近年来，随着人口老龄化加速，越来越多的人为关节软骨损伤而烦恼，在这其中，尤以骨关节炎(osteoarthritis，OA)患者为重。OA是一种由多因素引起的退行性病变，以关节软骨退化、关节边缘和软骨下骨反应性增生为特征，临床表现为缓慢发展的关节疼痛、压痛、僵硬、关节肿胀、活动受限和关节畸形等。OA的形成涉及多种病理机制，包括细胞外基质的降解、新基质的生成不足、细胞凋亡、软骨细胞肥大化(即软骨细胞出现去分化现象，导致软骨细胞体积增大、增殖能力和细胞的基本功能丧失、细胞外基质无法分泌，成为肥大化细胞)等^[1]。关节软骨在关节的活动中至关重要，但由于其中缺乏血管和神经，人体自身对关节软骨的修复能力十分有限，临床上用于治疗OA最有效的方法为手术——关节置换，但该方法有可能引起诸多不良反应，并且价格昂贵，且只适用于晚期的OA患者。目前对于早期的OA患者尚缺乏有效的治疗手段，大多数方法只能暂时缓解患者的症状，无法延缓或阻止OA的进程。在针对OA方面，我们亟需一种更为简便和有效的治疗手段。目前，关节腔内注射药物在世界范围内应用广泛，如注射糖皮质激素、透明质酸钠等，但是，这些抗炎药和止痛药只能暂时缓解症状，并不能从根本上解决问题，无法使损伤的关节软骨再生，难以使患者获得长期良好的疗效。近年来，大量的研究了探讨干细胞作为软骨再生药物的疗效，使用组织工程干细胞定向分化的方法再生关节软骨已经成为研究热点。间充质干细胞(mesenchymal stemcell，MSC)具有向各种细胞分化的潜能，如果能促进MSC向软骨细胞分化则对治疗OA具有重要意义。而最2012年，一种新的小分子化合物kartogenin(KGN)被发现，它拥有极强的促软骨分化能力。KGN是由Johnson等^[2]从22000多种结构不同的杂环类药性分子中筛选出的一种复合物，能有效地促进骨髓间充质干细胞(bone marrow-derived mesenchymal stem cell,BMSC)向软骨细胞分化。本文就KGN对于软骨修复的研究进展作一综述。

Johnson等^[2]研究发现，加入KGN后软骨细胞相关的基因产物明显增加，在5组(DMSO、10 nmol/L KGN、 100 nmol/L KGN、1 μmol/L KGN、10 μmol/L KGN)中，加入KGN组的聚集蛋白聚糖、Ⅱ型胶原、lubricin蛋白、盘状结构域受体(discoidin domain receptor，DDR)表达均较DMSO对照组增加,而骨钙蛋白表达降低，其中以10 μmol/L KGN结果最为显著。同时，为期21 d的软骨小球培养后发现，在加入KGN后，金属蛋白酶Ⅰ的抑制剂、Ⅱ型胶原和聚集蛋白聚糖含量均增多，这可以保持软骨表型并阻止基质金属蛋白酶(matrix metalloproteinase，MMP)对细胞外基质的进一步破坏。通常，胶原生成的增加常与OA软骨中MMP的活性增加有关^[3]。然而，KGN并不改变MMP-3、MMP-13或者聚蛋白多糖酶的表达^[2]。

在牛初代软骨细胞和软骨移植物中加入肿瘤坏死因子α(tumor necrosis factor α,TNF-α)和制瘤素M，模拟在OA病理过程中细胞因子引起的损伤，实验结果显示软骨细胞较对照组释放了4～5倍的一氧化氮(nitric oxide,NO)。而加入1～5 μmol/L KGN后,NO的释放量减少了70%。在体外软骨组织块中加入5 μmol/L KGN,细胞因子引起的糖胺聚糖(glycosaminoglycan, GAG)的释放量减少了60%^[4]。这些数据证明，KGN可在OA的病理环境中保护已存在的软骨细胞。Johnson等^[2]设计了2种不同的大鼠OA模型，一种以关节内注射Ⅶ型胶原酶模拟慢性关节损伤，另一种则以切断膝关节内的3条主要韧带模拟急性关节损伤。在慢性损伤模型中，向关节腔内注射KGN的实验组较对照组表现出关节软骨表层和中层纤维化的减少以及软骨寡聚基质蛋白(cartilage oligomeric matrix protein,COMP)的明显减少。而COMP在OA者血清中浓度较高且与病变严重程度有关^[5]。在急性损伤模型中，关节腔内注射了KGN的实验组其胫骨外侧平台关节评分(基于OARSI评分系统)较对照组降低了50%，而Ⅱ型胶原碎片实验组较对照组明显减少，对照组为实验组的1.8倍，OA引起的疼痛也明显减轻(通过双足平衡测痛仪评估)。且在动物实验中未观察到任何毒性反应^[2]。这表明KGN不仅具有修复关节软骨作用，还对原有的关节软骨具有保护作用。

