MicroRNA(miRNA)能够游离于细胞之外，稳定存在于血浆或血清中，具有疾病和组织特异性等分子生物标志物的某些优点，已在多种疾病的诊断和预后中显示了独特的价值^{[1, 2]}。但是血清miRNA是否能用于心力衰竭(心衰)的诊断尚不清楚。心肌重构和炎症反应是心衰的两个重要的病理生理过程。miR-21/155/18b/181a与炎症反应和心肌重构相关，在心血管系统组织中大量表达，且发挥着重要的功能^{[3, 4, 5, 6, 7, 8, 9]}；但是它们在心衰患者血清中的表达水平仍然未知。扩张型心肌病(扩心病)是心衰和心脏移植的最常见原因之一，约占充血性心衰的1/3，其病因不明，且在20~60岁男性中较多发。所以本研究选择扩心病患者进行特异miRNA的检测，并对其在扩心病诊断中的效价进行评价。

(1)扩心病组：40例，男26例，女14例，平均年龄(49.25±9.09)岁，均为2011年符合扩级心病诊断标准^[3]且于哈尔滨医科大学附属第一医院心内科住院的患者；扩心病组按纽约心功能分级(NYHA分级)分为NYHAⅢ级亚组21例，NYHAⅣ级亚组19例。(2)对照组：30例，男14例，女16例，平均年龄(50.03±7.22)岁。对照组既往无心脏病病史，左室射血分数(LVEF%)>50%，且无自身免疫性病等疾病，超敏C-反应蛋白(hsCRP)、肝肾功能、心肌酶、心脏彩超等各项指标均正常。两组均排除有瓣膜病、肥厚型或者酒精性心肌病、感染、恶性肿瘤、糖尿病、肺动脉高压或者肝脏纤维化等疾病者。

入院24 h内抽取空腹静脉血后送至检验科行血肝肾功能、hsCRP、N末端脑钠肽前体(NT-proBNP)等项目检测。入院3 d内由心脏彩超室专业医师行心脏超声检查，测定LVEF%及左室舒张末期内径(LVEDD)。保留8 mL静脉血于抽血后2 h内离心，提取血清RNA(Invitrogen公司TRIzol LS reagent，货号10296-010)后，应用紫外分光光度计测定总RNA的光密度D₂₆₀(核酸最大吸收波长)、D₂₈₀(蛋白、酚类物质最大吸收波长)和D₂₆₀/D₂₈₀值检测其纯度，D₂₆₀/D₂₈₀值范围在1.8~2.1可认为合格。在反转录酶的作用下将miRNA反转录成cDNA(Promega公司Reverse Transcription System，货号A3500)，以管家基因U6^[2]为内参，进行实时荧光定量PCR(Applied Biosystems公司SYBR Green PCR Master Mix，货号4309155)。

通过生物信息学方法获知miR-21/155/18b/181a的基因组序列，用Primer 5软件设计PCR引物^[2]。引物序列见表 1。

表 1 (Table 1)

表 1 PCR引物序列 引物            引物序列 (5′-3′) U6 反转录引物 CGCTTCACGAATTTGCGTGTCAT 上游引物 GCTTCGGCAGCACATATACTAAAAT 下游引物 CGCTTCACGAATTTGCGTGTCAT miR-21反转录引物 GTCGTATCCAGTGCGTGTCGTGGAGTCGGCAATTGCACTGGATACGACTCAACAT 上游引物 GGGAGCTTATCAGACTGATG 下游引物 TGCGTGTCGTGGAGTC miR-155反转录引物 GTCGTATCCAGTGCGTGTCGTGGAGTCGGCAATTGCACTGGATACGACACCCCTA 上游引物 GGTGCTAATCGTGATAGGG 下游引物 AGTGCGTGTCGTGGAGTCG miR-18b反转录引物 GTCGTATCCAGTGCGTGTCGTGGAGTCGGCAATTGCACTGGATACGACCTAACTG 上游引物 GAGGTGCATCTAGTGCAG 下游引物 AGTGCGTGTCGTGGAGTC miR-181a反转录引物 GTCGTATCCAGTGCGTGTCGTGGAGTCGGCAATTGCACTGGATACGACACTCACC 上游引物 CATTCAACGCTGTCGGTG 下游引物 AGTGCGTGTCGTGGAGTC

表 1 PCR引物序列

用SPSS 15.0统计软件进行数据处理。连续变量以x±s表示，两组之间对比用χ²检验和t检验。各样品的miR-21/155/18b/181a和U6分别进行real-time PCR反应，相对定量即采用2^-ΔΔCT法，其中ΔΔCT =ΔCT(心衰)-ΔCT(对照),而ΔCT=CT(miRNA)-CT(U6)，通过扩心病组与对照组的比值来分析miRNA表达量的变化。采用Spearman相关分析检测两组数据之间的相关性。检验水准(α)为0.05。

收集40例扩心病患者和30例健康志愿者的临床资料，抽血之前对扩心病患者进行强心、利尿、减轻心脏负荷、控制心率等相关药物治疗。两组在年龄、性别、吸烟及饮酒等方面差异均无统计学意义(P>0.05)，而临床指标hsCRP、NT-proBNP、LVEF%、LVEDD间差异有统计学意义(P<0.01，表 2)。

表 2 (Table 2)

