PR域蛋白(PRDM)是近年来新发现的Kruppel样锌指基因产物家族的亚型，在细胞分化和恶性转化中起着重要作用^[1]。现已发现该家族有17个成员，分别是PRDM1~17，其末端都存在具有转录调控作用的PR结构域和SET结构域^[2]。PRDM5(PFM2)被认为是一个抑癌基因^[3]，Deng等^[4]研究发现重组腺病毒表达的PRDM5能引起感染的肿瘤细胞出现G₂/M的阻滞并促进肿瘤细胞发生凋亡；Watanabe等^[5]发现，在胃肠道癌细胞系过表达PRDM5能抑制癌细胞的生长。但目前关于PRDM5在前列腺癌中的表达和作用还未见相关研究报道。本研究以PRDM5慢病毒感染低表达PRDM5的前列腺癌22Rv1细胞，通过细胞倍增实验、平板克隆实验和软琼脂克隆形成实验，探讨PRDM5在前列腺癌中的作用。

前列腺癌22Rv1细胞系由第二军医大学长海医院泌尿外科保存，用含10%胎牛血清(FBS)的DMEM/RPMI 1640混合培养基在37℃、7%CO₂条件下培养。DMEM培养基、RPMI 1640培养基、胰蛋白酶、青霉素G钠和氯霉素购自Gibco公司，FBS购自SAFC Biosciences公司，二甲亚砜(DMSO)、嘌呤霉素(puromycin，PM)购自Sigma公司，多西环素(doxycycline，DOX)购自生工生物工程(上海)股份有限公司，RNApure超纯总RNA快速提取试剂盒、EASYspin组织/细胞RNA快速提取试剂盒购自北京艾德来生物科技有限公司，pZERO/Blunt零背景快速克隆试剂盒、TIANprep快速质粒小提试剂盒、DNA Marker、DNA纯化试剂盒购自天根生化科技(北京)有限公司，T4 DNA 连接酶购自NEB公司，Bgl Ⅱ、Age Ⅰ、Nde Ⅰ和Cla Ⅰ限制性内切酶购自宝生物工程有限公司(TaKaRa)。 Pure Yield^TM 质粒小提试剂盒购自Promega公司，Lipofectamine^TM 2000转染试剂购自Invitrogen公司，化学发光试剂盒购自Thermo公司，兔抗PRDM5单克隆抗体购自Abcam公司，actin多克隆抗体购自Sigma公司，山羊抗小鼠IgG-HRP(sc-2005)、山羊抗兔IgG-HRP(sc-2004)购自Santa Cruz公司。

利用NCBI网上的GenBank数据库(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/gene/)以及Blast(http://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi)对基因序列进行查找和序列比对。采用DNAMAN 6.0、Vector NTI suite 8.0及Primer Premier 5.0等软件进行基因序列分析和引物设计。根据GenBank数据库中的人PRDM5基因序列(NM_018699.2)，应用Primer Premier 5.0软件设计引物：Forward 5′-aaA CCG GTC ACC ATG CTG GGC ATG TAC GTG CC-3′，Reverse 5′-aaA TCG ATT TAG CTG TCA GCT ACA CCA TGG-3′。引物由Invitrogen公司合成。从人cDNA文库中克隆获得人PRDM5基因，5′端和3′端分别设计Age Ⅰ(ACC GGT)和Cla Ⅰ(ATC GAT)酶切位点，用于表达载体的定向克隆。人PRDM5基因内部1 013 bp处存在一个Nde Ⅰ位点，设计NdeF(5′-ACG TCA TAT GAT CAC CCA CTC AG-3′)和NdeR(5′-GAT CAT ATG ACG TTT TAG CTG ATT AG-3′)引物进行分段PCR扩增，最后以Nde Ⅰ酶切位点进行拼接。

以人PRDM5的cDNA为模板进行PCR，反应结束后，用1%琼脂糖凝胶进行电泳，切取目的片段，用DNA纯化试剂盒进行目的片段的回收，连接克隆载体。连接产物转化大肠杆菌感受态细胞，将细胞均匀涂布于含氨苄青霉素的LB琼脂平板表面，于37℃孵箱中倒置培养过夜。挑取单克隆接种于加入氨苄青霉素的LB培养液中摇菌，进行质粒抽提和酶切鉴定。将鉴定正确的克隆送测序公司测序。将测序正确的克隆质粒分别用AgeⅠ和Nde Ⅰ、Nde Ⅰ和Cla Ⅰ双酶切，慢病毒载体质粒pLV-TOF用Age Ⅰ和Cla Ⅰ双酶切。回收pZERO/Blunt-PRDM5酶切产物中的目的片段和pLV-TOF酶切产物中的载体部分，以T4 DNA连接酶进行连接。转化铺板后进行质粒抽提和酶切鉴定，将鉴定正确的克隆进行保种。

