炎症性肠病(inflammatory bowel disease, IBD)是一种多种病因引起的、异常免疫介导的肠道慢性及复发性炎症，具有慢性迁延、难以治愈以及终生复发的倾向等特点，溃疡性结肠炎(ulcerative colitis, UC)和克罗恩病(Crohn disease, CD)是其主要的疾病类型。其病因和发病机制十分复杂，可能是由多种因素相互作用所致，包括环境、遗传、感染和免疫等。患者主要表现为反复发作的腹泻、腹痛、体质量下降以及血便等，但是临床上还没有彻底的根治策略。

临床以及基础研究证实雌激素具有调节多种炎症性疾病的能力，比如自发性高血压、骨性关节炎、牙周炎、慢性非细菌性前列腺炎、类风湿性关节炎、系统性红斑狼疮、多发性硬化症等，雌激素水平改变时，炎症的发生、发展都会受到影响^[1,2,3,4]。近年研究发现，IBD的发病率和患病的严重程度存在着明显的性别差异，女性比男性更容易患有此病^[5,6]，这种差异提示雌激素可能与IBD有关。生物体内雌激素水平改变，如怀孕、口服避孕药、绝经后都会引起IBD的变化^[5]，进一步提示雌激素在IBD发生和发展过程中发挥重要的调节作用。

雌激素作为一种类固醇激素，参与生物体内多种生理功能与病理过程的调控。临床现象表明机体雌激素的水平可以影响炎症，雌激素水平增高会加重炎症^[6,7,8]，也有研究表明雌激素对于炎症起到一定的保护作用^[5,9]，其机制还不明了。雌激素与膜受体GPR30结合后发挥快速效应，雌激素与雌激素受体(ER)α或ERβ结合，通过激素反应元件(ERE)启动转录和翻译过程，产生广泛的生物学效应^[10,11,12]。ERα在女性生殖系统中高表达^[13]，结直肠中也有ERα表达^[14,15]，同时许多研究也证实ERα与炎症的关系非常密切^[16,17]。

本实验通过建立大鼠IBD模型，观察分别应用雌激素和ERα特异性激动剂PPT、雌激素+ERα特异性拮抗剂MPP之后IBD大鼠炎症改变情况，探讨雌激素是通过何种途径影响IBD。

成年雌性Sprague-Dawley大鼠，体质量160~200 g，购自上海西普尔-必凯实验动物有限公司，动物许可证号：SCXK(沪)2013-0016，所有动物均可以自由饮食和饮水。在IBD模型建立成功后，大鼠随机分为生理盐水组和致炎组；在研究雌激素对IBD鼠的调节作用中，大鼠随机分为致炎对照组和雌激素处理组；在研究PPT对IBD鼠的调节作用中，大鼠随机分为致炎对照组和PPT处理组。在研究MPP对雌激素处理的IBD鼠调节作用中，大鼠随机分为雌激素处理组和雌激素+MPP组。2,4,6-三硝基苯磺酸(TNBS)和雌激素购自Sigma公司，PPT和MPP购自Tocris公司。

实验性结直肠炎利用30%的TNBS乙醇溶液(40 mg/kg)灌肠进行诱导，在灌肠之前大鼠禁食24 h。将直径为6-Fr的塑料软管连接到1 mL的注射器，经肛门置入大鼠结直肠内，至软管前端距离肛门8 cm处缓慢注入TNBS乙醇溶液，轻轻取出塑料软管后保持大鼠不低于60°角静置30 s。在TNBS灌肠之后每天记录不同组大鼠体质量及疾病活动指数(disease activity index, DAI)评分，连续4 d后将大鼠处死，取结直肠组织进行H-E染色。

