞表面PD-1的表达率为(12.7±13.4)%，低于健康对照组[(38.2±24.2)%]，差异有统计学意义(P<0.01)；GD组为(26.6±23.2)%，与TAO组及健康对照组之间差异均无统计学意义(P>0.05，图 2)。

图 2 3组受试者PBMC中CD4+、CD8+T细胞表面PD-1的表达率 Fig 2 PD-1 expression in CD4+,CD8+T cells of PBMC in three groups

3组受试者PBMC中CD4⁺、CD8⁺T细胞百分比及其表面PD-1表达率与其病程、甲状腺功能和甲状腺相关抗体水平之间的相关性采用偏相关分析，结果(表 2)显示，3组受试者PBMC中CD4⁺、CD8⁺T细胞百分比及其表面PD-1表达率与其病程、FT3、FT4、TSH、TRAb、TPOAb及TGAb水平均无相关性(P>0.05)。

表 2 (Tab 2)

表 2 3组受试者PBMC中CD4+、CD8+T细胞及其表面PD-1表达率与病程、甲状腺功能、甲状腺相关抗体的偏相关分析 Tab 2 Partial correlation analysis between the proportions of CD4+,CD8+T cells in PBMC,PD-1 expression on cell surface in TAO patients and disease course,thyroid functions and levels of thyroid antibodies CD4+T cells CD4+PD-1+T cells CD8+T cells CD8+PD-1+T cells r P r P r P r P Duration of TAO －0.108 >0.05 0.002 >0.05 0.240 >0.05 0.023 >0.05 FT3 0.114 >0.05 －0.087 >0.05 0.011 >0.05 －0.132 >0.05 FT4 0.097 >0.05 －0.081 >0.05 －0.017 >0.05 －0.078 >0.05 TSH 0.042 >0.05 －0.049 >0.05 0.157 >0.05 －0.082 >0.05 TRAb 0.125 >0.05 －0.160 >0.05 0.071 >0.05 －0.150 >0.05 TPOAb 0.028 >0.05 －0.105 >0.05 0.051 >0.05 －0.107 >0.05 TGAb －0.041 >0.05 －0.041 >0.05 －0.092 >0.05 －0.047 >0.05 PBMC: Peripheral blood mononuclear cell; PD-1: Programmed death-1; TAO: Thyroid-associated ophthalmopathy； FT3: Free 3,5,3- triiodothyronine; FT4: Free thyroxine; TSH: Thyroid stimulating hormone; TRAb: Thyroid-stimulating hormone receptor antibody; TPOAb: Anti-thyroperoxidase antibody; TGAb: Anti-thiyroglobulin antibody

表 2 3组受试者PBMC中CD4+、CD8+T细胞及其表面PD-1表达率与病程、甲状腺功能、甲状腺相关抗体的偏相关分析 Tab 2 Partial correlation analysis between the proportions of CD4+,CD8+T cells in PBMC,PD-1 expression on cell surface in TAO patients and disease course,thyroid functions and levels of thyroid antibodies

TAO患者PBMC中CD8⁺T细胞百分比与患者病程呈正相关(r=0.478，P=0.028)，与甲状腺功能及甲状腺相关抗体无相关性(P>0.05)；CD8⁺T细胞表面PD-1表达率、CD4⁺T细胞百分比及其细胞表面PD-1表达率与患者病程、甲状腺功能和甲状腺相关抗体之间均无相关性(表 3)。

表 3 (Tab 3)

表 3 TAO患者PBMC中CD4+、CD8+T细胞及其表面PD-1表达率与病程、甲状腺功能、甲状腺相关抗体的相关性 Tab 3 Correlation analysis between the proportions of CD4+,CD8+T cells in PBMC,PD-1 expression on cell surface in TAO patients and desease course,thyroid functions and levels of thyroid antibodies CD4+T cells CD4+PD-1+T cells CD8+T cells CD8+PD-1+T cells r P r P r P r P Duration of TAO －0.083 >0.05 －0.049 >0.05 0.478 ＜0.05 －0.048 >0.05 FT3 －0.228 >0.05 －0.121 >0.05 －0.371 >0.05 －0.241 >0.05 FT4 －0.186 >0.05 －0.084 >0.05 －0.296 >0.05 －0.195 >0.05 TSH 0.117 >0.05 －0.282 >0.05 0.307 >0.05 －0.198 >0.05 TRAb －0.089 >0.05 －0.330 >0.05 －0.018 >0.05 －0.209 >0.05 TPOAb －0.053 >0.05 －0.265 >0.05 0.185 >0.05 －0.309 >0.05 TGAb －0.015 >0.05 －0.148 >0.05 －0.072 >0.05 0.048 >0.05 PBMC: Peripheral blood mononuclear cell; PD-1: Programmed death-1; TAO: Thyroid-associated ophthalmopathy；FT3: Free 3,5,3- triiodothyronine; FT4: Free thyroxine; TSH: Thyroid stimulating hormone; TRAb: Thyroid-stimulating hormone receptor antibody; TPOAb: Anti-thyroperoxidase antibody; TGAb: Anti-thiyroglobulin antibody

