第二军医大学学报  2016, Vol. 37 Issue (6): 704-710   PDF    
甲状腺相关性眼病患者外周血CD4+、CD8+T细胞百分比及细胞表面程序性死亡蛋白1表达的改变及其意义
夏晓玲, 汤玮, 孙亮亮, 倪奇, 刘浩琪, 陆晓敏, 孙政, 石勇铨     
第二军医大学长征医院内分泌科, 甲状腺相关眼病诊治中心, 上海 200003
摘要: 目的 观察甲状腺相关性眼病(TAO)患者外周血单个核细胞(PBMC)中CD4+、CD8+T细胞百分比及细胞表面程序性死亡蛋白1(PD-1)的表达水平,探索这两者变化在TAO发病机制及疾病诊断中的意义。 方法 收集21例TAO患者、21例Graves病(GD)无眼病患者及20例健康对照者资料,采用流式细胞术检测所有受试者PBMC中CD4+、CD8+T细胞百分比及其表面PD-1的表达率,比较组间差异,分析其与患者病程、甲状腺功能、甲状腺相关抗体及TAO疾病活动性和严重程度之间的关系。 结果 (1) TAO患者PBMC中CD4+、CD8+T细胞百分比分别为(35.9±14.5)%、(22.2±8.4)%,GD患者分别为(33.1±13.0)%、(18.6±9.2)%,均高于健康对照者[(17.4±7.4)%、(7.7±4.8)%,P<0.01]。(2) TAO及GD患者PBMC中CD4+T细胞表面PD-1表达率分别为(8.3±6.4)%、(28.0±26.6)%,均低于健康对照者[(52.2±28.6)%,P<0.01, P<0.05],且TAO患者低于GD患者(P<0.05);TAO患者PBMC中CD8+T细胞表面PD-1表达率低于健康对照者[(12.7±13.4)% vs (38.2±24.2)%,P<0.01]。(3) TAO患者PBMC中CD8+T细胞百分比与病程呈正相关(r=0.478,P<0.05)。(4) TAO患者活动期组与非活动期组、轻度组与中重度组间CD4+、CD8+T细胞百分比及其表面PD-1表达率差异均无统计学意义(P>0.05)。 结论 TAO患者PBMC中CD4+、CD8+T细胞百分比及细胞表面PD-1表达存在异常,可能参与TAO的自身免疫过程。
关键词: 甲状腺相关性眼病     Graves眼病     程序性死亡蛋白1     共刺激分子     自身免疫    
Changes of CD4+, CD8+ T cell proportions and cell surface programmed death-1 level in peripheral blood mononuclear cells of patients with thyroid-associated ophthalmopathy
XIA Xiao-ling, TANG Wei, SUN Liang-liang, NI Qi, LIU Hao-qi, LU Xiao-min, SUN Zheng, SHI Yong-quan     
Department of Endocrinology, Diagnosis and Treatment Center of Thyroid-Associated Ophthalmopathy, Changzheng Hospital, Second Military Medical University, Shanghai 200003, China
Abstract: Objective To observe the changes of CD4+, CD8+T cell proportions and the level of cell surface programmed death-1 (PD-1) in the peripheral blood mononuclear cells (PBMC) of patients with thyroid-associated ophthalmopathy (TAO), and to explore their roles in the pathogenesis and diagnosis of TAO. Methods The clinical data of 21 TAO patients, 21 Graves disease (GD) patients without ophthalmopathy and 20 healthy volunteers were collected. The proportions of CD4+, CD8+T cells in PBMCs and cell surface PD-1 expressions were tested by flow cytometry and were compared between different groups; and their correlation with disease course, thyroid functions, thyroid associated antibodies and severity of TAO were analyzed. Results (1) The proportions of CD4+, CD8+T cells in PBMCs of TAO patients ([35.9±14.5]% and [22.2±8.4]%, respectively) and GD patients ([33.1±13.0]% and [18.6±9.2]%, respectively) were both significantly higher than those in the healthy volunteers ([17.4±7.4]% and [7.7±4.8]% respectively, both P<0.01). (2) The expression of PD-1 on CD4+T cells in TAO and GD patients were (8.3±6.4)% and (28.0±26.6)%, respectively, with both being significantly lower than those in the healthy volunteers ([52.2±28.6]%, P<0.01 and P<0.05, respectively), and that in TAO patients was significantly lower than that in GD patients (P<0.05). The expression of PD-1 in CD8+T cells was significantly lower in TAO patients than that in the healthy volunteers ([12.7±13.4]% vs [38.2±24.2]%, P<0.01). (3) Correlation analysis showed that there was a positive correlation between disease course and CD8+T cell proportion in PBMCs of TAO patients (r=0.478, P<0.05). (4) There was no significant difference in CD4+,CD8+T cells proportions or their PD-1 expressions between active and inactive, mild and moderate-to-severe TAO patients (P>0.05). Conclusion The aberrant proportions of CD4+, CD8+T cells in PBMCs and cell surface PD-1 expression may participate in the autoimmune process of TAO.
Key words: thyroid-associated ophthalmopathy     Graves ophthalmopathy     programmed death-1     costimulatory molecules     autoimmunity    

