第二军医大学学报  2016, Vol. 37 Issue (5): 590-594   PDF    
引用本文
张宇, 卫子然, 杨德君, 王长明, 颜荣林 . 2016.Ras相关区域家族10蛋白在胃癌中的表达及其临床意义[J]. 第二军医大学学报, 37(5): 590-594  
ZHANG Yu, WEI Zi-ran, YANG De-jun, WANG Chang-ming, YAN Rong-lin . Expression and clinical significance of Ras-association domain family 10 in gastric cancer[J]. Academic Journal of Second Military Medical University,2016, 37(5): 590-594 (in Chinese with English abstract)  
Ras相关区域家族10蛋白在胃癌中的表达及其临床意义
张宇, 卫子然, 杨德君, 王长明, 颜荣林     
第二军医大学长征医院胃肠外科, 上海 200003
收稿日期: 2015-12-27    接受日期: 2016-01-27
基金项目: 上海市卫生与计划生育委员会科研课题(2014176).
作者简介: 张宇, 硕士生. E-mail: zhang-yu10086@163.com; 卫子然, 硕士, 讲师. E-mail: weiziran0010185@163.com
通信作者(Corresponding author): 颜荣林，Tel: 021-81885602，E-mail: yanronglin12@sina.com
摘要: 目的 探讨Ras相关区域家族10(Ras-association domain family 10,RASSF10)蛋白在人类胃癌中的表达及其与胃癌患者预后相关的临床病理学参数的关系。 方法 选取2008年1月至2010年12月在第二军医大学长征医院手术切除的胃癌标本共105例。所有患者临床病理学资料详实,至少随访5年或随访至死亡。应用免疫组织化学方法检测胃癌组织中RASSF10的表达,并分析其与临床病理学参数和预后的关系。 结果 免疫组化结果提示RASSF10在105例胃癌组织中阴性表达率为61.9%(65/105)。RASSF10表达水平与肿瘤大小、病理学分级、病理类型、T分期、淋巴结转移有关(P均<0.05),而与患者年龄、性别、肿瘤部位、远处转移、AJCC分期等无关(P>0.05)。Kaplan-Meier分析显示RASSF10表达阴性患者有着更差的预后(P<0.05)。Cox比例风险回归模型分析显示RASSF10表达(HR=0.528, P=0.041)和AJCC临床分期(HR=4.994, P=0.001)可作为胃癌患者的独立预后因子。 结论 RASSF10蛋白在胃癌组织中表达下调,且与胃癌患者不良预后相关,提示其可能成为判断胃癌预后的潜在生物标记物。
关键词: RASSF10     胃肿瘤     免疫组织化学     预后    
Expression and clinical significance of Ras-association domain family 10 in gastric cancer
ZHANG Yu, WEI Zi-ran, YANG De-jun, WANG Chang-ming, YAN Rong-lin     
Department of Gastrointestinal Surgery, Changzheng Hospital, Second Military Medical University, Shanghai 200003, China
Supported by Scientific Research Program of Shanghai Municipal Commission of Health and Family Planning (2014176) .
Abstract: Objective To examine the protein expression of Ras-association domain family 10 (RASSF10) in human gastric cancer and its association with clinicopathological parameters of prognosis in patients with gastric cancer. Methods A total of 105 gastric cancer specimens were collected in Changzheng Hospital, Second Military Medical University from Jan. 2008 to Dec. 2010. All patients had detailed clinicopathological data and were followed up for at least 5 years or till they were dead. Immunohistochemical (IHC) analysis was performed to detect RASSF10 expression in gastric carcinoma and adjacent normal tissues. The correlations between RASSF10 expression and clinicopathological factors, and patients' prognosis were evaluated through statistical analysis. Results The IHC results revealed that negative expression of RASSF10 was observed in 61.9% (65/105) of gastric cancer patients. The level of RASSF10 was significantly associated with the tumor size, pathological grade, pathological type, T stage and lymph node metastasis (all P < 0.05), but not correlated with age, gender, tumor site, distant metastasis or AJCC staging (all P > 0.05). Kaplan-Meier curve showed that negative expression of RASSF10 predicted significantly worsened prognosis of gastric cancer (P < 0.05). Multivariate Cox regression analysis indicated that RASSF10 expression (HR=0.528, P = 0.041) and AJCC stage (HR=4.994, P = 0.001) were independent prognostic factors for the survival of gastric cancer patients. Conclusion RASSF10 protein is down-regulated in gastric cancer tissues and is associated with a poor prognosis of gastric cancer, which indicates that RASSF10 may serve as a potential prognostic biomarker for gastric cancer.
Key words: RASSF10     stomach neoplasms     immunohistochemistry     prognosis    

