第二军医大学学报  2016, Vol. 37 Issue (6): 724-728   PDF    
PRDM5基因抑制前列腺癌细胞22Rv1生长
王洋1, 夏梓元2, 黄美金3, 任善成4, 朱焱1, 高莉1, 贺湘洁1, 徐光4, 丁桂龄1, 陆斌2, 孙颖浩4     
1. 第二军医大学长海医院病理科, 上海 200433;
2. 第二军医大学药学院生化药学教研室, 上海 200433;
3. 解放军成都军区昆明总医院肿瘤科, 昆明 650010;
4. 第二军医大学长海医院泌尿外科, 上海 200433
摘要: 目的 探讨PRDM5基因在前列腺癌细胞中的抑癌作用。 方法 采用聚合酶链反应(PCR)、限制性内切酶酶切、T4 DNA连接酶连接等方法,克隆PRDM5基因并插入慢病毒载体中。将携带PRDM5基因的慢病毒质粒(或阴性对照质粒)与慢病毒包装质粒通过脂质体法共转染293T细胞,收集病毒上清,感染人前列腺癌细胞株22Rv1。用蛋白质印迹法检测细胞 PRDM5的表达,细胞倍增实验和平板克隆实验检测细胞增殖和克隆形成能力,软琼脂克隆形成实验检测细胞非锚着依赖性生长能力。 结果 成功构建PRDM5重组慢病毒载体,并包装获得慢病毒上清。将PRDM5重组慢病毒载体感染22Rv1细胞后,筛选得到稳定表达细胞株,蛋白质印迹法结果显示该细胞株能稳定表达外源性PRDM5蛋白。过表达PRDM5的前列腺癌22Rv1细胞的增殖能力[倍增时间:(52.5±1.4) h vs (44.0±1.3) h]、克隆形成能力[克隆形成数: (1 114±98)/皿 vs (1 361±123)/皿]和非锚着依赖性生长能力[克隆形成数:(94.6±8.7)/孔 vs (154.0±3.5)/孔]均低于阴性对照组(P<0.05)。 结论 前列腺癌22Rv1细胞中PRDM5的过表达具有抑制肿瘤细胞增殖、克隆形成和非锚着依赖性生长的能力。
关键词: PRDM5     前列腺肿瘤     细胞增殖     克隆形成     非锚着依赖性生长    
PRDM5 gene can inhibit the growth of prostate cancer cell line 22Rv1
WANG Yang1, XIA Zi-yuan2, HUANG Mei-jin3, REN Shan-cheng4, ZHU Yan1, GAO Li1, HE Xiang-jie1, XU Guang4, DING Gui-ling1, LU Bin2, SUN Ying-hao4     
1. Department of Pathology, Changhai Hospital, Second Military Medical University, Shanghai 200433, China;
2. Department of Biochemical Pharmacy, School of Pharmacy, Second Military Medical University, Shanghai 200433, China;
3. Department of Oncology, Kunming General Hospital, PLA Chengdu Military Area Command, Kunming 650010, Yunnan, China;
4. Department of Urology, Changhai Hospital, Second Military Medical University, Shanghai 200433, China
Abstract: Objective To investigate the antitumor effect of PRDM5 gene in prostate cancer cells. Methods PRDM5 gene was cloned and inserted into lentiviral vector using polymerase chain reaction (PCR), restriction endonuclease and T4 DNA ligase connected method. The lentiviral plasmids carrying PRDM5 gene (LV-PRDM5) or control lentivirus (LV-Luc) were co-transfected with lentiviral packaging plasmid mix into 293T cells by liposome method. The viral supernatants were collected and transduced into human prostate cancer cells 22Rv1. The expression of PRDM5 was verified by Western blotting analysis. The cell proliferation and clone formation ability were detected by cell multiplication and cell cloning experiments. The anchorage independent growth rate of prostate cancer cells was assessed by soft agar colony formation assay. Results The lentivirus vector expressing PRDM5 gene was constructed successfully, and the viral supernatants were obtained. The prostate cancer cell line 22Rv1 stably expressing exogenous PRDM5 was screened and verified by Western blotting analysis. Compared with control cells, the prostate cancer cell line 22Rv1 expressing PRDM5 showed a lower growth rate (multiplication time: [52.5±1.4] vs [44.0±1.3] h), clone formation rate ([1 114±98] vs [1 361±123] colonies per dish) and anchorage independent growth rate ([94.6±8.7] vs [154.0±3.5] colonies per cell, P<0.05). Conclusion Overexpression of PRDM5 has inhibitory effect against proliferation, clone formation and anchorage independent growth of prostate cancer cells in vitro.
Key words: PRDM5     prostatic neoplasms     cell proliferation     clone formation     anchorage independent growth    

