第二军医大学学报  2016, Vol. 37 Issue (6): 780-784   PDF    
引用本文
张孝英, 尼佳乐, 陈承志, 杨凯, 涂白杰 . 2016.维生素E拮抗苯并[a]芘对雄性大鼠的肝脏毒性[J]. 第二军医大学学报, 37(6): 780-784  
ZHANG Xiao-ying, NI Jia-le, CHEN Cheng-zhi, YANG Kai, TU Bai-jie . Protective effect of vitamin E on benzo(a)pyrene (B[a]P)-induced liver toxicity in male Sprague Dawley rats[J]. Academic Journal of Second Military Medical University,2016, 37(6): 780-784 (in Chinese with English abstract)  
维生素E拮抗苯并[a]芘对雄性大鼠的肝脏毒性
张孝英1, 尼佳乐2, 陈承志1, 杨凯1, 涂白杰1     
1. 重庆医科大学公共卫生与管理学院、医学与社会发展研究中心、健康领域社会风险预测治理协同创新中心, 重庆 400016;
2. 平顶山市职业病防治所, 平顶山 467000
收稿日期: 2015-12-08    接受日期: 2016-03-20
基金项目: 国家自然科学基金(81372957).
作者简介: 张孝英, 硕士生. E-mail: 834524271@qq.com
通信作者(Corresponding author): 涂白杰，Tel: 023-68485008，E-mail: tubaijie@163.com
摘要: 目的 探讨维生素E(VE)对苯并[a]芘(B[a]P)诱导的雄性SD大鼠肝损害的作用及其机制。 方法 60只4周龄的雄性SD大鼠随机分为空 白对照组(未处理)、溶剂对照组(植物油)、单独染B[a]P组(5 mg/kg)、VE低剂量组 (10 mg/kg VE+5 mg/kg B[a]P)、VE中剂量组(50 mg/kg VE+5 mg/kg B[a]P)、VE高剂量组(100 mg/kg VE+5 mg/kg B[a]P) 6组,每组大鼠10只。连续灌胃30 d后,测定大鼠血清中丙氨酸转氨酶(ALT)、天冬氨酸转氨酶(AST)的活性;测定肝脏组织中超氧化物歧化酶(SOD)、谷胱甘肽过氧化物酶(GSH-Px)的活性和8-羟脱氧鸟苷(8-OHdG)、丙二醛(MDA)、肿瘤坏死因子α(TNF-α)的含量;H-E染色观察大鼠肝脏组织形态结构。 结果 与对照组相比,单独染B[a]P组大鼠肝脏组织结构破坏,血清ALT和AST活性增加(P<0.05),8-OHdG、MDA和TNF-α含量升高,SOD、GSH-Px活性下降(P<0.05)。与单独染B[a]P组相比,VE各剂量组大鼠的肝脏组织损伤呈现不同程度的减轻,AST、ALT活性下降,8-OHdG、MDA、TNF-α含量降低,SOD、GSH-Px活性明显改善,差异均具有统计学意义(P<0.05);该效应具有剂量依赖性。 结论 VE能拮抗B[a]P对雄性SD大鼠的肝脏毒性,起到肝脏保护作用。
关键词: 苯并[a]芘     维生素E     肝脏毒性     保护效应    
Protective effect of vitamin E on benzo(a)pyrene (B[a]P)-induced liver toxicity in male Sprague Dawley rats
ZHANG Xiao-ying1, NI Jia-le2, CHEN Cheng-zhi1, YANG Kai1, TU Bai-jie1     
1. School of Public Health and Management, Center for Medical and Social Development, Innovation Center for Social Risk Governance in Health, Chongqing Medical University, Chongqing 400016, China;
2. Prevention and Therapeutic Center for Occupation-related Diseases of Pingdingshan, Pingdingshan 467000, Henan, China
Abstract: Objective To investigate the protective effects of vitamin E (VE) on benzo(a)pyrene (B[a]P)-induced liver toxicity in male Sprague Dawley (SD) rats and to discuss the potential mechanisms involved. Methods Sixty male SD rats were randomly divided into 6 groups, namely, the blank control group, vehicle control group, B[a]P group (5 mg/kg), VE (10 mg/kg) + B[a]P (5 mg/kg) group, VE (50 mg/kg) + B[a]P (5 mg/kg) group and VE (100 mg/kg) + B[a]P (5 mg/kg) group, with each group having 10 rats. The rats were treated with B[a]P and/or VE once a day for 30 days via intragastric administration, and then the levels of alanine aminotransferase (ALT), aspertate aminotransferase (AST), superoxide dismutase (SOD), glutathione peroxidase (GSH-Px), 8-hydroxy-2-deoxyguanosine (8-OHdG), malondialdehyde (MDA) and tumor necrosis factor-α (TNF-α) were determined. The morphological changes of liver tissue were observed by H-E staining. Results Compared with the blank control group, the liver tissues in the B[a]P group were injured, the activities of serum AST, ALT, and the levels of MDA, 8-OHdG and TNF-α in B[a]P group were increased significantly (P<0.05); however, the activities of SOD and GSH-Px were significantly decreased (P<0.05). Importantly, rats in VE treatment groups had attenuated injury to liver tissues to different extents, decreased aminotransferase levels and greatly improved oxidative and DNA injury indicators. And with the increase of VE dose, the protective effect was more potent. Conclusion VE has a protective effect against the B[a]P-induced liver toxicity in male SD rats.
Key words: benzo(a)pyrene     vitamin E     liver toxicity     protective effect    