甲状腺相关性眼病(thyroid-associated ophthalmopathy,TAO)是一种以炎症反应紊乱为特征的器官特异性自身免疫性疾病[1],与Graves病(Graves disease,GD)密切相关,是GD最常见、最重要的甲状腺外器官损害。TAO活动期主要病理特征为眼外肌和球后结缔组织中大量淋巴细胞浸润,其中大多数为CD4+T细胞,其次为CD8+T细胞,并伴随少量B细胞、巨噬细胞等浸润,提示T淋巴细胞在TAO发病中起重要作用[2]。程序性死亡蛋白1(programmed death-1,PD-1)属于负性共刺激分子,主要表达在活化的CD4+、CD8+T细胞表面,它通过与其配体结合从而发挥负性调控T细胞的活化及维持免疫耐受的作用[3]。Newby等[4]对英国高加索人群进行单核苷酸多态性(single nucleotide polymorphism,SNP)检测后发现,PD-1基因的多态性可能与GD发病相关,但是关于PD-1在TAO中的表达及其意义尚不明确。本研究通过观察TAO患者外周血单个核细胞(peripheral blood mononuclear cell,PBMC)中CD4+、CD8+T细胞百分比和细胞表面PD-1表达水平的改变及其与病程、实验室指标、疾病活动性、疾病严重程度之间的关系,初步探讨PD-1在TAO发病机制中的意义与诊断价值。

1 资料和方法 1.1 研究对象

TAO组:2015年3月至2015年10月在第二军医大学长征医院内分泌科初诊住院的TAO患者,均符合Bartlay诊断标准,根据EUGOGO标准[5]进行临床活动性评分(CAS评分)及严重程度分级。GD组:同期经本院门诊初诊且未接受药物治疗的GD患者,临床诊断符合美国甲状腺学会标准,眼眶MRI排除眼部改变。健康对照组:同期在本院体检的健康者。3组人群在采集血标本前3个月内均未接受过免疫抑制剂和糖皮质激素的治疗,且排除其他自身免疫性疾病、过敏性疾病和严重感染等情况;育龄女性尿妊娠试验阴性。本研究经第二军医大学长征医院医学伦理委员会批准,所有受试者均签署知情同意书。

1.2 TAO活动性及严重程度评价方法

TAO活动性临床评分标准(EUGOGO CAS评分,7分法):(1) 自发性眼球疼痛;(2) 眼球凝视时疼痛;(3) 眼睑水肿;(4) 眼睑红斑;(5) 结膜充血;(6) 球结膜水肿;(7) 肉阜肿胀。上述每项临床表现积1分,CAS评分≥3分为TAO疾病活动期。TAO严重程度分级标准(EUGOGO):(1) 轻度,即眼睑挛缩<2 mm,轻度软组织受累,眼球突出度<25 mm,无或一过性复视,无角膜外露或视神经受累;(2) 中重度,即眼睑挛缩≥2 mm,或中重度软组织受累,或眼球突出度≥25 mm,或持续性、非持续性复视,或角膜轻度外露,无视神经受累;(3) 威胁视力,即重度角膜外露或视神经受累。

1.3 主要仪器与试剂

FITC标记的抗人CD4、CD8a抗体、PE标记的抗人PD-1抗体均购自美国eBioscience公司,人淋巴细胞分离液购自美国CEDARLANE公司,Accuri C6流式细胞仪购自美国BD公司。人游离三碘甲状腺原氨酸(FT3)、游离甲状腺素(FT4)、促甲状腺激素(TSH)检测试剂盒(电化学发光法)及人促甲状腺素受体抗体(TRAb)、过氧化物酶抗体(TPOAb)、甲状腺球蛋白抗体(TgAb)检测试剂盒(电化学发光法)和Cobas E601型全自动电化学发光免疫分析仪均购自德国Roche公司。