表 3 TAO患者PBMC中CD4+、CD8+T细胞及其表面PD-1表达率与病程、甲状腺功能、甲状腺相关抗体的相关性 Tab 3 Correlation analysis between the proportions of CD4+,CD8+T cells in PBMC,PD-1 expression on cell surface in TAO patients and desease course,thyroid functions and levels of thyroid antibodies

根据CAS评分结果将TAO患者分为2个亚组，其中活动期组10例、非活动期组11例，2组患者PBMC中CD4⁺、CD8⁺T细胞百分比及其表面PD-1表达率差异均无统计学意义(P>0.05，表 4)。根据TAO严重程度分级标准将TAO患者分为轻度组和中重度组2个亚组，其中轻度组11例、中重度组10例，2组患者PBMC中CD4⁺、CD8⁺T细胞百分比及其表面PD-1表达率差异也均无统计学意义(P>0.05，表 4)。

表 4 (Tab 4)

表 4 PBMC中CD4+、CD8+T细胞百分比及其表面PD-1表达率与TAO患者疾病活动性和严重程度的关系 Tab 4 Relationship between the proportions of CD4+,CD8+T cells in PBMC,PD-1 expression on cell surface and activity and severity of TAO CD4+T cells CD4+PD-1+T cells CD8+T cells CD8+PD-1+T cells CAS Active group n=10 34.5±13.3 9.6±7.3 22.3±9.2 8.4±7.5 Inactive group n=11 37.2±16.1 7.1±5.6 22.0±8.1 16.7±16.5 P 0.573 0.549 0.888 0.597 Severity Mild group n=11 35.3±14.2 7.6±6.4 21.5±8.7 14.6±14.9 Moderate-to-severe group n=10 35.3±15.6 9.3±6.6 22.4±8.9 12.2±12.9 P 0.849 0.621 0.970 1.000 TAO: Thyroid-associated ophthalmopathy; PBMC: Peripheral blood mononuclear cell; PD-1: Programmed death-1; CAS: Clinical activity score

表 4 PBMC中CD4+、CD8+T细胞百分比及其表面PD-1表达率与TAO患者疾病活动性和严重程度的关系 Tab 4 Relationship between the proportions of CD4+,CD8+T cells in PBMC,PD-1 expression on cell surface and activity and severity of TAO

TAO是一种具有潜在致盲性的严重眼眶疾病，多发生于GD患者或既往有GD病史的患者中，因此又称为Graves眼病(Graves ophthalmopathy，GO)^[6]。据报道GD患者中TAO患病率可高达25%~50%^[7]。两病在发病机制上有一定联系，存在共同抗原，由遗传、环境及免疫因素相互作用、共同致病^[8]。

目前普遍认为免疫因素在TAO的发病机制中占主导地位，其中以T细胞免疫为主，其免疫学基础是在TAO患者眼眶组织中发现大量CD4⁺T细胞浸润，其次为CD8⁺T细胞^[2]。浸润的T细胞活化后可释放干扰素(IFN)-γ、白介素(IL)-1β、IL-2、肿瘤坏死因子(TNF)-α等细胞因子及白细胞调节素，诱导眼眶成纤维细胞合成并释放透明质酸，参与TAO患者眼眶组织病理改变^[6]。同样，T细胞免疫在GD的发病中也具有重要作用^[9]。其中一个主要环节是抗原提呈细胞识别抗原并呈递给T细胞，T细胞活化后进一步增殖、分化为辅助性CD4⁺T细胞及细胞毒性CD8⁺T细胞，发挥分泌炎性因子及攻击靶细胞等作用，参与炎性反应及组织损伤^[10]。既往研究也发现GD患者外周血与甲状腺组织中CD4⁺、CD8⁺T细胞百分比升高^[11]，但有关TAO患者PBMC中CD4⁺、CD8⁺T细胞百分比改变的报道较少。本研究发现GD组患者PBMC中CD4⁺、CD8⁺T细胞百分比均高于健康对照组(P<0.01)，与以往研究相一致，进一步佐证PBMC中CD4⁺、CD8⁺T细胞的激活参与了GD的发病；而TAO组患者PBMC中CD4⁺、CD8⁺T细胞百分比也高于健康对照组(P<0.01)，且与GD组之间差异无统计学意义，提示TAO与GD存在相似的全身免疫紊乱状态。PBMC中CD4⁺、CD8⁺T细胞激活与TAO发病相关，其发挥作用的机制可能和GD相同，与目前普遍认同的两病存在共同自身免疫发病机制的学说相一致。该研究结果具有一定的临床意义，PBMC中CD4⁺、CD8⁺T细胞比值升高可作为TAO及GD疾病诊断的一个重要免疫学指标，提示患者的全身免疫紊乱状态。