苯并芘(benzo[a]pyrene，B[a]P)是广泛存在于环境和食品中的一类多环芳烃类化合物，具有明确的致畸性、致癌性和神经毒性。B[a]P通过皮肤、消化道、呼吸道等途径进入人体，在体内经过肝脏代谢，一部分经活化反应后生成终致癌物7,8-二氢二醇-9,10-环氧苯并[a]芘(benzo[a]pyrene diolepoxide，BPDE)。动物经多环芳烃染毒后可出现癌前肝脏毒性[1]，而B[a]P在体内活化过程中也可产生大量的自由基，造成生物分子氧化损伤。氧化应激是导致肝脏损害的重要机制之一。维生素E(vitamin E,VE)是人体内最丰富的脂溶性抗氧化剂，能与自由基结合而发生抗脂质过氧化的作用。动物实验和临床治疗中均发现VE有很好的保肝作用，VE在由活性氧(reactive oxygen species,ROS)和脂质过氧化物引起的肝损伤中起关键性保护作用[2-4]。动物实验研究表明，VE可拮抗氯氰菊酯造成的小鼠肝组织氧化损伤和病理损伤，也能减少氧自由基的产生而减轻肝脏缺血再灌注损伤[5-6]。Soden等[7]报道了VE对肝病动物模型的抗氧化作用。但有关VE对B[a]P引起的肝脏毒性的影响却鲜有报道。基于此，本研究拟通过建立B[a]P亚慢性染毒大鼠模型，探讨脂质过氧化是否为B[a]P导致肝脏损伤的可能机制以及VE对B[a]P所致肝脏毒性的拮抗作用，为B[a]P肝脏毒性的防治提供理论依据。

1 材料和方法 1.1 实验材料 1.1.1 主要仪器和试剂

VE(纯度98％，购于美国Sigma公司)，B[a]P标准品(纯度99％，购于美国Sigma公司)；丙氨酸转氨酶(alanine aminotransferase，ALT)测定试剂盒、天冬氨酸转氨酶(aspertate aminotransferase，AST)测定试剂盒、超氧化物歧化酶(superoxide dismutase,SOD)检测试剂盒、谷胱甘肽过氧化物酶(glutathione peroxidase,GSH-Px)检测试剂盒、丙二醛(malondialdehyde,MDA)检测试剂盒、8-羟脱氧鸟苷(8-hydroxy-2-deoxyguanosine,8-OHdG) 检测试剂盒、肿瘤坏死因子(tumor necrosis factor-α,TNF-α)检测试剂盒均购于南京建成生物工程研究所。IX53奥林巴斯显微镜为日本奥林巴斯(Olympus)产品。ELX-808IU酶标仪为美国宝特(Thermo)产品。

1.1.2 实验动物及处理

重庆医科大学实验动物中心提供的60只健康SD雄性大鼠[动物使用许可证号为SYXK(渝)2012-0001]，4周龄，体质量70~100 g。大鼠采用全营养饲料及自来水喂养，自由采食；动物房保持12 h/12 h光暗周期、温度(25±1)℃、湿度(50±10)%。适应性喂养1周后用于实验。将SD大鼠随机分为6组，每组10只，每天1次连续灌胃30 d。分组及剂量如下：空白对照组(未处理)、溶剂对照组(5 mg/kg植物油)、单独染B[a]P组(5 mg/kg B[a]P)、VE低剂量组 (10 mg/kg VE+5 mg/kg B[a]P)、VE中剂量组(50 mg/kg VE+5 mg/kg B[a]P)、VE高剂量组(100 mg/kg VE+5 mg/kg B[a]P)。记录每日大鼠的饮食、体质量等一般情况。计算大鼠肝脏质量与其体质量的比值(肝脏脏器系数)。