检测记录大鼠体质量、粪便性状、有无便血，取大鼠结肠进行H-E染色，确定结肠炎造模是否成功。TNBS致炎后大鼠体质量下降，DAI评分升高，结直肠长度变短，H-E染色可见明显炎性细胞浸润，结直肠髓过氧化物酶(MPO)浓度降低，即为结肠炎模型成功。DAI评分计分标准：体质量无减轻，粪便呈正常粒状，无便血，均计0分；体质量下降≤5%计1分；体质量下降>5%且≤10%，粪便松软(轻微粘连)，粪便带血，均计2分；体质量下降>10%且≤20%计3分；体质量下降>20%，稀便(水样便)，便血，均计4分。DAI评分为体质量变化、粪便性状以及有无便血情况3个参数评分的总和。

在注射TNBS乙醇溶液或生理盐水后的第4天，也即是结直肠炎症发展的顶峰时，分别给予不同组大鼠皮下注射生理盐水(500 μL)，雌激素(1 mg/kg, 溶于500 μL生理盐水)、PPT(3 mg/kg, 溶于500 μL生理盐水)，雌激素(1 mg/kg，溶于500 μL生理盐水)+MPP(1 mg/kg, 溶于500 μL生理盐水)，继而观察不同组大鼠体质量及DAI评分的变化。

连续给药4 d后将大鼠处死，取距肛门4 cm结直肠至回盲部结直肠，进行大体形态观察，比较大体炎症损伤改变。在生理盐水中清洗干净后分别置于4%的多聚甲醛溶液中固定48 h，然后放入30%的蔗糖溶液中进行脱水，直至沉入溶液底部。进行冰冻切片前取出，用1×PBS进行简单清洗，然后包埋于组织冰冻介质(OCT包埋胶，Amresco公司，美国)中。在冰冻切片机(Leica CM-1900)中切成厚度为10 μm的组织薄片，贴于预先涂有多聚赖氨酸的载玻片上，37℃烤2 h后备用。用H-E染色试剂对组织切片进行染色。所有冰冻切片均在奥林巴斯BH-2型光学显微镜(GMI公司,美国)下进行观察，并用Motic Images 2000软件进行拍照，观察比较各组结直肠组织病理学变化。

以每克组织在37℃的反应体系中分解1 μmol的H₂O₂计为1个酶活力单位，计算组织中MPO的含量。距肛门4 cm处取结直肠组织1 cm，液氮中速冻，置于-80℃保存，在1周内检测MPO活性。在48孔板中每孔加入100 μL标准品MPO或待测样品(结直肠组织匀浆液)，充分混匀后置37℃孵育40 min。洗涤液充分洗涤，每孔加蒸馏水和第一抗体生物素标记的抗大鼠MPO抗体各50 μL(空白除外)，充分混匀后置37℃孵育20 min。洗涤液充分洗涤，每孔加100 μL辣根过氧化物酶(HRP)标记的链霉亲和素后置37℃孵育10 min。洗涤，每孔加100 μL底物(TMB)后置37℃暗处反应15 min，然后每孔加入100 μL终止液硫酸混匀，用酶标仪测定450 nm处光密度(D)值。所有D值减去空白值后再行计算。以标准品1 000、500、250、125、62.5、31.2、15.6、0 pg/mL为横坐标，D值为纵坐标，画出标准曲线。根据样品D值计算出MPO值。

实验数据分析使用 SPSS 13.0 软件，作图采用 Origin 7。所有数据均以x±s表示，两组大鼠体质量以及DAI评分的比较采用双因素多水平重复测量方差分析，两组大鼠结直肠长度以及两组大鼠MPO值的比较采用单因素方差分析，组内两两比较用方差分析后的Student-Newman-Keuls 检验。检验水准(α)为0.05。