PR域蛋白(PRDM)是近年来新发现的Kruppel样锌指基因产物家族的亚型,在细胞分化和恶性转化中起着重要作用[1]。现已发现该家族有17个成员,分别是PRDM1~17,其末端都存在具有转录调控作用的PR结构域和SET结构域[2]PRDM5(PFM2)被认为是一个抑癌基因[3],Deng等[4]研究发现重组腺病毒表达的PRDM5能引起感染的肿瘤细胞出现G2/M的阻滞并促进肿瘤细胞发生凋亡;Watanabe等[5]发现,在胃肠道癌细胞系过表达PRDM5能抑制癌细胞的生长。但目前关于PRDM5在前列腺癌中的表达和作用还未见相关研究报道。本研究以PRDM5慢病毒感染低表达PRDM5的前列腺癌22Rv1细胞,通过细胞倍增实验、平板克隆实验和软琼脂克隆形成实验,探讨PRDM5在前列腺癌中的作用。

1 材料和方法 1.1 主要材料及试剂

前列腺癌22Rv1细胞系由第二军医大学长海医院泌尿外科保存,用含10%胎牛血清(FBS)的DMEM/RPMI 1640混合培养基在37℃、7%CO2条件下培养。DMEM培养基、RPMI 1640培养基、胰蛋白酶、青霉素G钠和氯霉素购自Gibco公司,FBS购自SAFC Biosciences公司,二甲亚砜(DMSO)、嘌呤霉素(puromycin,PM)购自Sigma公司,多西环素(doxycycline,DOX)购自生工生物工程(上海)股份有限公司,RNApure超纯总RNA快速提取试剂盒、EASYspin组织/细胞RNA快速提取试剂盒购自北京艾德来生物科技有限公司,pZERO/Blunt零背景快速克隆试剂盒、TIANprep快速质粒小提试剂盒、DNA Marker、DNA纯化试剂盒购自天根生化科技(北京)有限公司,T4 DNA 连接酶购自NEB公司,Bgl Ⅱ、Age Ⅰ、Nde Ⅰ和Cla Ⅰ限制性内切酶购自宝生物工程有限公司(TaKaRa)。 Pure YieldTM 质粒小提试剂盒购自Promega公司,LipofectamineTM 2000转染试剂购自Invitrogen公司,化学发光试剂盒购自Thermo公司,兔抗PRDM5单克隆抗体购自Abcam公司,actin多克隆抗体购自Sigma公司,山羊抗小鼠IgG-HRP(sc-2005)、山羊抗兔IgG-HRP(sc-2004)购自Santa Cruz公司。

1.2 PCR引物的设计、合成

利用NCBI网上的GenBank数据库(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/gene/)以及Blast(http://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi)对基因序列进行查找和序列比对。采用DNAMAN 6.0、Vector NTI suite 8.0及Primer Premier 5.0等软件进行基因序列分析和引物设计。根据GenBank数据库中的人PRDM5基因序列(NM_018699.2),应用Primer Premier 5.0软件设计引物:Forward 5′-aaA CCG GTC ACC ATG CTG GGC ATG TAC GTG CC-3′,Reverse 5′-aaA TCG ATT TAG CTG TCA GCT ACA CCA TGG-3′。引物由Invitrogen公司合成。从人cDNA文库中克隆获得人PRDM5基因,5′端和3′端分别设计Age Ⅰ(ACC GGT)和Cla Ⅰ(ATC GAT)酶切位点,用于表达载体的定向克隆。人PRDM5基因内部1 013 bp处存在一个Nde Ⅰ位点,设计NdeF(5′-ACG TCA TAT GAT CAC CCA CTC AG-3′)和NdeR(5′-GAT CAT ATG ACG TTT TAG CTG ATT AG-3′)引物进行分段PCR扩增,最后以Nde Ⅰ酶切位点进行拼接。

1.3 PRDM5基因的克隆和慢病毒表达载体的构建

以人PRDM5的cDNA为模板进行PCR,反应结束后,用1%琼脂糖凝胶进行电泳,切取目的片段,用DNA纯化试剂盒进行目的片段的回收,连接克隆载体。连接产物转化大肠杆菌感受态细胞,将细胞均匀涂布于含氨苄青霉素的LB琼脂平板表面,于37℃孵箱中倒置培养过夜。挑取单克隆接种于加入氨苄青霉素的LB培养液中摇菌,进行质粒抽提和酶切鉴定。将鉴定正确的克隆送测序公司测序。将测序正确的克隆质粒分别用AgeⅠ和Nde Ⅰ、Nde Ⅰ和Cla Ⅰ双酶切,慢病毒载体质粒pLV-TOF用Age Ⅰ和Cla Ⅰ双酶切。回收pZERO/Blunt-PRDM5酶切产物中的目的片段和pLV-TOF酶切产物中的载体部分,以T4 DNA连接酶进行连接。转化铺板后进行质粒抽提和酶切鉴定,将鉴定正确的克隆进行保种。