KGN通过与其配体细丝蛋白A(filamin A，FLNA)结合发挥作用。FLNA是一种肌动蛋白结合蛋白，可与肌动蛋白结合以连接细胞内的纤维网络和膜蛋白，它除了可作为KGN的配体与KGN结合外，还与核结合因子β(core-binding factor β，CBF-β)结合。通常，FLNA与CBF-β结合形成复合体保存在细胞质中，当CBF-β激活后，其与FLNA分离而后进入细胞核中。而KGN可以与CBF-β在细胞质中竞争性结合FLNA，从而增加CBF-β进入细胞核中的量，使其与DNA转录因子RUNX1结合形成二聚体，而CBF-β-RUNX1二聚体可以激活对于促进MSC向软骨分化具有重要作用的基因。同时，由于RUNX2是骨生成和软骨细胞肥大化的关键因素，而敲除RUNX2基因后，可减少骨生成、抑制软骨细胞肥大化、抑制软骨钙化,甚至延缓OA的进程^[6]。而CBF-β-RUNX1二聚体同时可以抑制RUNX2的转录，使其保持在较低水平，从而抑制软骨细胞肥大化，进一步增强成软骨作用。

Ono等^[7]发现单独使用KGN时并不能显著增加软骨细胞的细胞外基质。使用白介素-1β (interleukin 1β,IL-1β)可导致细胞外基质减少，在软骨细胞培养中加入10 ng/mL IL-1β，实验组加入10 μmol/L KGN，对照组加入等量DMSO，共同培养48 h后，通过颗粒排阻试验(particle exclusion assay)^[8]证明，加入KGN与IL-1β共培养的实验组其细胞外基质破坏更少，这表明KGN阻断了IL-1β对于软骨细胞细胞外基质的损害。在使用睾丸透明质酸酶预处理过的细胞外基质受到破坏的软骨细胞中加入KGN后，与对照组相比可见明显的细胞外基质的修复。单独使用KGN培养的新生软骨与未加KGN培养的新生软骨使用番红精O染色发现并无明显区别。使用IL-1β培养的新生软骨其番红精O染色明显减弱，而使用IL-1β与KGN共同培养者则可见明显抑制IL-1β的作用。单独使用IL-1β可明显促进关节软骨中蛋白聚糖的释放增加，而单独使用KGN并不能显著减少关节软骨中蛋白聚糖的释放。当KGN与IL-1β共培养时，则能显著抑制IL-1β的作用从而使蛋白聚糖的释放减少。IL-1β可促进G1-ITEGE、ADAMTS4和ADAMTS5的释放，而当KGN与IL-1β共培养时，可明显抑制IL-1β引起的G1-ITEGE、ADAMTS4和ADAMTS5的释放。CD44受体在保存及固定糖胺聚糖透明质酸和蛋白聚糖方面具有重要作用，在骨性关节炎的病理过程中，CD44会被裂解。在加入IL-1β后，CD44的裂解片段显著堆积，而当KGN与IL-1β共同作用时，CD44的裂解片段则显著减少。此外，单独加入KGN后，软骨细胞中的SMAD1/5/8的磷酸化作用并未激活，而预先使用IL-1β刺激过后加入与之前同等剂量的KGN后，SMAD1的磷酸化作用显著增强。上述结果表明，KGN更为主要的作用是阻止软骨的退变，强于其促进软骨修复的作用。相比较而言，其阻止IL-1β对软骨细胞的损伤作用较其自身对于软骨的修复作用更为显著。KGN的主要作用是阻止CD44和蛋白聚糖的降解，而并非促进其合成，当软骨细胞溶解被激活后(通过IL-1β、TNF-α或oncostatin M等)，KGN的该作用就显得极其重要。因此，KGN的主要作用机制是，通过影响蛋白聚糖酶和CD44的溶蛋白性裂解作用，从而保护软骨细胞，抑制其降解退变。

