肝细胞癌(hepatocellular carcinoma, HCC)是全球最常见的恶性肿瘤之一，具有致死率高的特点^[1],且每年有近一半的死亡病例发生在中国^[2]。由于肝癌患者在就诊时多数已经进入中晚期，即使对肿瘤进行手术切除，术后依然存在较大的复发风险，累积5年复发率接近70%～80%^[3]。因此，早发现、早诊断对有效改善肝癌患者的预后具有十分重要的意义。

目前，对肝癌的诊断技术主要分为两大类。一类是影像学检查，包括腹部超声波扫描、增强计算机断层扫描(computed tomography，CT)或磁共振成像(magnetic resonance imaging，MRI)。然而，影像学检查难以发现小病灶，无法准确诊断早期肝癌。另一类是实验室诊断标志物检测，例如甲胎蛋白(α-fetoprotein, AFP)、脱γ羧基凝血酶原(des-gamma-carboxy prothrombin, DCP)。尽管血清AFP作为诊断标志物已经在临床被广泛使用，但在早期肝癌患者中，单独使用AFP作为诊断标志物的假阴性率高达40%。包括晚期患者在内，15%～30%患者的血清AFP仍处于正常水平^[4]。据统计，AFP的敏感性和特异性分别仅为39%～64%和76%～94%^[5]。因此，单独应用AFP已经无法满足诊断的要求，迫切需要寻找新的循环血诊断标志物用来替代AFP，或者与AFP联合应用，以提高肝癌筛查和诊断的准确性。近些年，将循环血中长链非编码RNAs(long non-coding RNAs,lncRNAs)作为肿瘤的诊断标志物逐渐成为研究的热点，本文就其作为肝癌诊断标志物的研究进展作一综述。

LncRNAs通常是指长度大于200nt，不具备蛋白质编码能力的一类RNA。目前揭示lncRNAs能够发挥许多重要的生物学功能，包括X染色体失活和基因组印迹、基因表达调控、细胞周期调节、蛋白质组装及染色体修饰^[6]。大量研究显示，肿瘤组织中lncRNAs水平的异常变化与肿瘤的发生、增殖、侵袭、转移以及预后多个环节密切相关，并提示lncRNAs可以作为肿瘤的诊断标志物和治疗靶点，为肿瘤研究和治疗提供了新的思路^{[7,8,9,10,11, 12]}。

相较于蛋白编码基因，lncRNAs作为诊断标志物有如下优势：(1)lncRNAs发挥生物学功能的方式复杂多样，参与了RNA、DNA和蛋白质的生物合成及功能等多层次、多水平的调控^[13,14,15]。(2)检测手段简易，通过RT-PCR方法就能够简便地从血液中检测出lncRNAs^[16]。(3)相较于mRNAs和microRNAs，lncRNAs具有更好的肿瘤组织特异性^[17]。

在肝癌组织中，人们已经证实多个lncRNAs水平存在异常，并参与了肝癌发生发展的过程，如lncRNA HULC (highly up-regulated in liver cancer)通过下调miR-372^[18]和抑癌基因p18^[19]的表达，促进肝癌细胞的增殖。LncRNA-ATB通过上调ZEB1和ZEB2促进肝癌的侵袭和转移，并且lncRNA-ATB在肝癌组织中的高表达提示着更差的预后^[8]。在肝癌细胞株HepG2和Huh7中，靶向抑制lncRNA-HEIH(lncRNA high expression in HCC)，通过上调P21、P16和P27表达，诱导细胞周期发生阻滞^[12]。由此可见，lncRNAs在肝癌的发生发展中发挥重要作用，具有在肝癌中作为诊断标志物的巨大潜力。

HULC(Ensembl: ENSG000-00251164；Chromosome 6: 8 652 137～8 653 846)是人们发现的第1个具有肝细胞特异性lncRNA^[16]。HULC在肝癌组织中的转录水平是正常肝组织的33倍^[19]，它在其他的肿瘤组织，例如肺癌、结肠癌和前列腺癌组织中的转录水平非常低。同时，它在肝硬化组织中的转录水平没有明显变化，提示它在肝癌组织中的表达具有特异性。在HULC的核心启动子区(-67 nt至-53 nt)有cAMP 反应元件结合蛋白(cAMP responsive element-binding protein, CREB)的结合位点。 CREB通过对HULC的启动子区的结合，诱导后者的转录增加。由于HULC上具有miR-372的结合位点^[18]，当HULC的转录增加时，可通过降低miR-372对PRKACB(蛋白激酶PKA的催化亚基)的转录抑制作用，进一步增强CREB的磷酸化水平，促进了CREB对HULC的结合。最终，HULC通过正反馈调节机制,增强了其在肝癌中的转录。当HULC的转录增加时，可通过下调肿瘤抑制基因p18的转录和翻译,促进肝癌细胞的增殖^[19]。