1.4 携带PRDM5基因的慢病毒的包装

转染前24 h将生长状态良好的293T细胞接种到直径为6 cm的平皿中,细胞融合度达到约80%时进行病毒包装,转染前更换2 mL新鲜含血清培养基。在1.5 mL离心管中加入2.4 μg pLV-PRDM5(pLV-Luc作为阴性对照)和7.6 μg包装质粒Mix,加入250 μL无血清培养基,轻柔吹打混匀;在另一个1.5 mL离心管中以250 μL无血清培养基稀释10 μL LipofectamineTM 2000脂质体,轻柔吹打混匀,室温静置5 min。将含LipofectamineTM 2000的培养基加入到质粒DNA中,轻轻混匀,室温放置孵育20 min,以形成转染复合物;然后将上述混合物加到细胞培养皿中,培养6~8 h后更换新鲜培养基5 mL,放回孵箱培养;分别于转染后48 h和72 h收集上清,4℃、350×g离心15 min,去除细胞沉淀和细胞碎片;分装,-80℃保存。采用有限稀释法测定病毒滴度。

1.5 稳定表达PRDM5的前列腺癌22Rv1细胞株的建立

选取PRDM5低表达的22Rv1细胞株进行病毒感染。培养次日,更换新鲜培养基;48 h后加入抗生素PM进行稳转筛选。该慢病毒系统为Tet-off系统,加入DOX溶液(质量浓度0.5 μg/μL)暂时抑制目的基因的表达,隔天补加或更换一次含有PM和DOX的培养基。药物筛选约1周,获得稳定表达PRDM5的22Rv1/LV-PRDM5细胞和22Rv1/LV-Luc对照细胞。收集细胞,采用RIPA蛋白裂解液提取细胞总蛋白,聚丙烯酰胺凝胶电泳,半干电转PVDF膜,5%脱脂奶粉室温封闭2 h。一抗4℃孵育过夜,二抗室温温育2 h,化学发光试剂盒显色,ChemiDocTM System凝胶成像系统拍照。

1.6 细胞倍增实验

将稳定表达PRDM5的22Rv1/LV-PRDM5细胞株和22Rv1/LV-Luc对照细胞撤药3 d后,消化,计数,铺板,每种细胞设6个复孔,每孔1×105个细胞,次日取24、48、72 h 3个时间点,每个时间点消化细胞进行细胞计数,最后统计数据,在网上(http://www.doubling-time.com/compute.php)进行在线计算,得到每组细胞的倍增时间。

1.7 平板克隆实验

撤药3 d后,用0.25%的胰蛋白酶消化细胞,用含10%FBS的RPMI 1640/DMEM培养基配成单个细胞悬液,以2 500/皿接种于直径为10 cm的培养皿,37℃、5%CO2培养箱中培养2周。出现肉眼可见的细胞克隆时,终止培养,弃去培养液,以1×PBS洗2次;10%甲醛固定20 min,弃甲醛;用0.1%结晶紫染色15 min,弃染色液;流水缓慢洗去染液,空气干燥。采用Bio-Rad Quantity One软件对克隆进行拍照计数。

1.8 软琼脂克隆形成实验

撤药3 d后,用胰酶消化细胞,制成单细胞悬液。调整细胞密度为5×104/mL,取1 mL细胞悬液加入146 μL 2.5%琼脂糖,迅速混匀,按500 μL/孔加入含0.5%底层胶的24孔板中,常温放置30 min以上。待上层胶完全凝固,放入孵箱中培养2周。用0.1%结晶紫进行染色,在显微镜下观察集落形成情况并拍照计数。

1.9 统计学处理

实验数据采用SPSS 19.0统计软件进行分析。计数资料分析采用χ2检验。实验组与对照组两组资料均数的比较采用t检验。检验水准(α)为0.05。

2 结果 2.1 成功获得稳定表达PRDM5的前列腺癌22Rv1细胞

通过PCR分段克隆方法获得PRDM5序列,电泳结果显示,PCR产物大小基本正确,但有非特异性条带(图 1),需要在后期克隆的酶切鉴定和测序中进行选择。将克隆获得的正确PRDM5基因序列的2个片段同时装入慢病毒表达载体pLV-TOF中,通过Age Ⅰ 和Cla Ⅰ 双酶切,确定目的基因的插入。电泳结果显示,3个克隆均插入了目的基因PRDM5(图 2)。通过将携带PRDM5基因的慢病毒感染22Rv1细胞,经PM筛选阳性克隆后,用蛋白质印迹法检测转染后细胞中PRDM5蛋白的表达,结果显示,PRDM5基因已成功转入22Rv1细胞中(图 3)。