Lubricin是一种具有软骨保护作用的黏液糖蛋白，它是关节软骨表层的特异性标志。随着患者年龄的增大或体外实验中细胞培养周期的延长，软骨细胞分泌lubricin的能力显著降低^[9]。在BMSC中加入适当的细胞因子，如转化生长因子β1( transforming growth factor β1,TGF-β1)、骨形态发生蛋白(bone morphogenetic protein,BMP)-2/7/13等，可促进BMSC分化为软骨细胞并维持合成和分泌lubricin的能力^{[9 , 10 , 11]}。Liu等^[12]为了测定KGN、TGF-β1和MMP-7对于促进BMSC向软骨细胞分化后分泌lubricin的能力进行了体外实验，实验设计分为4组：同时加入TGF-β1、BMP-7和KGN[(T+B+K)组]; 单独加入KGN(K组); 同时加入KGN和TGF-β1[(T+K) 组]; 同时加入BMP-7和KGN[(B+K)组]。结果显示，GAG相对定量测定结果显示(T+B+K)组含量最高，几乎达到了对照组的4倍，其余各组与对照组相比也有轻微的升高，但各组间差异无统计学意义。ELISA测定lubricin相对定量表达结果显示，在细胞内，4组的lubricin含量均显著增高，较对照组增加至4～6倍，其中(T+B+K)组含量最高，且与其余组差异有统计学意义。而在细胞外，同样的，(T+B+K)组lubricin含量最高，而其余组的改变并不是十分显著，其中K组和(B+K)组lubricin含量轻微增高，而(T+K)组增高并不明显。免疫荧光染色分析显示，与其余组相比，(T+B+K)组的荧光反应最强。通过RT-PCR测定显示，与对照组相比，4组的lubricin相关mRNA表达也显著增加，其中以(T+B+K)组最为明显，增加到对照组的30倍，K组、(T+K)组、(B+K)组分别增加至对照组的3、4、12倍，这表明KGN与TGF-β1、BMP-7具有协同作用，三者联用可进一步促进lubricin合成。4组的蛋白聚糖相关mRNA也显著增加，而adamts5、c-Myc、Nrf2表达则显著降低。

微骨折术是一种常见的治疗全层软骨缺损的手段，它通过钻孔使BMSC达到缺损部位从而进行修复^{[13 , 14]}。然而，许多研究证明微骨折术的长期疗效并不理想，尤其是对于老年患者来说^[15]。Xu等^[16]对24只成年雌性大白兔进行膝关节微骨折术建模，将其分为2组，每组12只，实验组每周进行关节内注射KGN,对照组注射等量DMSO,于4周和12周时分别处死每组6只模型。随后进行大体评估(以International Cartilage Repair Society scoring system评分)、组织学评估(以modified O’Driscoll histology scoring system评分)和免疫组化分析。结果显示，4周时，实验组的软骨缺损处已修复覆盖了超过50%，而对照组只观察到少量纤维组织形成。12周时，实验组的软骨缺损处几乎已完全修复，与周围的正常软骨界限模糊，而对照组的纤维样再生组织只覆盖了缺损处大约80%。大体评分显示：实验组(10.0±1.1)分，对照组(7.8±1.3)分(P<0.05)。组织学分析显示对照组几乎未形成透明软骨样组织；4周时，甲苯胺蓝染色显示，在软骨缺损处对照组仅形成了少量纤维样组织；12周时，甲苯胺蓝染色和番红精O染色显示，对照组软骨缺损处的修复组织与周围的正常软骨存在着明显的界限，软骨下骨形成极少，修复组织排列紊乱，亦无潮标形成。而实验组在4周时形成了更多的透明软骨样组织，12周时其修复组织与周围正常软骨的界限已十分模糊，其软骨下骨形成良好，组织排列有序，亦有几乎完整的潮标形成。组织学评分显示：实验组(18.5±4.2)分，对照组(8.3±4.6)分(P<0.01)。免疫组化：加入KGN的实验组生成了较多的Ⅱ型胶原和较少的Ⅰ型胶原，对照组几乎未生成Ⅱ型胶原而生成了较多的Ⅰ型胶原。这表明，在软骨缺损处注射KGN能显著增强关节软骨的再生作用。

肌腱连接骨与肌肉的部位称为腱骨接点^[17]，其结构分别由肌腱、纤维软骨、骨构成^{[18 , 19]}。这其中，纤维软骨结构可作为减震器减少传递至肌腱的力量，而一旦腱骨接点损伤，机体自身难以在肌腱与骨的连接部位形成纤维软骨，而通常只能形成瘢痕愈合^{[20 , 21]}，并且手术修补重建的效果并不理想，难以达到损伤前的水平。Zhang等^[22]研究发现，在细胞实验中，BMSC和髌腱干/祖细胞(patellar tendon stem/progenitor cell，PTSC)在加入各种不同浓度的KGN(1 nmol/L～5 μmol/L)后细胞增殖能力均显著增强(通过细胞群体倍增时间测定)，软骨形成标志物蛋白聚糖、Ⅱ型胶原和SOX-9均明显增加，其中以加入5 μmol/L的KGN组最为明显，而番红精O和阿新蓝染色也证明了这一点。这表明KGN可以促进兔的BMSC和PTSC增殖以及增强成软骨分化能力，并具有剂量依赖性。在动物实验中，Zhang等设计了2种动物模型，在第1种动物模型中，在小鼠跟腱的腱骨接点处造成直径1 mm的损伤，而后分别在造模当天以及术后的2、4、7、12 d实验组注射10 μL的100 μmol/L KGN，对照组注射等量生理盐水。结果显示，在损伤处实验组形成了更加完整和成熟的软骨样组织，组织学分析显示，实验组中几乎90%的组织呈番红精O染色阳性，而对照组则几乎无阳性染色。在第2种动物模型中，不造成损伤，在对照组的髌腱处注射10 μL生理盐水，而实验组注射10 μL的100 μmol/L KGN。结果显示，实验组出现了明显的变化，其髌腱表面覆盖有一层薄膜样结缔组织，并伴有新生血管形成，组织化学染色进一步证实了实验组生成了大量的蛋白聚糖。这表明，KGN对于促进腱-骨愈合具有显著的作用。