结果显示，与生理盐水对照组相比，致炎组大鼠体质量降低(P＜0.05或P＜0.01，图 1A)；DAI评分升高(P＜0.01，图 1B)；结直肠长度缩短(P＜0.05，图 1C、图 1D)；H-E染色显示致炎组大鼠的结直肠则肠壁结构严重损伤，内膜充血水肿明显，甚至缺损，固有层炎性细胞浸润明显，而生理盐水对照组大鼠的结直肠完好无损，肠壁结构清晰，层次分明，无充血水肿，仅有少量炎性细胞浸润(图 1E)；致炎组MPO值增加(P＜0.05，图 1F)。以上结果说明TNBS灌肠致大鼠IBD模型成功建立。

图 1 TNBS诱导大鼠IBD模型成功建立 Fig 1 Rat IBD model induced by intracolonic administration of TNBS TNBS: 2,4,6-trinitrobenzenesulfonic acid; IBD： Inflammatory bowel disease; DAI:Disease activity index；MPO：Myeloperoxidase. Changes in body mass (A) and DAI scores (B) of rats 4 d after application of TNBS or saline though rectocolon (n=6, x±s；*P<0.05, **P<0.01 vs saline group). Changes in colon length (C，D) and H-E staining (E) of rats 4 d after application of TNBS or saline though rectocolon (colitis group, n=9; saline group, n=10. x±s. *P<0.05 vs saline group. Original magnification:×10). Changes in the concentration of MPO (F) in rectocolon 4 d after application of TNBS or saline through rectocolon (n=5, x±s； *P<0.05 vs saline group)

结果显示，与致炎对照组相比，雌激素干预组大鼠的体质量降低(P<0.05，图 2A)，而DAI评分增高(P<0.05，图 2B)，结直肠长度缩短(P<0.01，图图 2C、图 2D)。注射生理盐水的结肠炎大鼠肠壁结构紊乱，内膜充血水肿，固有层大量炎性细胞浸润，炎症反应明显；在雌激素干预后，大鼠肠道的上述症状更为严重(图 2E)。结果提示，雌激素可以加重IBD的临床症状。

图 2 雌激素干预后IBD大鼠症状的改变 Fig 2 Changes in general status of IBD rats after application of estrogen TNBS: 2,4,6-trinitrobenzenesulfonic acid; IBD： Inflammatory bowel disease; DAI: Disease activity index; E2: Estradiol. Changes in body mass (A) , DAI scores (B) and H-E staining (E) of rats after 4-day subcutaneous application of saline or estrogen on the fourth day after TNBS or saline administration (n=7, x±s; *P<0.05 vs colitis+saline group. Original magnification:×10).Changes in colon length(C, D) of rats 4 d after application of saline or estrogen on the fourth day after TNBS or saline administration (n=8, x±s; **P<0.01 vs colitis+saline group)

结果显示，与致炎对照组相比，从第6天开始PPT干预组大鼠的体质量降低有统计学意义(P<0.05，图 3A)，而从第5天开始DAI评分增高有统计学意义(P<0.05，图 3B)，结直肠长度则缩短(P<0.05,图图 3C、图 3D)。注射生理盐水的结肠炎大鼠肠壁结构紊乱，内膜充血水肿，固有层大量炎性细胞浸润，炎症反应明显；在PPT干预后大鼠肠道染色的上述症状更为严重(图 3E)。结果提示，ERα受体激活加重IBD的临床症状。

图 3 ERα激活后IBD大鼠症状的改变 Fig 3 Changes in general status of IBD rats after ERα activation PPT： 4,4’,4”-(4-propyl-[1H]-pyrazole-1,3,5-triyl) trisphenol; TNBS: 2,4,6-trinitrobenzenesulfonic acid; ERα: Estrogen receptor alpha; IBD： Inflammatory bowel disease; DAI: Disease activity index. Changes in body mass (A), DAI scores (B), colon length (C, D) and H-E staining (E) of rats after 4-day subcutaneous application of saline or PPT on the fourth day after TNBS or saline administration. n=6, x±s; *P<0.05 vs colitis+saline group. Original magnification:×10