转染前24 h将生长状态良好的293T细胞接种到直径为6 cm的平皿中，细胞融合度达到约80%时进行病毒包装，转染前更换2 mL新鲜含血清培养基。在1.5 mL离心管中加入2.4 μg pLV-PRDM5(pLV-Luc作为阴性对照)和7.6 μg包装质粒Mix，加入250 μL无血清培养基，轻柔吹打混匀；在另一个1.5 mL离心管中以250 μL无血清培养基稀释10 μL Lipofectamine^TM 2000脂质体，轻柔吹打混匀，室温静置5 min。将含Lipofectamine^TM 2000的培养基加入到质粒DNA中，轻轻混匀，室温放置孵育20 min，以形成转染复合物；然后将上述混合物加到细胞培养皿中，培养6~8 h后更换新鲜培养基5 mL，放回孵箱培养；分别于转染后48 h和72 h收集上清，4℃、350×g离心15 min，去除细胞沉淀和细胞碎片；分装，-80℃保存。采用有限稀释法测定病毒滴度。

选取PRDM5低表达的22Rv1细胞株进行病毒感染。培养次日，更换新鲜培养基；48 h后加入抗生素PM进行稳转筛选。该慢病毒系统为Tet-off系统，加入DOX溶液(质量浓度0.5 μg/μL)暂时抑制目的基因的表达，隔天补加或更换一次含有PM和DOX的培养基。药物筛选约1周，获得稳定表达PRDM5的22Rv1/LV-PRDM5细胞和22Rv1/LV-Luc对照细胞。收集细胞，采用RIPA蛋白裂解液提取细胞总蛋白，聚丙烯酰胺凝胶电泳，半干电转PVDF膜，5%脱脂奶粉室温封闭2 h。一抗4℃孵育过夜，二抗室温温育2 h，化学发光试剂盒显色，ChemiDoc^TM System凝胶成像系统拍照。

将稳定表达PRDM5的22Rv1/LV-PRDM5细胞株和22Rv1/LV-Luc对照细胞撤药3 d后，消化，计数，铺板，每种细胞设6个复孔，每孔1×10⁵个细胞，次日取24、48、72 h 3个时间点，每个时间点消化细胞进行细胞计数，最后统计数据，在网上(http://www.doubling-time.com/compute.php)进行在线计算，得到每组细胞的倍增时间。

撤药3 d后，用0.25%的胰蛋白酶消化细胞，用含10%FBS的RPMI 1640/DMEM培养基配成单个细胞悬液，以2 500/皿接种于直径为10 cm的培养皿，37℃、5%CO₂培养箱中培养2周。出现肉眼可见的细胞克隆时，终止培养，弃去培养液，以1×PBS洗2次；10%甲醛固定20 min，弃甲醛；用0.1%结晶紫染色15 min，弃染色液；流水缓慢洗去染液，空气干燥。采用Bio-Rad Quantity One软件对克隆进行拍照计数。

撤药3 d后，用胰酶消化细胞，制成单细胞悬液。调整细胞密度为5×10⁴/mL，取1 mL细胞悬液加入146 μL 2.5%琼脂糖，迅速混匀，按500 μL/孔加入含0.5%底层胶的24孔板中，常温放置30 min以上。待上层胶完全凝固，放入孵箱中培养2周。用0.1%结晶紫进行染色，在显微镜下观察集落形成情况并拍照计数。

实验数据采用SPSS 19.0统计软件进行分析。计数资料分析采用χ²检验。实验组与对照组两组资料均数的比较采用t检验。检验水准(α)为0.05。

通过PCR分段克隆方法获得PRDM5序列，电泳结果显示，PCR产物大小基本正确，但有非特异性条带(图 1)，需要在后期克隆的酶切鉴定和测序中进行选择。将克隆获得的正确PRDM5基因序列的2个片段同时装入慢病毒表达载体pLV-TOF中，通过Age Ⅰ 和Cla Ⅰ 双酶切，确定目的基因的插入。电泳结果显示，3个克隆均插入了目的基因PRDM5(图 2)。通过将携带PRDM5基因的慢病毒感染22Rv1细胞，经PM筛选阳性克隆后，用蛋白质印迹法检测转染后细胞中PRDM5蛋白的表达，结果显示，PRDM5基因已成功转入22Rv1细胞中(图 3)。