表 2 扩心病组和对照组的一般临床资料          临床特征 对照组 N= 30 扩心病组N= 40 P 年龄 (岁)， x±s 50.03 ± 7.22 49.25± 9.09 >0.05 性别n(%) 男 14(46.7) 26(65.0) >0.05 女 16(53.3) 14(35.0) 吸烟者n(%) 7(23.3) 14(35.0) >0.05 饮酒者n(%) 4(13.3) 13(32.5) >0.05 临床相关指标 hsCRP ρB/(mg·L-1)， x±s 2.23±2.69 6.33±7.15 ＜0.05 NT-proBNP ρB/(pg·mL-1)， x±s 60.91±39.65 3 722.62±6 030.79 ＜0.01 LVEF%， x±s 64.64±5.74 31.30±8.27 ＜0.01 LVEDD d/mm, x±s 47.39±4.09 68.14±7.62 ＜0.01 药物干预n(%) β-受体阻断剂 9 (22.5) ACEI/ARBs 24(60.0) 利尿剂 33(82.5) 地高辛 25(62.5)

表 2 扩心病组和对照组的一般临床资料

扩心病组患者血清中miR-21水平(以2^-ΔΔCT表示)低于对照组(中位数：对照组为33.92,扩心病组为6.79; P<0.01)。

血清miR-21(以2^-ΔΔCT表示)与LVEF%呈正相关(r=0.471,P<0.001)，与LVEDD呈负相关(r=-0.440,P<0.001)；而miR-21和NT-proBNP、hsCRP之间无相关性(P>0.05)，NT-proBNP与LVEF%、LVEDD之间的相关性较差(r=-0.362；r=0.297)。hsCRP与 LVEF%、LVEDD之间的相关性亦较差(r=-0.352; r=0.361)。NT-proBNP 与hsCRP 之间亦没有相关性(P>0.05)，LVEF%与 LVEDD具有较好的相关性 (P<0.000 1,r=-0.811)。

结果表明，心肌重构相关的miR-18b以及炎症反应相关的miR-155/181a在血清中大量存在。在免疫细胞中大量表达的miR-155在扩心病组和对照组之间差异无统计学意义(P>0.05)。miR-18b在扩心病组和对照组之间差异无统计学意义(P>0.05)。炎症相关的miR-181a在扩心病组的总体平均值较对照组稍有下降，但是差异仍然无统计意义(P>0.05)。

本研究结果显示，与心肌重构及炎症反应相关的miRNA在血清中大量表达，但是并非所有的miRNA都异常表达(比如miR-155/181a/18b)。循环中miRNA的来源尚无定论，现在普遍认为其来源于凋亡、坏死细胞的裂解或者组织细胞的主动分泌过程等。虽然miRNA的具体作用途径尚待进一步阐明，但通过对其疾病表达谱的研究已经发现miRNA具有器官组织及细胞特异性，而这些具有特异性的miRNA既是探索疾病发病机制的基础，又是良好的临床疾病诊断标志物^{[10, 11]}。

miR-21是目前在心血管疾病领域研究比较多的miRNA之一。研究表明,在心脏成纤维细胞中miR-21促进了心肌重构^[3]。但另一些研究表明，miR-21 在心肌细胞中具有抗凋亡作用；而且过表达miR-21 可能改善心脏的射血功能，并减少心脏组织中胶原的沉积^{[11, 12]}。虽然miR-21的具体作用仍然有争议，但是以往的研究结果都表明miR-21在病变的心肌组织中大量表达，并参与心肌重构过程。本实验的结果表明，血清miR-21的表达水平在扩心病患者中下调。有两个原因可以解释这一现象：首先，以往研究表明在心脏疾病中特异升高的miR-21具有组织细胞保护作用，所以我们推断心衰时血清miR-21表达下调是因为心脏组织对血浆的摄取增多，miR-21在心脏组织(特别是心肌纤维细胞)中积聚。第二，由于血液中存在着大量的RNA 酶，裸露游离的miRNA在加入血浆或血清中以后会很快降解。血液中内源miRNA分子常与脂质或者蛋白质等外来体结合而存在，而不以裸露游离的形式存在，通过这种保护机制来抵抗RNA 酶的降解作用^{[8, 13, 14]}。所以，我们推测心衰时血清miR-21表达下调是因为脂质或者蛋白质等外来体在扩心病患者中的保护作用较正常者减弱，血清miR-21降解增多。

本实验表明，与NT-proBNP、hsCRP相比，miR-21与 LVEF%、LVEDD呈相关性，其中miR-21与LVEDD呈负相关，与LVEF%呈正相关。LVEDD和LVEF% 是心衰患者2个重要的临床预后参考指标，与疾病的急性突发事件和死亡率相关。因此我们推测miR-21与疾病的严重性相关，血清miR-21下降越明显，患者的预后越差。NT-proBNP等标记物的发现促进了心衰的诊断和治疗。但在本实验没有发现NT-proBNP、 hsCRP和miRNA-21之间的相关性。当然这不能排除可能是患者例数太少所引起，我们推测miR-21可能是一个独立的指标。

众所周知，NT-proBNP、NYHA分级、hsCRP等在心衰的临床应用仍有一定的局限性,寻找新的客观可行的心衰标记物仍然需要。而血清miRNA的检测为我们提供一个新的思路，更多种类的miRNA(不只是miR-21)的研究在未来仍需进一步明确。评价血清miRNA在心衰疾病中的诊断价值在未来实验中仍需扩大样本量，以得到更加确切的结论。