1.4 实验方法 1.4.1 PBMC悬液的制备

EDTA-K2抗凝管收集各组受试者清晨空腹状态下外周静脉血2 mL,加入2 mL PBS稀释,轻轻混匀后加到预先加有4 mL人淋巴细胞分离液的离心管上层,2 560×g离心10 min。取中间白膜层(即PBMC层),PBS清洗3次,加入1 mL含1%胎牛血清的RPMI1640培养基重悬细胞,即得PBMC悬液。

1.4.2 PBMC中CD4+、CD8+ T细胞及其表面PD-1的流式检测

对PBMC悬液进行细胞计数,PBS稀释,调整待测细胞密度为106/mL。取200 μL细胞悬液,853×g离心5 min(4℃),取沉淀用预冷PBS 1 mL润洗2次,重悬于100 μL PBS;分别加入相应的抗体5 μL,轻轻混匀,4℃避光孵育1~2 h,同时以不加抗体作为阴性对照。2 560×g离心10 min,弃上清,沉淀加入200 μL PBS重悬,用流式细胞仪进行检测。

1.4.3 FT3、FT4、TSH与TRAb、TPOAb、TgAb的检测

使用FT3、FT4、TSH、TRAb、TPOAb、TgAb电化学发光法检测试剂盒,严格按照试剂盒说明书操作,用第二军医大学长征医院生化实验室Cobas E601型全自动电化学发光免疫分析仪进行检测。

1.5 统计学处理

采用SPSS 16.0软件完成所有统计分析。计量资料采用x±s描述,分类变量以百分率(%)描述。计量资料的组间比较,如果数据资料为正态分布且方差齐采用方差分析或t检验,否则采用秩和检验;计数资料的组间比较采用χ2检验。为了控制混杂因素的影响应用偏相关进行分析,采用Pearson法进行相关性分析。检验水准(α)为0.05。

2 结果 2.1 病例一般资料

TAO组患者21例,GD组患者21例,健康对照组受试者20例,3组人群性别构成、年龄、眼病病程、吸烟情况、甲状腺功能、甲状腺相关抗体水平等见表 1。3组组间性别构成、年龄、吸烟情况比较差异均无统计学意义(P>0.05),具有可比性。TAO组与健康对照组受试者之间眼病病程、FT3、TSH、TRAb、TPOAb水平差异有统计学意义(P<0.05);GD组与健康对照组之间FT3、FT4、TSH、TRAb、TPOAb、TGAb水平差异均有统计学意义(P<0.05);TAO组与GD组之间眼病病程、FT3、FT4、TSH、TPOAb、TGAb水平差异有统计学意义(P<0.05)。

表 1 3组研究对象基线特征比较 Tab 1 Baseline characteristic of the participants in three groups

2.2 3组人群PBMC中CD4+、CD8+T细胞百分比

TAO组患者PBMC中CD4+、CD8+T细胞所占百分比分别为(35.9±14.5)%、(22.2±8.4)%,GD组分别为(33.1±13.1)%、(18.6±9.2)%,均高于健康对照组[(17.4±7.4)%、(7.7±4.8)%],差异有统计学意义(P<0.01);TAO组与GD组之间差异无统计学意义(P>0.05,图 1)。

图 1 3组受试者PBMC中CD4+、CD8+T细胞百分比 Fig 1 Proportions of CD4+,CD8+T cells of PBMC in three groups

2.3 3组受试者PBMC和CD组CD4+、CD8+T细胞表面PD-1的表达

TAO组和GD组患者PBMC中CD4+T细胞表面PD-1的表达率分别为(8.3±6.4)%和(28.0±26.6)%,均低于健康对照组[(52.2±28.6)%],且TAO组低于GD组,差异均有统计学意义(P<0.01,P<0.05)。TAO组和GD组患者PBMC中CD8+T细胞表面PD-1的表达率为(12.7±13.4)%,低于健康对照组[(38.2±24.2)%],差异有统计学意义(P<0.01);GD组为(26.6±23.2)%,与TAO组及健康对照组之间差异均无统计学意义(P>0.05,图 2)。

图 2 3组受试者PBMC中CD4+、CD8+T细胞表面PD-1的表达率 Fig 2 PD-1 expression in CD4+,CD8+T cells of PBMC in three groups