Xie等^[20]检测了20例健康人和30例肝癌患者肝组织和血浆中HULC的表达并使用受试者特征(receiver operating characteristic，ROC)曲线评价组织中HULC表达区别肿瘤组织和正常对照组织的能力。结果显示，曲线下面积(area under the curve，AUC)为0.86，提示将组织中的HULC作为标志物分子时具有较好的敏感性和特异性。同时，在他们选择的队列中，验证了HULC在肝癌组织中的表达高于正常肝组织(P<0.01)。进一步研究发现，在肝癌患者中，Edmondson分级与血浆中HULC的表达呈正相关(P<0.01)。乙型肝炎病毒(hepatitis B virus，HBV)阳性的肝癌患者血浆中HULC的检出率高于HBV阴性的肝癌患者(90% vs 25%,P<0.01)。在63%(19/30)的肝癌患者血浆中能够检测出HULC，而正常对照组中只有10%(2/20)能检测出。以上结果提示，血浆中HULC的表达水平的升高与肿瘤的侵袭和进展相关。

Linc00152(Ensembl:ENSG00000222041；Chromosome 2: 87 455 368～87 606 805)是一个位于基因间的lncRNA,位于染色体2p11.2，转录本长度828 nt。有研究报道，血浆中的linc00152在胃癌中的水平发生上调，是潜在的胃癌血浆诊断标志物^[21]。目前已知，肝癌组织中的linc00152转录水平显著升高，并通过激活雷帕霉素机制性靶标信号通路，促进肝癌细胞增殖和肿瘤生长^[22]。

Li等^[23]发现，肝癌患者血浆中HULC(P<0.001)和linc00152(P<0.001)的表达相较于正常对照组有显著的上调。HULC的表达水平与肿瘤大小(P=0.025 3)、包膜完整性(P=0.016 9)相关。而linc00152的表达和肿瘤分化程度(P<0.000 1)、肿瘤大小(P=0.000 5)、TNM分期(P=0.006 6)、包膜完整性(P=0.002 5)的相关性高。这2个分子在血浆中的表达水平越高，肿瘤发生、恶性程度增加和发生侵袭的风险就越高。以上结论提示，HULC和linc00152有可能在肿瘤发生、发展和侵袭的过程中发挥重要作用，因而这2个lncRNAs可作为预测肝癌发病和转移的标志物分子。通过ROC曲线分析，对这2个lncRNAs的诊断价值进行评价时，HULC和linc00152的AUC分别为0.78和0.85;将这2个lncRNAs联合应用于鉴别肝癌患者和正常对照时，AUC提高到0.87;若与AFP联用，AUC达到0.89，能够在一定程度上提升诊断的特异性和敏感性^[23]。

Tang等^[24]先通过高通量lncRNAs芯片(Human LncRNA Array v3.0)选取了3例男性肝癌患者术前和术后的血浆，以及3例正常对照者的血浆作为研究对象，筛选血浆中差异表达的lncRNAs。接着，选择20例肝癌患者和20例正常对照的血浆,用qRT-PCR验证芯片结果，最终从中筛选得到3个在肝癌患者血浆中上调表达的lncRNAs：RP11-160H22.5(Ensembl: ENSG00000227373；Chromosome 1: 174 115 300~174 160 004)、XLOC_014172(LNCipedia: lnc-RGL4-4; Chromosome 22:23 834 998~23 838 909)和LOC149086(Ensembl: ENSG00000260386；Chromosome 1: 31 500 085~31 540 885)。最后将样本量扩大到147例肝癌患者和189例正常对照的血浆，验证前期结果的准确性和特异性。该项研究发现，这3个lncRNAs在肝癌患者手术前血浆中的表达高于正常对照(P<0.01)和慢性肝炎(P<0.01)，并且在手术后，血浆lncRNAs的表达有下调(P<0.01)。