Ras基因突变在人类肿瘤的发展及恶性进展中起着至关重要的作用[1-2]。Ras癌基因参与调节多种生物过程，包括细胞生长与分化、膜转运、转录调控及细胞凋亡等[2-3]。近年来，研究者相继鉴定出编码Ras相关区域基因，称为Ras相关区域家族(Ras-association domain family,RASSF)[4-5]。脊椎动物RASSF包含10个成员[6-7]，其家族许多成员已被证实具有抑制多种肿瘤生长以及促进肿瘤凋亡的能力[4, 8-12]。RASSF10属于RASSF家族新发现的成员。先前已有报道发现RASSF10在多种正常组织中均有表达，而在肿瘤组织中频繁出现表达异常[13]。本课题组既往研究证实，RASSF10在胃癌细胞系中表达缺失，同时功能学实验表明胃癌细胞系中过表达的RASSF10可抑制细胞生长和菌落形成能力，进而促进细胞凋亡的发生[14]。本研究通过检测胃癌组织和正常胃组织中RASSF10的表达情况，分析RASSF10表达与胃癌临床病理学参数的关系，以期为评判胃癌预后提供依据。

1 资料和方法 1.1 一般资料

选取第二军医大学长征医院2008年1月至2010年12月经10%甲醛固定和石蜡包埋的胃癌组织和相对应的癌旁组织切片各105例。所有患者均经病理诊断确诊为胃癌腺癌。患者术前均未行放疗、化疗、分子靶向治疗、生物基因治疗等。患者临床资料完整。此研究经第二军医大学伦理委员会批准，患者均签署知情同意书。

1.2 主要试剂

兔抗RASSF10多克隆抗体购自艾博抗上海有限公司(ab189999)。山羊抗鼠多克隆IgG抗体购自Arigo生物公司(ARG65350)。DAB辣根过氧化物酶显色试剂盒购自Beyotime生物科技有限公司(P0202)。免疫组化试剂盒购自谷歌生物有限公司(G1210)。其他免疫组化所用试剂均购自Beyotime生物科技有限公司。

1.3 免疫组织化学法检测RASSF10蛋白表达

采用链霉菌抗生物素蛋白-过氧化物酶法(SP)进行免疫组织化学染色。使用10%甲醛固定胃癌组织标本后石蜡包埋。将蜡块固定于切片机，纵行4 μm连续切片，石蜡切片脱蜡水化后用新鲜配制的3%过氧化氢液进行室温封闭，PBS清洗干净后滴加正常山羊血清封闭液室温封闭30 min，滴加1∶200稀释比例的抗RASSF10一抗4℃孵育过夜，37℃生物素化复温1 h后滴加山羊抗鼠二抗(ARG65350，1∶500) 孵育0.5 h，按照染色试剂盒说明滴加HRP标记工作液，DAB显色。苏木素复染1 min并脱水后，使用中性透明树胶封片，室温放置至胶凝固。PBS液代替一抗作为阴性对照。

1.4 免疫组织化学结果判定

在临床和病理双盲的情况下，由第二军医大学长征医院2名有经验的病理科医师对所有切片在显微镜下(×100)观察RASSF10染色结果，采用半定量分析法，先按阳性细胞比例将0、1％～25％、26％～50％、51％～75％、76％～100％分别计为0～4分，再按染色强度将无、弱、中、强分别计为0～3分，两者相乘之积作为免疫组织化学半定量积分。 积分 <2者判定为表达阴性，积分≥2者为表达阳性。

1.5 统计学处理

所有数据采用SPSS 21.0软件进行分析。RASSF10与临床病理学参数的关系采用χ2检验和Fisher确切概率法分析。生存曲线分析采用Kaplan-Meier法，两组间的差异采用Log-rank检验。与生存率相关的预后因素的单因素和多因素分析采用Cox风险回归模型分析。检验水准(α)为0.05。

2 结 果 2.1 RASSF10在胃癌组织中的表达

免疫组织化学染色显示，RASSF10主要定位于细胞质(图 1)。105例胃癌组织中RASSF10阳性表达率为38.1%(40/105)，低于癌旁组织(61.9%，65/105)，差异具有统计学意义(P<0.05)。

图 1 RASSF10在胃癌组织(A)和相应癌旁正常组织(B)中的表达 Fig 1 RASSF10 expression in gastric cancer tissues (A) and adjacent normal gastric mucosa (B) RASSF10: Ras-association domain family 10. Original magnification: ×100