图 1 PRDM5基因的PCR克隆 Fig 1 PCR cloning of PRDM5 gene

图 2 PRDM5基因慢病毒表达载体的鉴定 Fig 2 Identification of PRDM5 gene lentiviral expression vector

图 3 PRDM5基因慢病毒感染后前列腺癌22Rv1细胞中PRDM5表达的鉴定 Fig 3 Identification of PRDM5 expression in prostate cancer cell line 22Rv1 infected with PRDM5 gene lentiviral vector

细胞倍增实验结果显示，经LV-Luc感染后的22Rv1细胞倍增时间为(44.0±1.3)h，而经LV-PRDM5感染的22Rv1细胞倍增时间为(52.5±1.4) h，比LV-Luc组延长约8.5 h(P<0.05，图 4)。

图 4 PRDM5对前列腺癌22Rv1细胞倍增时间的影响 Fig 4 Effect of PRDM5 on multiplication rate of prostate cancer cells 22Rv1

平板克隆实验结果显示，经LV-Luc感染后的22Rv1细胞克隆数为(1 361±123)/皿，而经LV-PRDM5感染后的22Rv1细胞克隆数为(1 114±98)/皿，统计分析显示LV-PRDM5组的细胞克隆形成数低于LV-Luc组(P<0.05)。而从克隆大小上看，LV-Luc组的大克隆细胞数目多于LV-PRDM5组(图 5)。

图 5 PRDM5对前列腺癌22Rv1细胞克隆形成能力的影响 Fig 5 Effect of PRDM5 on clone formation rate of prostate cancer cells 22Rv1

软琼脂克隆形成实验结果显示，经LV-PRDM5感染后的22Rv1细胞的克隆形成数为(94.6±8.7)/孔，而经LV-Luc感染后的22Rv1细胞的克隆形成数约为LV-PRDM5组的1.63倍(P<0.05)。同时PRDM5表达后细胞的克隆变小，提示PRDM5的表达可能抑制前列腺癌22Rv1细胞的非锚着依赖性生长能力(图 6)。

图 6 PRDM5对前列腺癌22Rv1细胞的非锚着依赖性生长能力的影响 Fig 6 Effect of PRDM5 on anchorage independent growth rate of prostate cancer cells 22RV1

前列腺癌是男性泌尿生殖系统最常见的恶性肿瘤之一，是老年男性的好发肿瘤。在西方发达国家，前列腺癌是男性发病率最高的恶性肿瘤，病死率也仅次于肺癌^[6-7]，严重威胁男性健康。我国前列腺癌发病率虽然与欧美国家相比要低，但是近年已明显有逐年增高的趋势，而且病死率远高于欧美国家^[8-9]。与大多数肿瘤一样，前列腺癌的发生和发展也是多基因参与的多因素、多步骤的过程，涉及癌基因的激活和抑癌基因的失活。

PRDM5是近年确认的抑癌基因PRDM家族成员^[4]，位于人染色体4q25~q26，有一个编码630个氨基酸的开放阅读框架，N末端含有一个PR结构域和16个锌指结构序列。研究发现PRDM5与多种肿瘤的发生和发展有关^{[5, 10-13]}，但在前列腺癌中还未见相关研究报道。本研究通过基因转染手段上调前列腺癌22Rv1细胞中的PRDM5的表达，以探讨PRDM5在前列腺癌中的作用。目前基因转染途径很多，而慢病毒是较为有效的一种，它具有毒力低、感染效率高、容纳外源性基因片段大等特点。本研究构建了可调控的PRDM5慢病毒表达系统，将其感染低表达PRDM5的前列腺癌22Rv1细胞，获得了稳定的可调控表达的细胞。通过细胞倍增、克隆形成等体外实验发现，过表达PRDM5可延长前列腺癌22Rv1细胞的倍增时间，抑制细胞的克隆形成能力和非锚着依赖性生长能力。

本研究表明PRDM5可作为一个抑癌基因抑制前列腺癌细胞增殖，提示其可能在前列腺癌的发生和发展中起着重要作用，有望成为前列腺癌治疗的新靶点。但PRDM5是如何发挥抑癌作用的，其中涉及哪些下游信号通路分子，还需要进行深入的探讨。