研究者使用了风险评估模型对病例和对照样本的肝癌发病风险进行评分。在筛选队列中，当截断值(cut-off value)取7.449时，使用lncRNAs诊断肝癌发病风险的敏感性和特异性达到最大，分别为85%和95%。在更大样本量的验证队列中，使用相同的条件，诊断的敏感性和特异性分别为82%和73%。使用ROC曲线法评价诊断敏感性和特异性时，在筛选队列中，RP11-160H22.5、XLOC_014172和LOC149086的AUC分别为0.900、0.950和0.875。三者联合应用的AUC可以达到0.999。在验证队列中，3个lncRNAs单独使用与联合应用时的AUC分别为0.601、0.866、0.759和0.896。研究者同时使用了双盲法(double-blind test)验证lncRNAs的诊断能力。在50例肝癌患者和50例健康对照者的血浆中，按照lncRNAs的表达水平，将样本分为肝癌组和正常对照组，其诊断准确率达90.0%。

进一步研究发现，XLOC_014172和LOC149086可以作为预测肝癌发生转移的标志分子。研究者随机选择了20例发生了转移和20例未发生转移的肝癌患者作为第1个队列，将另外79例发生转移和78例未发生转移的肝癌患者作为验证队列。当截断值取3.214时，在第1个队列中，这2个分子诊断肝癌发生转移的敏感性和特异性分别为90%和90%，阳性预测值和阴性预测值分别为94%和86%。而验证队列中，敏感性和特异性分别为91%和90%。在两个队列中，XLOC_014172、LOC149086以及联合使用用于区分转移与否的AUC分别为0.875、0.625、0.900，以及0.904、0.625、0.934。

Lu等^[25]将138例正常对照、104例HBV感染者和137例肝癌患者纳入研究人群。用qRT-PCR的方法检测所研究人群血清中lncRNA-uc003wbd(UCSC： uc003wbd)和lncRNA-AF085935( UCSC：AF085935；Chromosome X：133 897 443~133 897 922)的表达。结果显示，2个lncRNAs分子在肝癌患者(P<0.001)和HBV感染者(P<0.001)血清中的表达相较于正常对照增高。以上结果提示，这2个分子能够将肝癌患者和HBV感染者与正常对照进行区分，也能够将肝癌患者与HBV感染者区分开。研究者还用ROC曲线法，通过AUC来评价2个lncRNAs的诊断效能。当用于鉴别诊断肝癌患者和HBV感染者时，lncRNA-uc003wbd的AUC为0.70(95% CI: 0.63～0.76), lncRNA-AF085935的AUC为0.86(95% CI:0.80～0.91)。当用于鉴别诊断肝癌患者与正常对照时，lncRNA-uc003wbd的AUC为0.86(95% CI:0.82～0.91), lncRNA-AF085935的AUC为0.96(95% CI:0.93～0.99)。当用于鉴别诊断HBV感染者与正常对照时，lncRNA-uc003wbd的AUC为0.76(95% CI:0.70～0.82), lncRNA-AF085935的AUC为0.77(95% CI:0.71～0.83)。

尽管血中存在大量的核糖核酸酶(ribonucleases, RNases)，然而循环血中的某些lncRNAs在一定时间内并不受其影响，仍可保持较好的稳定性和较高的表达量，能够满足检测的要求^[26]。Tang等^[24]用琼脂糖凝胶电泳能够检测出从正常人血浆中扩增出的lncRNAs。将正常人血浆在室温放置12 h、24 h或者经历3次反复冻融等处理后，发现lncRNAs的浓度几乎没有受影响。究其原因，一方面可能是冻存血液样品所处的低温环境抑制了RNases的活性；另一方面，细胞内的lncRNAs可能通过特殊的转运方式，从肿瘤组织或肿瘤细胞中分泌入血，避免直接暴露于RNases。