2.4 3组受试者PBMC中CD4+、CD8+T细胞百分比及其表面PD-1表达率与病程、甲状腺功能及甲状腺相关抗体的关系

3组受试者PBMC中CD4+、CD8+T细胞百分比及其表面PD-1表达率与其病程、甲状腺功能和甲状腺相关抗体水平之间的相关性采用偏相关分析,结果(表 2)显示,3组受试者PBMC中CD4+、CD8+T细胞百分比及其表面PD-1表达率与其病程、FT3、FT4、TSH、TRAb、TPOAb及TGAb水平均无相关性(P>0.05)。

表 2 3组受试者PBMC中CD4+、CD8+T细胞及其表面PD-1表达率与病程、甲状腺功能、甲状腺相关抗体的偏相关分析 Tab 2 Partial correlation analysis between the proportions of CD4+,CD8+T cells in PBMC,PD-1 expression on cell surface in TAO patients and disease course,thyroid functions and levels of thyroid antibodies

2.5 TAO患者PBMC中CD4+、CD8+T细胞百分比及其表面PD-1表达率与患者病程、甲状腺功能及甲状腺相关抗体的关系

TAO患者PBMC中CD8+T细胞百分比与患者病程呈正相关(r=0.478,P=0.028),与甲状腺功能及甲状腺相关抗体无相关性(P>0.05);CD8+T细胞表面PD-1表达率、CD4+T细胞百分比及其细胞表面PD-1表达率与患者病程、甲状腺功能和甲状腺相关抗体之间均无相关性(表 3)。

表 3 TAO患者PBMC中CD4+、CD8+T细胞及其表面PD-1表达率与病程、甲状腺功能、甲状腺相关抗体的相关性 Tab 3 Correlation analysis between the proportions of CD4+,CD8+T cells in PBMC,PD-1 expression on cell surface in TAO patients and desease course,thyroid functions and levels of thyroid antibodies

2.6 PBMC中CD4+、CD8+T细胞百分比及其表面PD-1表达率与TAO疾病活动性和严重程度的关系

根据CAS评分结果将TAO患者分为2个亚组,其中活动期组10例、非活动期组11例,2组患者PBMC中CD4+、CD8+T细胞百分比及其表面PD-1表达率差异均无统计学意义(P>0.05,表 4)。根据TAO严重程度分级标准将TAO患者分为轻度组和中重度组2个亚组,其中轻度组11例、中重度组10例,2组患者PBMC中CD4+、CD8+T细胞百分比及其表面PD-1表达率差异也均无统计学意义(P>0.05,表 4)。

表 4 PBMC中CD4+、CD8+T细胞百分比及其表面PD-1表达率与TAO患者疾病活动性和严重程度的关系 Tab 4 Relationship between the proportions of CD4+,CD8+T cells in PBMC,PD-1 expression on cell surface and activity and severity of TAO

3 讨论

TAO是一种具有潜在致盲性的严重眼眶疾病,多发生于GD患者或既往有GD病史的患者中,因此又称为Graves眼病(Graves ophthalmopathy,GO)[6]。据报道GD患者中TAO患病率可高达25%~50%[7]。两病在发病机制上有一定联系,存在共同抗原,由遗传、环境及免疫因素相互作用、共同致病[8]

目前普遍认为免疫因素在TAO的发病机制中占主导地位,其中以T细胞免疫为主,其免疫学基础是在TAO患者眼眶组织中发现大量CD4+T细胞浸润,其次为CD8+T细胞[2]。浸润的T细胞活化后可释放干扰素(IFN)-γ、白介素(IL)-1β、IL-2、肿瘤坏死因子(TNF)-α等细胞因子及白细胞调节素,诱导眼眶成纤维细胞合成并释放透明质酸,参与TAO患者眼眶组织病理改变[6]。同样,T细胞免疫在GD的发病中也具有重要作用[9]。其中一个主要环节是抗原提呈细胞识别抗原并呈递给T细胞,T细胞活化后进一步增殖、分化为辅助性CD4+T细胞及细胞毒性CD8+T细胞,发挥分泌炎性因子及攻击靶细胞等作用,参与炎性反应及组织损伤[10]。既往研究也发现GD患者外周血与甲状腺组织中CD4+、CD8+T细胞百分比升高[11],但有关TAO患者PBMC中CD4+、CD8+T细胞百分比改变的报道较少。本研究发现GD组患者PBMC中CD4+、CD8+T细胞百分比均高于健康对照组(P<0.01),与以往研究相一致,进一步佐证PBMC中CD4+、CD8+T细胞的激活参与了GD的发病;而TAO组患者PBMC中CD4+、CD8+T细胞百分比也高于健康对照组(P<0.01),且与GD组之间差异无统计学意义,提示TAO与GD存在相似的全身免疫紊乱状态。PBMC中CD4+、CD8+T细胞激活与TAO发病相关,其发挥作用的机制可能和GD相同,与目前普遍认同的两病存在共同自身免疫发病机制的学说相一致。该研究结果具有一定的临床意义,PBMC中CD4+、CD8+T细胞比值升高可作为TAO及GD疾病诊断的一个重要免疫学指标,提示患者的全身免疫紊乱状态。

