中药白狼毒为大戟科植物月腺大戟(Euphorbia ebracteolata Hayata)和狼毒大戟(Euphorbia fischeriana Steud)的根^[1]。狼毒大戟主要分布在黑龙江、内蒙古、吉林、辽宁、河北等地，其味苦、辛，性平，有毒，入肺、肝、脾，具有泄水逐饮、破疾杀虫之功效^{[1 , 2 , 3 , 4 , 5 , 6]}。月腺大戟主产于河南、山东、江苏、安徽、湖北、湖南、浙江、福建等地，味辛，性平，有大毒，具有散结杀虫的功效，民间常用作驱虫、治疗肺结核和癌症^{[7 , 8]}。近年来白狼毒引起越来越多学者的注意，尤其是其中萜类和苯乙酮类^[9]的特有成分，表现出了显著的抗结核、抗癌、细胞毒等生物活性^{[10 , 11 , 12]}，但这些成分同时存在着一定毒性，制约着其使用。因此，进一步明确其生物活性与毒性的物质基础，以及它们之间的相互关系非常重要。

前期研究经植化分离提取得到化合物月腺大戟素A，初步的实验证明其对肝癌细胞具有一定的细胞毒作用，为白狼毒中具有抗肿瘤作用的活性物质。本研究采用高效液相色谱法(HPLC)建立该物质的含量测定方法，对狼毒大戟与月腺大戟中共有化合物月腺大戟素A的含量进行测定，为提高白狼毒有效部位提取纯化效率提供支持。

Agilent 1100 系列高效液相色谱仪(美国安捷伦公司)，包括G1379A型真空脱气机、G1311A型四元泵、G1367A型高性能自动进样器、G1316A型柱温箱、G1315A型二极管阵列检测器(DAD)；AE240型十万分之一电子天平(梅特勒-托利多瑞士有限公司)；XW-80A型漩涡混合器(上海医科大学仪器厂)；DJ-04粉碎机(上海定久仪器设备有限公司)；PW-型超纯水系统(香港力康公司)；KQ-250DE型医用数控超声波清洗器(昆山市超声仪器有限公司)；HH·S1-2电热恒温水浴锅(上海跃进医疗器械厂)。

狼毒大戟2个批次药材购自安徽(产地山东，批号：20140805、20141007)，经第二军医大学药学院生药学教研室的孙莲娜教授鉴定为狼毒大戟的根；月腺大戟对照药材购自中国药品生物制品鉴定所，批号120961-200303。月腺大戟素 A对照品(纯度>98%)购自上海诗丹德生物技术有限公司。乙腈为色谱纯(美国费希尔公司)，乙醇为分析纯(江苏强盛功能化学股份有限公司)，水为超纯水。

色谱柱 Agilent Zorbax SB-C₁₈(4.6 mm×150 mm，5 μm)，流动相：乙腈∶0.1%甲酸水溶液=55∶45，流速为1.0 mL·min^-1，柱温为25℃，紫外检测波长为290 nm ，进样量为20 μL，运行时间为20 min。

取药材适量，置粉碎机中打碎，过100目筛，取粉末约5.0 g，精密称定，置于100 mL锥形瓶中，加入40 mL无水乙醇，超声提取15 min，过滤，收集滤液；残渣同法再提取1次，合并2次滤液，置蒸发皿中，水浴(90℃)浓缩至3 mL，再转移至5 mL容量瓶中，用无水乙醇定容，经0.45 μm有机滤膜过滤，取续滤液待测。

精密称取月腺大戟素A对照品22.73 mg，置25 mL量瓶中，用甲醇溶解并定容，得浓度为0.909 mg·mL^-1的对照品储备液，置冰箱4℃保存。

分别取月腺大戟素A对照品、供试品溶液，按2.1项下色谱条件进行分析，记录色谱图，见图 1。结果表明月腺大戟素A的保留时间约为15.2 min，所得色谱峰与周围干扰峰的分离度均大于1.5，理论塔板数均大于9 000，拖尾因子0.964。

图 1 月腺大戟素A对照品及供试品色谱图 A： 对照品； B： 狼毒大戟药材 (批号20140805)； C： 狼毒大戟药材 (批号20141007)； D： 月腺大戟对照药材. 1： 月腺大戟素A

按逐级稀释法，精密量取月腺大戟素A对照品储备液适量，置于10 mL量瓶中，加入甲醇定容至刻度，得浓度分别为227.3、90.90、45.45、22.73、9.090、4.545 μg·mL^-1的系列对照品溶液，按2.1项下色谱条件进样分析，以浓度为横坐标(X)、色谱峰面积为纵坐标(Y)进行线性回归，得月腺大戟素A回归方程为：Y=73.08 X－116.86，r= 0.999 9，线性范围为4.545~227.3 μg·mL^-1。

取月腺大戟素A的对照品溶液倍数稀释后进行分析，以信噪比为10∶1确定其最低定量限为0.227 μg·mL^-1；以信噪比为3∶1确定其最低检测限为0.113 μg·mL^-1。

取月腺大戟素A低 (9.090 μg·mL^-1)、中(45.45 μg·mL^-1)、高(227.3 μg·mL^-1) 3个浓度的对照品溶液，按2.1项下色谱条件进样分析，在1 d内分别进样3次，以及连续3 d每天进样1次，考察日内、日间精密度。月腺大戟素 A低、中、高浓度的日内精密度分别为0.65%、0.41%及0.56%，日间精密度分别为1.26%、1.70%及0.83%，均小于2%，表明方法精密度良好。