1.2 肝脏组织H-E染色

末次灌胃24 h后，处死大鼠，取出肝脏组织。取部分肝脏组织置于4%多聚甲醛中固定48 h后脱水，透明，浸蜡包埋制作石蜡切片(切片厚3 μm)。温水展开后移至载玻片上，H-E染色，封片后，显微镜下观察肝脏组织的病理学变化。

血清中ALT、AST活性的测定用注射器取大鼠心脏血10 mL，静置1 h后低温离心(3 306×g，15 min)。取上清液，按照试剂盒说明书操作测定大鼠血清中ALT、AST活性水平。

1.4 大鼠肝脏中氧化应激指标和8-OHdG水平、TNF-α含量的测定

处死大鼠取出肝脏组织后，取大鼠肝左叶同一部位组织0.5 g，加入适量生理盐水研磨，制备成10%(质量体积分数)肝匀浆后低温冷冻离心(1 102×g，10 min)，取上清液于-20℃保存，用于测定SOD、MDA、GSH-Px、8-OHdG和TNF-α的水平。测定时严格按照试剂盒说明书操作，用酶标仪读取数据后，根据标准曲线计算出各项指标值。

1.5 统计学处理

采用SPSS 17.0 统计软件对实验数据进行分析。计量资料以x±s表示，组间比较采用单因素方差分析(ANOVA)，两两比较采用SNK法。检验水准 (α)为0.05。

2 结果 2.1 一般情况

实验大鼠全部存活，各组大鼠饮食及活动正常。单独染B[a]P组大鼠后期出现饮食和(或)饮水减少、精神萎靡、反应迟钝、体质量增长缓慢的表现。

2.2 肝脏脏器系数

处理结束后，计算各组大鼠的肝脏脏器系数：空白对照组为(3.11±0.76)%、溶剂对照组(3.15±0.43)%、单独染B[a]P组(4.54±0.67)%、VE低剂量组 (4.51±0.40)%、VE中剂量组(3.20±0.62)%、VE高剂量组(3.07±0.63)%。与空白对照组和溶剂对照组相比，单独染B[a]P组大鼠肝脏脏器系数增加，差异具有统计学意义(P＜0.05)；与单独染B[a]P组相比，VE各剂量组大鼠随着VE剂量的增加，肝脏脏器系数不断下降。VE中、高剂量组与单独染B[a]P组及VE低剂量组比较，差异有统计学意义(P＜0.05)。

2.3 肝脏的组织形态学变化

H-E染色光镜下可见，空白对照组大鼠肝细胞以中央静脉为中心向周围放射状整齐排列、胞核位于细胞中央、大而圆、清晰可见(图 1A、1B)；单独染B[a]P组大鼠肝脏明显损伤、肝细胞索紊乱、肝小叶界限不清、大量肝细胞胞质疏松、肿胀水肿、气球样变性(图 1C)。VE各剂量组大鼠与单独染B[a]P组相比，随着VE剂量的增加，肝组织的损伤呈现不同程度的好转，肝细胞索紊乱减轻、肝细胞内浊肿、气球样变及间质炎症减轻(图 1D~1F)。

图 1 H-E染色观察各组大鼠肝细胞形态变化 A： 空白对照组； B： 溶剂对照组； C： 单独染B[a]P组； D： VE低剂量组； E： VE中剂量组； F： VE高剂量组. VE： 维生素E； B[a]P： 苯并[a]芘. Original magnification： ×400

2.4 血清AST、ALT活性的测定

与空白对照组和溶剂对照组相比，单独染B[a]P组大鼠血清AST、ALT活性均增加，差异具有统计学意义(P<0.05)；与单独染B[a]P组相比，VE中剂量组和VE高剂量组大鼠血清AST活性水平降低，差异具有统计学意义(P<0.05)；相较于单独染B[a]P组，VE高剂量组大鼠血清ALT活性水平降低，差异具有统计学意义(P<0.05)，见表 1。

表 1 各组大鼠血清AST、ALT水平

2.5 肝脏组织中MDA、8-OHdG和TNF-α含量及SOD、GSH-Px活性的测定

与空白对照组和溶剂对照组相比，单独染B[a]P组大鼠肝脏组织MDA含量升高(P<0.05)，VE高剂量组MDA含量与VE低剂量组、单独染B[a]P组相比差异均有统计学意义(P<0.05)。单独染B[a]P组的SOD和GSH-Px活性与空白及溶剂对照组相比均下降(P<0.05)，随VE剂量的增加，SOD和GSH-Px活性均上升。见表 2。