针对lncRNAs分泌入血的机制研究目前还较少。但同样作为非编码RNA的一员，microRNAs作为循环血中肿瘤诊断标志物已经开展了许多研究。microRNAs分泌入血的机制对lncRNAs的相关研究具有借鉴意义。microRNAs分泌入血的机制大致可分为3种：(1)以外泌体(exosomes)^[27]、微泡 (microvesicles) ^[28]的形式，从细胞主动释放出来；(2)与其他子共同分泌入血，如高密度脂蛋白^[29];(3)由于慢性感染、坏死或者损伤造成microRNAs从细胞中被动地释放出来^[30]。Li等^[21]发现，linc00152在血浆和外泌体中的表达没有显著差异(P=0.604)，即血浆中的linc00152主要存在于外泌体中，且外泌体维持其在循环血中保持稳定。其他形式的细胞外囊泡也有可能参与了lncRNAs分泌入血的过程^[31]。因此，lncRNAs可能以与microRNAs类似的方式从细胞进入血液循环。

不同于microRNAs(18～22 nt)，lncRNAs的片段长度一般≥200 nt，而在大部分外泌体中能够检测到的RNA片段长度为18～28 nt。在对血中的RNA进行抽提并检测的操作过程本身必然会造成部分lncRNAs发生降解，或发生断裂，这意味着外泌体中存在的lncRNAs可能是其全长的降解产物，并以片段化的形式被检测出来。Ren等^[32]在人血浆中发现MALAT-1来源的小片段MD-miniRNA在前列腺癌中具有诊断价值。他们的结果证实，lncRNAs并非以全长形式在循环血中存在， 而是某个表达丰度高、在血清或血浆中非常稳定的片段。

肝细胞癌在全球范围内具有发病率高、致死率高的特点，患者的5年生存率非常低，仅为6%～11%^[33]。因此若能及早进行人群筛查和诊断，就能对肝癌进行有效的治疗，并极大地改善患者的预后。循环血中肿瘤标志物的检测作为一种无创的诊断技术，具有安全、成本低、操作简便的优点。许多血清标志物，包括AFP、甲胎蛋白异质体3(AFP-L3)、磷脂酰肌醇蛋白聚糖3(GPC3)、高尔基体蛋白73(GP73)、DCP等，都在临床上广泛应用于肝癌的检测^[34]。然而，现有的肿瘤标志物在诊断的敏感性和特异性上还有待提高。

随着高通量测序技术(microarray 或 RNA-seq)的发展，揭示了lncRNAs在肿瘤的发生、侵袭、转移等多个环节发挥了重要作用^[35]。许多研究显示，肿瘤中异常表达的lncRNAs与肿瘤的进展密切相关，并且可以作为、胃癌^[36]、前列腺癌^[37]等多种肿瘤的诊断标志物分子。目前，已有许多关于lncRNAs在肝癌中具有诊断意义和预后判断价值的研究报道，如lncRNA同源盒基因转录反义RNA(HOX transcript antisense RNA,HOTAIR)^[38]与肝移植后的肿瘤复发相关，H19^[39]和HBX相关的下调表达的lncRNA(lncRNA down-regulated expression by HBx，lncRNA-Dreh)^[40]与肝癌的转移相关，肝癌微血管浸润相关的lncRNA ^[9]与肝癌的预后相关。

然而，大量研究仅关注lncRNAs在肿瘤组织中的差异和重要价值，其在循环血中作为肝癌诊断标志物的研究才刚刚起步。PCA3是目前唯一被FDA批准的可用于临床诊断的lncRNAs^[37]。相较于lncRNAs，microRNAs作为肝癌循环血诊断标志物的研究开展较早，更为成熟。一方面循环血microRNAs在肝癌诊断中的研究可以为lncRNAs的相关研究提供参考，另一方面，由于lncRNAs与microRNAs之间存在着错综复杂的相互作用调控网络^[41]，将循环血lncRNAs和microRNAs作为一个整体用于肝癌的早期诊断或许能取得更好的效果。当然，作为循环血中肝癌的诊断标志物，lncRNA还有许多问题需要解决，例如通过改进采集患者血样的方式方法和RNA抽提技术，最大程度保持lncRNAs在循环血中的稳定性。此外，通过寻找特异性更好的lncRNAs或者将联合应用多个标志物，提高lncRNAs在肝癌诊断中的特异性，排除其他疾病的干扰。毫无疑问，随着高通量测序技术的发展和研究的深入，人们将发现更多肝癌特异的lncRNAs，推动其在循环血中作为诊断标志物的临床应用，提高早期诊断率并有效改变患者的预后。