取狼毒大戟药材(批号20141007)粉碎后过100目筛，取粉末约5.0 g，精密称定，按2.2项下方法制备供试品溶液，平行操作6份，按2.1项下色谱条件进样分析。计算得月腺大戟素 A的含量为54.94 μg/g，相对标准偏差(RSD，n=6)为1.35%，表明该方法重复性好。

取狼毒大戟药材(批号20141007)粉末约2.5 g，精密称定，置于50 mL锥形瓶中，再加入精确浓度为909 μg·mL^-1的月腺大戟素 A对照品储备液0.15 mL，按2.2项下方法制备供试品溶液，平行操作6份，按2.1项下色谱条件进样分析。结果月腺大戟素A的平均加样回收率为(99.1±3.4)%(n=6)。

取狼毒大戟药材(批号：20141007)粉末约5.0 g，精密称定，按2.2项下条件制备供试品溶液，分别于放置0、2、4、6、8、12 h时按2.1项下色谱条件进样分析。计算月腺大戟素A的RSD为1.4%，表明样品在12 h内稳定性良好。

分别取狼毒大戟的2个不同批次药材及月腺大戟对照药材粉末各约5.0 g，精密称定，按2.2项下条件制备供试品溶液，按2.1项下色谱条件进样分析，计算月腺大戟素A的含量。狼毒大戟(批号20141007)平均含量为(56.73±1.09) μg/g(n=6)，狼毒大戟(批号20140805)平均含量为(18.98±2.11) μg/g(n=6)，月腺大戟对照药材平均含量为(235.2±2.4) μg/g (n=6)。

采用正交设计法对影响超声提取结果的提取溶剂、倍数、时间及次数等4个因素进行优化，参考L₉(3⁴)正交设计表，各因素水平设置见表 1。取狼毒大戟药材(批号：201410007)适量，置粉碎机中打碎，过100目筛，取粉末约5.0 g，精密称定，置于100 mL的容量瓶中；按表1中设定的实验参数进行提取，过滤，滤液置水浴锅中浓缩，最后定容至5 mL容量瓶中，经0.45 μm有机滤膜过滤，取续滤液按2.1项下色谱条件进样分析，计算每个样品中月腺大戟素A的含量。以各样品中月腺大戟素A的含量作为衡量标准分别计算各实验结果的综合平均值K₁、K₂和K₃及其极差R，结果见表 1。

表 1 (Table 1)

表 1 正交试验结果 试验号 提取溶剂(A) 溶剂体积V/mL(B) 提取时间t/min(C) 提取次数(D) 月腺大戟素A含量 ρB/(μg·mL-1) 1 50%乙醇 30 15 1 22.53 2 50%乙醇 40 30 2 46.06 3 50%乙醇 50 60 3 44.28 4 75%乙醇 30 30 3 41.99 5 75%乙醇 40 60 1 39.96 6 75%乙醇 50 15 2 54.96 7 100%乙醇 30 60 2 46.79 8 100%乙醇 40 15 3 57.08 9 100%乙醇 50 30 1 40.12 K1 37.62 37.10 44.86 34.20 K2 45.64 47.70 42.72 49.27 K3 48.00 46.45 43.68 47.78 R 10.37 10.60 2.13 15.07

表 1 正交试验结果

K₁、K₂、K₃为水平均值，R为极值。由表1可以看出，对于因素A，K₃>K₂>K₁；对于因素B，K₂>K₃>K₁；对于因素C，K₁>K₃>K₂；对于因素D，K₂>K₃>K₁；最优组合应为A₃B₂C₁D₂。由R值可知，各因素对提取结果影响程度依次为：提取次数>溶剂体积>提取溶剂>提取时间。最终确定供试品溶液最优制备方法为2.2项下方法。

白狼毒中成分复杂，为达到定量分析要求，月腺大戟素A与干扰峰要完全分离。考察不同类型填料色谱柱对月腺大戟素A与杂质分离的影响，如Chromasil-C₁₈、Waters RP-C₁₈、Agilent Zorbax SB-C₁₈，发现在Agilent Zorbax SB-C₁₈ (4.6 mm×150 mm，5.0 μm)色谱柱上月腺大戟素A色谱峰与其他峰分离良好、保留时间合适、峰形对称，符合实验要求。

对流动相的组成及不同比例进行了考察，发现使用甲醇-水系统在等度洗脱的条件下月腺大戟素A的峰形较差，且与干扰峰不能很好地分离。采用乙腈-水系统能够明显改善峰形，在流动相中加入一定比例的甲酸有助于提高周围干扰峰的分离度；同时考察乙腈与0.1%甲酸水溶液的不同比例，由75∶25→65∶35→55∶45，最终确定流动相组成为乙腈∶0.1%甲酸水溶液＝55∶45时分离效果最佳。

采用DAD对月腺大戟素A在200~400 nm范围内的紫外吸收进行了全扫描，发现月腺大戟素A在230 nm及290 nm均有较好的紫外吸收，290 nm处有最大吸收，故选择290 nm作为检测波长。

本研究建立了HPLC测定月腺大戟和狼毒大戟中月腺大戟素A含量的方法，通过对不同类型色谱柱、流动相组成的考察，确定了最佳的色谱条件；方法学考察表明本方法能够用于对月腺大戟素A含量的测定。该方法前处理条件简便、测定结果准确可靠、重复性好，实用性强且溶剂消耗少、分析速度快，可用于白狼毒中月腺大戟素A的含量测定。