由表 2可见，与空白及溶剂对照组相比，单独染B[a]P组8-OHdG含量升高，VE各剂量组8-OHdG含量下降，其中VE高剂量组与B[a]P组、VE低剂量组的差异具有统计学意义(P<0.05)。与对照组相比，单独染 B[a]P组和VE低剂量组大鼠肝脏组织TNF-α含量升高(P<0.05)；与单独染B[a]P组相比，VE中、高剂量组TNF-α含量下降，差异具有统计学意义(P<0.05)。

表 2 肝脏组织MDA、8-OHdG、TNF-α含量及SOD、GSH-Px活性

3 讨论

研究认为B[a]P进入人体后，在肝细胞微粒体中的细胞色素P450的作用下生成终致癌物，从而损伤DNA，启动致癌/致突变过程;而B[a]P代谢过程中产生的大量中间代谢物将进入氧化还原循环，产生活性氧物质引发机体的氧化应激反应[8]。VE是一种常见的抗氧化剂，能够中断脂质过氧化链式反应，从而影响细胞的氧化应激反应[9]。

动物染毒后，受损脏器质量发生改变，脏器系数也随之改变。本研究结果显示，单独染B[a]P组大鼠肝脏脏器系数增加，随着VE剂量的增加，大鼠肝脏脏器系数逐步趋向于正常值。肝脏组织经H-E染色后，光镜下观察发现单独染B[a]P组大鼠肝脏明显损伤、肝细胞索紊乱、肝小叶界限不清，肝细胞出现肿胀水肿、气球样变性，表明B[a]P具有肝脏毒性。随着VE剂量的增加，肝组织的损伤呈现不同程度的好转，提示VE对B[a]P损伤的肝脏组织细胞有保护作用。

大鼠血清中AST、ALT的活性是评价肝损伤的重要指标。在本研究中单独染B[a]P组大鼠血清AST、ALT活性增加，提示B[a]P染毒可致大鼠肝脏损伤，而VE各剂量组的ASL、ALT活性均有下降，表明一定剂量的VE可拮抗B[a]P所产生的亚慢性肝脏毒性作用。

既往研究结果认为，B[a]P诱导细胞凋亡是通过氧化应激实现的[10]。当机体产生的自由基增加到一定程度时，清除自由基的特异性酶类如SOD、GSH-Px的活性降低，机体清除自由基的能力下降，造成自由基在体内大量堆积，MDA等脂质过氧化物增加，最终导致机体发生脂质过氧化而致损伤[11-12]。本研究结果显示单独染B[a]P组大鼠肝脏组织中MDA含量升高，而SOD和GSH-Px活性降低，提示大鼠肝脏组织发生了氧化损伤，这与胡梦林等[13]的研究结果一致。而与单独染B[a]P组相比，VE各剂量组SOD、GSH-Px的活性上升、MDA含量降低，表明加入抗氧化剂VE处理后，机体清除氧自由基的能力提高，抗氧化能力增强，说明VE可拮抗B[a]P所致的组织氧化损伤，这与既往研究结果[14-15]基本一致。

8-OHdG是机体在氧化应激状态下产生的大量活性氧自由基直接攻击DNA的产物之一，测定机体8-OHdG含量可评估DNA氧化损伤和氧化应激状态。Łuczaj等[16]发现肝脏组织ROS增加造成肝细胞损伤时，肝细胞中的mtDNA碱基氧化表达的8-OHdG增多。本研究结果显示，与对照组比较，单独染B[a]P组8-OHdG含量升高，VE各剂量组8-OHdG含量下降，其中VE高剂量组与B[a]P组及VE低剂量组的差异具有统计学意义，表明给予合适剂量的VE能减轻B[a]P造成的DNA氧化损伤，结合氧化应激指标，进一步证实VE具有清除肝脏组织内氧自由基、减轻机体氧化损伤的能力。体内TNF-α主要是由肝脏的库普弗细胞产生，本研究结果显示单独染B[a]P组和VE低剂量组TNF-α含量升高，而VE中、高剂量组TNF-α含量下降，这与Li等[17]报道的肝脏疾病如缺血再灌注损伤、肝炎等引起肝脏损害时TNF-α含量升高的结果一致。

综上所述，本研究进一步证明了B[a]P具有肝脏毒性，能破坏肝脏组织的结构、扰乱机体的抗氧化系统，造成肝脏组织的氧化损伤；而适量的VE能对B[a]P所致的肝脏损伤有一定的拮抗作用，其机制可能与提高抗氧化特异酶类活性、降低脂质过氧化产物含量、减轻肝脏细胞DNA氧化损伤等有关。

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