关节腔内注射药物对比其他方法有以下优势：局部浓度较高，总体药物剂量较低，可避免系统性不良反应以及较少的药物相互作用^[23]。关节腔内注射药物的疗效主要取决于药物释放系统的效能，常见的关节腔内药物释放系统包括脂质体^{[24 , 25]}、水凝胶^[26]、纳米粒子^[27]和微粒^[28]等，其可以帮助药物在关节腔内维持更长时间并缓慢释放。CHI因其生物降解性、生物相容性以及较好的可溶性在药物释放系统中得到广泛研究^[29]。CHI-KGN是将KGN与CHI结合，以加强疏水性的KGN的水溶性和生物相容性，以期增强其疗效。Kang等^[30]将KGN分别与低相对分子质量CHI和中相对分子质量CHI结合，即纳米粒子CHI-KGN (CHI-KGN NPs) 和微粒CHI-KGN (CHI-KGN MPs),在体外释放实验中，CHI-KGN NPs 和CHI-KGN MPs均表现出持续性释放，而CHI-KGN MPs较CHI-KGN NPs释放了更多的KGN，这表明CHI-KGN微粒的大小影响了KGN的释放率。在体外成软骨分化实验中，使用BMSC进行软骨小球培养，共分为4组：CHI-KGN NPs组、CHI-KGN MPs组、单纯KGN组、空白对照组。结果显示，CHI-KGN NPs组和CHI-KGN MPs组的GAG含量显著增加，尤以CHI-KGN NPs组为甚，是单纯KGN组和空白对照组的2倍。番红精O和阿新蓝染色显示CHI-KGN NPs组反应最强，提示其蛋白聚糖合成增加。RT-qPCR结果显示，CHI-KGN NPs组、CHI-KGN MPs组和单纯KGN组的COL2A1和aggrecan表达较空白对照组均显著增加，以CHI-KGN NPs组增加最为显著，这表明3组均有促进BMSC向软骨细胞分化的作用，其中CHI-KGN NPs组作用最强。在动物实验中，荧光成像显示CHI-KGN在小鼠体内存在了3周以上的时间。实验采用切断小鼠的前交叉韧带来建造骨关节炎模型^[28]，分为5组：空白对照组、磷酸盐缓冲液(PBS)组、单纯KGN组、CHI-KGN NPs组和CHI-KGN MPs组。实验中除空白对照组外分别在第6周、第9周向小鼠关节腔内注射PBS、单纯KGN、CHI-KGN NPs和CHI-KGN MPs，14周时处死小鼠。结果显示，注射CHI-KGN的两组较其他组有明显的软骨再生，其OARSI评分^[31](骨关节炎病理学评分，反映骨关节炎的程度)也显著低于其他组，而CHI-KGN NPs组与CHI-KGN MPs组之间则无明显差别。番红精O染色和免疫组化结果也显示，CHI-KGN NPs组与CHI-KGN MPs组蛋白聚糖表达显著增加。这表明，在动物体内与GHI结合的KGN成软骨能力得到了进一步的增强。

随着组织工程的进一步发展，修复乃至再生软骨并非遥不可及，KGN并不是第1种被用于促进干细胞分化的人工合成小分子，还有许多其他的小分子被应用于各个领域来调节基因转录、影响细胞分化等。这些小分子对于某些特定的组织来说可能非常有用，比如软骨、神经组织这些难以移植的组织。对于KGN,未来可以研究的方向包括：(1)不同来源的干细胞在加入KGN后成软骨能力的比较；(2)KGN在成软骨方面与其他细胞因子是否存在协同作用。目前，小分子化合物的研究仍然十分热门，这给我们提供了许多新的方向，在不久的将来或许它将成为一种新的治疗方式。