2.2 RASSF10在胃癌中的表达水平与临床病理学参数的关系

对RASSF10表达与患者的临床病理资料的关系进行分析，结果显示RASSF10的表达水平与病理学分级、病理类型、肿瘤大小、T分期、淋巴结转移等有关(P<0.05)，而与患者年龄、性别、肿瘤部位、远处转移、AJCC分期等无关,详见表 1。

表 1 胃癌组织中RASSF10表达情况和临床病理学参数的关系 Tab 1 Association of RASSF10 expression with clinicopathological parameters in gastric cancer patients

2.3 RASSF10表达与胃癌患者预后的关系

所有患者至少随访5年或随访至死亡。患者5年生存率为34.7%，生存曲线见图 2A。RASSF10表达阳性患者5年生存率为56.4%，RASSF10表达阴性患者5年生存率为25.5%。Kaplan-Meier生存曲线分析(图 2B)显示RASSF10阳性表达组中位生存时间为47.9个月，RASSF10阴性表达组中位生存时间为34.8个月，Log-rank检验显示差异有统计学意义(P<0.05)。单因素Cox分析提示胃癌患者的预后与RASSF10表达、T分期、淋巴结转移、远处转移和AJCC分期等有关，将其纳入多因素分析后显示RASSF10、AJCC临床分期是影响总体生存率的独立危险因素(P<0.05，表 2)。

图 2 105例胃癌患者的生存曲线 Fig 2 Survival curves of 105 patients with gastric cancer A: Overall survival curves of 105 patients with gastric cancer; B: Survival curves of gastric cancer patients with different RASSF10 expression statuses. RASSF10: Ras-association domain family 10

表 2 影响胃癌预后的单因素和多因素分析 Tab 2 Univariate and multivariate analyses of overall survival of gastric cancer patients

3 讨 论

胃癌是严重危害人类健康的最常见的恶性肿瘤之一，是世界上仅次于肺癌、乳腺癌、结肠癌的第4大高发肿瘤，并且是全球范围内死亡率排名第2的恶性肿瘤[15]。尽管胃癌的诊断和治疗已取得了较大进展，但其总体预后仍然较差，能得到根治性手术的胃癌患者只有50%左右，这也导致了其5年生存率一直较低[16]。胃癌的发病过程是一个集遗传、环境和生活习惯于一体的复杂过程，确切发病机制目前仍不清楚。因此，深入研究胃癌发生、发展的分子机制，探寻能够准确评判胃癌预后的生物标记物及临床治疗的有效治疗靶点，具有重要的临床意义。

RASSF10是新近发现的RASSF家族成员，其基因位于11p15.2，含1 952个碱基。既往研究已经将RASSF10视为一个潜在的肿瘤抑制基因，并且其mRNA表达水平在脑胶质瘤[17]、甲状腺癌[13]等恶性肿瘤原发灶和转移灶均有明显的下降。本研究旨在更好地阐明RASSF10在胃癌发病中所起的作用。通过免疫组织化学染色方法的检测结果显示，RASSF10在胃癌组织中表达阳性率为38.1%，远低于癌旁组织中RASSF10的表达阳性率(61.9%，P<0.05)。通过对临床病理资料采用统计学软件分析显示，胃癌患者的肿瘤大小、病理学分级、病理类型、T分期、淋巴结转移等与胃癌组织中RASSF10的表达关系密切(P<0.05)，而与胃癌患者性别、年龄、肿瘤部位、远处转移、AJCC分期等无关(P>0.05)。肿瘤远处转移、AJCC分期与RASSF10阳性率无关，或许是因为大部分已发生远处转移的晚期肿瘤患者选择保守治疗而非手术，因而纳入研究进行分析的手术切除标本并不具备代表性。预后因素分析显示，RASSF10阴性表达患者的5年生存时间(率)低于RASSF10阳性表达患者，分别是34.8个月(25.5%)和47.9个月(56.4%)。

综上所述，RASSF10蛋白在胃癌中的表达异常下调，且其表达水平与胃癌患者不良预后密切相关，提示RASSF10蛋白在胃癌发生、发展中可能发挥重要作用，可作为治疗和判定预后的预测因子。本研究仍存在诸多不足之处，如纳入样本量较小、影响胃癌预后的因素分析不全面，未能将手术、化疗、放疗、综合治疗等方面进行分层分析等，未来需要进一步增加样本量，扩大对影响因素的分析，进一步确定RASSF10与胃癌患者预后相关因素的关系。

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