TAO与GD在发病上虽然有相似的免疫机制,但并不是所有GD患者均发生TAO,而TAO也可发生在其他自身免疫性甲状腺疾病的患者中[1]。因此,虽然TAO患者眼眶组织与GD发病过程中甲状腺病理改变之间存在联系,但是发病机制并不完全相同,TAO发病机制中可能有其独特的免疫学异常。为进一步探讨TAO与GD两病中T细胞免疫紊乱的特点,本研究对TAO与GD患者PBMC中CD4+、CD8+T细胞表面PD-1的表达率进行了检测。PD-1是近年发现的负性共刺激分子之一,主要在活化的T细胞表面表达,在B细胞及树突状细胞表面亦有表达。PD-1通过与其配体PD-L1、PD-L2结合,阻断T细胞增殖活化、减少细胞因子合成,但不增加细胞死亡,从而发挥免疫抑制作用[12]。近年来,多项动物实验研究证实PD-1通路在阻断免疫反应中发挥重要作用[3],而基因组学研究发现人类某些种族人群PD-1基因SNP与其自身免疫性疾病高发风险相关[12],提示PD-1在自身免疫性疾病中具有重要作用。本研究结果显示TAO组及GD组患者PBMC中CD4+T细胞表面PD-1的表达率、TAO组患者PBMC中CD8+T细胞表面PD-1的表达率低于健康对照组,提示PD-1表达异常可能是TAO及GD的发病机制之一。缺乏PD-1的负性调控作用,外周血T细胞“逃逸”免疫耐受而过度活化增殖,对自身抗原产生持续的免疫应答,通过释放炎性因子和增强细胞溶解作用促进炎症反应的发生,导致机体组织损伤;其中TAO患者CD4+、CD8+T细胞均参与致病过程,而GD患者以CD4+T细胞免疫为主。同时,TAO组患者PBMC中CD4+、CD8+T细胞表面PD-1的表达率低于GD组,其中CD4+T细胞表面PD-1的表达率差异有统计学意义(P<0.05),提示TAO患者CD4+T细胞生物学活性更强,自身免疫紊乱可能更严重、更持久。PBMC中CD4+T细胞表面PD-1表达率的下调水平可以作为鉴别TAO和GD的一项参考指标。

此外,在对TAO组进行相关性分析时发现,TAO组患者PBMC中CD8+T细胞百分比与患者病程呈正相关,提示随着TAO患者病程的延长,其PBMC中CD8+T细胞百分比增加,在细胞免疫中发挥的作用越大,尽早干预治疗可能有助于控制病情的发展。然而,TAO组患者CD4+、CD8+T细胞百分比及其表面PD-1的表达率与患者TAO疾病活动性及严重程度无明显相关,表明PD-1表达率不能作为TAO病情严重程度及活动性的指标。但以上结果尚需要大样本研究进一步证实。

本研究仍存在一定的局限性,研究检测的T细胞来源于患者外周血循环中,而TAO患者眼眶组织中浸润的T细胞在细胞来源及分布上均与外周血有所差异,且受不同微环境因素的影响,其表面共刺激分子的表达亦可能不同。下一步研究将检测TAO患者眼眶组织中浸润的CD4+、CD8+T细胞百分比及其表面PD-1的表达水平,进一步明确PD-1与TAO眼部病理改变机制之间的关系。

综上,本研究结果显示TAO患者PBMC中CD4+、CD8+T细胞百分比升高、其表面PD-1的表达下调,提示TAO患者PBMC中CD4+、CD8+T细胞百分比及其表面PD-1的表达参与TAO的自身免疫过程。PBMC中CD4+、CD8+T细胞百分比升高、CD4+T细胞表面PD-1表达率下调均可作为了解患者疾病状态的重要免疫学指标,对其深入研究将有助于我们进一步明确TAO的发病机制,为TAO疾病的治疗和预防提供新靶点。

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