结果显示，与单独注射雌激素组相比，从第6天开始雌激素+MPP组大鼠体质量增加有统计学意义(P<0.05或P<0.01，图 4A)，而从第6天开始DAI评分降低有统计学意义(P<0.01，图 4B)，结直肠长度则显著变长(P<0.01，图图 4C、图 4D)。结果提示拮抗ERα可以逆转雌激素对IBD的促炎效应。

图 4 雌激素和MPP干预后IBD大鼠症状的改变 Fig 4 Changes in general status of IBD rats after application of estrogen and MPP E2: Estradiol; MPP：1,3-Bis(4-hydroxyphenyl)-4-methyl-5-[4-(2-piperidinylethoxy)phenol]-1H-pyrazole dihydrochloride; TNBS: 2,4,6-trinitrobenzenesulfonic acid; IBD：Inflammatory bowel disease; DAI: Disease activity index. Changes in body mass (A), DAI scores(B), and colon length (C, D) of rats after 4-day subcutaneous application of estrogen or estrogen+MPP on the fourth day after TNBS administration. n=8, x±s; *P<0.05, **P<0.01 vs colitis+E2 group

我们通过TNBS诱导实验性结直肠炎(即IBD模型)，以动物体质量、DAI评分以及MPO含量等为检测指标，验证了模型建立成功。结果发现，IBD诱导后，雌激素(17β-雌二醇)连续给予4 d，可加重IBD大鼠肠道炎症反应。雌激素干预组大鼠的体质量降低，而DAI评分增高，结直肠长度变短。注射生理盐水的结肠炎大鼠肠壁结构紊乱，内膜充血水肿，固有层大量炎性细胞浸润，炎症反应明显；在雌激素干预后，大鼠肠道上述症状更加严重。以上结果提示，雌激素可以加重IBD的临床症状。

ERα激活后可以模拟雌激素的大部分作用，如促进乳腺和子宫发育，稳定血管舒缩以及治疗骨质疏松等^[3,4]。Cook等^[5]研究发现，ERα敲除组小鼠IBD的发病率减少，疾病严重程度也降低。选择性激动肠道炎症小鼠ERα，并没有改善小鼠的肠道炎症。研究表明，不论健康人群还是IBD患者，女性ERα基因的增强子水平均高于男性^[2]，这些差异可能即是雌激素不同作用效果的内在机制。我们通过采用ERα特异激动剂替代雌激素，在灌注TNBS乙醇溶液诱导结直肠炎第4天的大鼠中分别皮下注射生理盐水或PPT，观察不同组大鼠体质量及DAI评分的变化。结果显示，与致炎对照组相比，PPT干预组大鼠的体质量降低，DAI评分显著增高，结直肠长度显著变短，肠壁结构严重受损，内膜充血水肿，固有层炎性细胞浸润症状更明显。因此，以上结果提示，ERα激活可以显著加重IBD的临床症状，与雌激素的效果一致。

为了进一步验证雌激素对IBD的促炎效应是通过ERα来完成的，我们通过给予ERα特异性拮抗剂MPP，观察雌激素的效应是否受到拮抗。相关研究目前在国内外也尚未见报道。本研究结果显示，给予皮下注射ERα特异性拮抗剂MPP连续4 d后，雌激素+MPP大鼠体质量增加，DAI评分降低，结直肠长度变长，给予MPP可明显缓解雌激素引起的IBD鼠肠道的严重炎症。结果提示，抑制ERα可以逆转雌激素对IBD的促炎效应，雌激素对TNBS诱导IBD鼠的促炎效应可能是通过ERα来完成的。当然，由于雌激素受体存在类似的核受体ERα以及膜受体GPR30等，雌激素对于IBD发生、发展进行调节的具体机制还需要进一步研究。

综上所述，本实验结果表明， 雌激素可以加重IBD大鼠的症状，且其作用机制可能是雌激素通过作用于ERα促进大鼠IBD的发生发展。因而，对于ERα的干预可以成为将来IBD临床治疗的可选手段之一。