图 1 PRDM5基因的PCR克隆 Fig 1 PCR cloning of PRDM5 gene

图 2 PRDM5基因慢病毒表达载体的鉴定 Fig 2 Identification of PRDM5 gene lentiviral expression vector

图 3 PRDM5基因慢病毒感染后前列腺癌22Rv1细胞中PRDM5表达的鉴定 Fig 3 Identification of PRDM5 expression in prostate cancer cell line 22Rv1 infected with PRDM5 gene lentiviral vector

2.2 PRDM5对前列腺癌22Rv1细胞的抑制作用

细胞倍增实验结果显示,经LV-Luc感染后的22Rv1细胞倍增时间为(44.0±1.3)h,而经LV-PRDM5感染的22Rv1细胞倍增时间为(52.5±1.4) h,比LV-Luc组延长约8.5 h(P<0.05,图 4)。

图 4 PRDM5对前列腺癌22Rv1细胞倍增时间的影响 Fig 4 Effect of PRDM5 on multiplication rate of prostate cancer cells 22Rv1

平板克隆实验结果显示,经LV-Luc感染后的22Rv1细胞克隆数为(1 361±123)/皿,而经LV-PRDM5感染后的22Rv1细胞克隆数为(1 114±98)/皿,统计分析显示LV-PRDM5组的细胞克隆形成数低于LV-Luc组(P<0.05)。而从克隆大小上看,LV-Luc组的大克隆细胞数目多于LV-PRDM5组(图 5)。

图 5 PRDM5对前列腺癌22Rv1细胞克隆形成能力的影响 Fig 5 Effect of PRDM5 on clone formation rate of prostate cancer cells 22Rv1

软琼脂克隆形成实验结果显示,经LV-PRDM5感染后的22Rv1细胞的克隆形成数为(94.6±8.7)/孔,而经LV-Luc感染后的22Rv1细胞的克隆形成数约为LV-PRDM5组的1.63倍(P<0.05)。同时PRDM5表达后细胞的克隆变小,提示PRDM5的表达可能抑制前列腺癌22Rv1细胞的非锚着依赖性生长能力(图 6)。

图 6 PRDM5对前列腺癌22Rv1细胞的非锚着依赖性生长能力的影响 Fig 6 Effect of PRDM5 on anchorage independent growth rate of prostate cancer cells 22RV1

3 讨论

前列腺癌是男性泌尿生殖系统最常见的恶性肿瘤之一,是老年男性的好发肿瘤。在西方发达国家,前列腺癌是男性发病率最高的恶性肿瘤,病死率也仅次于肺癌[6-7],严重威胁男性健康。我国前列腺癌发病率虽然与欧美国家相比要低,但是近年已明显有逐年增高的趋势,而且病死率远高于欧美国家[8-9]。与大多数肿瘤一样,前列腺癌的发生和发展也是多基因参与的多因素、多步骤的过程,涉及癌基因的激活和抑癌基因的失活。

PRDM5是近年确认的抑癌基因PRDM家族成员[4],位于人染色体4q25~q26,有一个编码630个氨基酸的开放阅读框架,N末端含有一个PR结构域和16个锌指结构序列。研究发现PRDM5与多种肿瘤的发生和发展有关[5, 10-13],但在前列腺癌中还未见相关研究报道。本研究通过基因转染手段上调前列腺癌22Rv1细胞中的PRDM5的表达,以探讨PRDM5在前列腺癌中的作用。目前基因转染途径很多,而慢病毒是较为有效的一种,它具有毒力低、感染效率高、容纳外源性基因片段大等特点。本研究构建了可调控的PRDM5慢病毒表达系统,将其感染低表达PRDM5的前列腺癌22Rv1细胞,获得了稳定的可调控表达的细胞。通过细胞倍增、克隆形成等体外实验发现,过表达PRDM5可延长前列腺癌22Rv1细胞的倍增时间,抑制细胞的克隆形成能力和非锚着依赖性生长能力。

本研究表明PRDM5可作为一个抑癌基因抑制前列腺癌细胞增殖,提示其可能在前列腺癌的发生和发展中起着重要作用,有望成为前列腺癌治疗的新靶点。但PRDM5是如何发挥抑癌作用的,其中涉及哪些下游信号通路分子,还需要进行深入的探讨。

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