TAO与GD在发病上虽然有相似的免疫机制，但并不是所有GD患者均发生TAO，而TAO也可发生在其他自身免疫性甲状腺疾病的患者中^[1]。因此，虽然TAO患者眼眶组织与GD发病过程中甲状腺病理改变之间存在联系，但是发病机制并不完全相同，TAO发病机制中可能有其独特的免疫学异常。为进一步探讨TAO与GD两病中T细胞免疫紊乱的特点，本研究对TAO与GD患者PBMC中CD4⁺、CD8⁺T细胞表面PD-1的表达率进行了检测。PD-1是近年发现的负性共刺激分子之一，主要在活化的T细胞表面表达，在B细胞及树突状细胞表面亦有表达。PD-1通过与其配体PD-L1、PD-L2结合，阻断T细胞增殖活化、减少细胞因子合成，但不增加细胞死亡，从而发挥免疫抑制作用^[12]。近年来，多项动物实验研究证实PD-1通路在阻断免疫反应中发挥重要作用^[3]，而基因组学研究发现人类某些种族人群PD-1基因SNP与其自身免疫性疾病高发风险相关^[12]，提示PD-1在自身免疫性疾病中具有重要作用。本研究结果显示TAO组及GD组患者PBMC中CD4⁺T细胞表面PD-1的表达率、TAO组患者PBMC中CD8⁺T细胞表面PD-1的表达率低于健康对照组，提示PD-1表达异常可能是TAO及GD的发病机制之一。缺乏PD-1的负性调控作用，外周血T细胞“逃逸”免疫耐受而过度活化增殖，对自身抗原产生持续的免疫应答，通过释放炎性因子和增强细胞溶解作用促进炎症反应的发生，导致机体组织损伤；其中TAO患者CD4⁺、CD8⁺T细胞均参与致病过程，而GD患者以CD4⁺T细胞免疫为主。同时，TAO组患者PBMC中CD4⁺、CD8⁺T细胞表面PD-1的表达率低于GD组，其中CD4⁺T细胞表面PD-1的表达率差异有统计学意义(P<0.05)，提示TAO患者CD4⁺T细胞生物学活性更强，自身免疫紊乱可能更严重、更持久。PBMC中CD4⁺T细胞表面PD-1表达率的下调水平可以作为鉴别TAO和GD的一项参考指标。

此外，在对TAO组进行相关性分析时发现，TAO组患者PBMC中CD8⁺T细胞百分比与患者病程呈正相关，提示随着TAO患者病程的延长，其PBMC中CD8⁺T细胞百分比增加，在细胞免疫中发挥的作用越大，尽早干预治疗可能有助于控制病情的发展。然而，TAO组患者CD4⁺、CD8⁺T细胞百分比及其表面PD-1的表达率与患者TAO疾病活动性及严重程度无明显相关，表明PD-1表达率不能作为TAO病情严重程度及活动性的指标。但以上结果尚需要大样本研究进一步证实。

本研究仍存在一定的局限性，研究检测的T细胞来源于患者外周血循环中，而TAO患者眼眶组织中浸润的T细胞在细胞来源及分布上均与外周血有所差异，且受不同微环境因素的影响，其表面共刺激分子的表达亦可能不同。下一步研究将检测TAO患者眼眶组织中浸润的CD4⁺、CD8⁺T细胞百分比及其表面PD-1的表达水平，进一步明确PD-1与TAO眼部病理改变机制之间的关系。

综上，本研究结果显示TAO患者PBMC中CD4⁺、CD8⁺T细胞百分比升高、其表面PD-1的表达下调，提示TAO患者PBMC中CD4⁺、CD8⁺T细胞百分比及其表面PD-1的表达参与TAO的自身免疫过程。PBMC中CD4⁺、CD8⁺T细胞百分比升高、CD4⁺T细胞表面PD-1表达率下调均可作为了解患者疾病状态的重要免疫学指标，对其深入研究将有助于我们进一步明确TAO的发病机制，为TAO疾病的治疗和预防提供新靶点。