羟基磷灰石(hydroxyapatite，HA)与人骨磷灰石成分组成、结构相似，因其良好的生物相容性、生物活性已广泛应用于硬组织缺损修复、植入体表面涂层和骨缺损充填。然而其结晶度、结构稳定性比骨磷灰石高，植入后不易降解，作为残留于骨组织中的异质，容易成为植入部位感染源和种植障碍物，不利于骨缺损修复及种植体的骨性结合^[1]。HA在人自然骨中的形态是缺钙羟基磷灰石，其准确的表述式为(Ca,M)₁₀(PO₄,Y)₆(OH,X)₂，其中M为取代的阳离子，X为取代的阴离子。天然骨组织中存在的无机离子如Na⁺、Mg²⁺、K⁺、Sr²⁺、Zn²⁺、Ba²⁺、Cu²⁺等在骨生物学、机械性能等方面起着重要作用，无机离子替代能引起HA晶体大小、结晶度、溶解性和表面形貌等结构变化，并最终提高材料的生物学性能^[2]。基于仿生的理念，离子掺杂成为近年来HA改性的研究热点，而锶(strontium，Sr)因其在人体骨组织中的浓缩存在，正备受关注。

有研究发现，Sr掺杂导致HA晶格改变，改善了结晶度、溶解度和材料的生物降解性^[3]，体外细胞实验结果也显示Sr能促进成骨细胞的增殖和成骨性胶原合成、抑制破骨细胞分化^{[4, 5]}；并且Sr掺杂可以促进体内骨形成，抑制骨吸收，改善骨的微细结构^{[6, 7, 8]}，使其更好地与自然骨匹配和融合。但是，对于任何一种元素在体内都存在最佳生物学浓度范围，超过这一范围就会存在潜在的毒性风险。低含量Sr可以促进骨形成、抑制骨的吸收，而高含量Sr会造成体内骨钙代谢异常^{[9, 10]}。Braux等^[1]就不同Sr离子浓度对成骨细胞分化进行研究，发现Sr离子浓度为5×10^-5 mol/L的时候，成骨细胞标记物表达最高；当浓度上升至10^-3 mol/L时则抑制成骨细胞的增殖。本研究对不同含量Sr掺杂的HA(Sr-HA)生物相容性及生物学活性进行比较分析，探讨Sr离子掺杂HA的安全剂量及最佳生物学效应。

YJ-875超净工作台(苏州净化设备厂)；CO₂细胞培养箱(Forma Scientific，美国)；DMEM培养液(Gibco，美国)；新生牛血清(杭州四季青生物工程材料有限公司)；胰蛋白酶(Sigma，德国)；碱性磷酸酶(ALP)检测试剂盒(碧云天生物技术有限公司)；MTT、DMSO(上海化学试剂厂)； ELX800酶联免疫检测仪(Bio-TEK，美国)；X射线衍射仪(XRD-7000；岛津制作所；日本)；相差显微镜(Olympus，日本)；电感耦合等离子体发射光谱仪(Profile Spec,美国)。

不同含量Sr掺杂的HA来源于上海中国科学院硅酸盐研究所课题组。根据Sr含量不同(0%、1%、5%、10%、20%)将Sr-HA分为5组。每组均有粉体及10 mm×10 mm×1 mm片状2种。

应用X射线衍射仪分析Sr-HA试样表面晶相结构，衍射起始角、终止角分别为10°和60°，步宽为0.02°，波长为1.540 56 nm。

浸提递质为DMEM培养液(含体积分数为10％的胎牛血清)，按照Sr-HA试样粉末∶浸提递质为2 g∶10 mL的比例配制，37℃下在无菌、化学惰性的密封容器中浸提24 h。浸提液用过滤器除菌。采用电感耦合等离子体发射光谱仪测量5组Sr-HA试样浸提液中的Ca²⁺、Sr²⁺浓度。

按国家标准《医疗器械生物学评价.第4部分：与血液相互作用试验选择》^[11]规定的医疗器械及其成分的溶血性能评价方法执行。试样组预备：分别称取5组Sr-HA试样粉末各0.2 g，加入含生理盐水10 mL的离心管中；阳性对照：含10 mL蒸馏水的试管；阴性对照：含10 mL生理盐水的试管。各试管37℃保温30 min后，加入稀释为2%的兔血0.2 mL，轻摇，再次放入37℃水浴箱，保温60 min。室温下2 500 r/min离心5 min，取上清液在酶标仪上测定540 nm处的光密度(D)。按公式计算相应的溶血率：溶血率(%)=(D_试样-D_阴性对照)／(D_阳性对照-D_阴性对照)×100％。溶血评价标准：溶血率≤5％，符合医用材料溶血实验要求；溶血率>5％，提示材料具有溶血作用。

按1.4项方法制备浸提液，分别加入不同比例DMEM培养液稀释，得50％、20%、10% Sr-HA浸提液。采用MTT法检测细胞毒性。设定阴性对照为DMEM培养液，阳性对照为6.4 g/L苯酚溶液。将L929小鼠成纤维细胞(由上海中国科学院硅酸盐研究所提供)以1×10⁷/L接种于24孔板，贴壁良好，24 h后弃原液，PBS清洗2次，按实验分组分别加入浸提液或培养液。将培养2、7 d的L929细胞用MTT比色法检测。实验观察期，弃培养板内浸提液或培养液，加入5 g/L的 MTT (20 μL/孔)，继续培养6 h，弃原液加入DMSO (150 μL/孔)，振荡培养板10 min，用酶标仪在500 nm波长处测定各孔D值，计算细胞相对增殖率。细胞相对增殖率(%)=(D_试样／D_阴性对照)×100％。根据细胞相对增殖率进行细胞毒性的结果评价：≥100％，毒性0级，合格；75％~99％，毒性1级，合格；50％~74％，毒性2级，结合细胞形态综合分析；25％~49％，毒性3级，不合格；1％~24％，毒性4级，不合格；0，毒性5级，不合格。细胞形态毒性分析：通过倒置相差显微镜观察5组试样不同浸提液浓度培养下的细胞形态。

5组片状试样各6个放在24孔培养板内，将生长良好的第3代MG63成骨细胞(上海中国科学院硅酸盐研究所)以6×10⁴／孔的密度接种，加DMEM培养液1 mL，于37℃、5% CO₂、饱和湿度的条件下培养，分别于培养1、4、12 h后弃培养液，PBS漂洗2次，每孔加入5 g／L MTT 200 μL，37℃继续孵育4 h，弃上清，加入1 mL DMSO，结晶充分溶解后，取200 μL/孔移至96孔培养板，震荡10 min，用酶联免疫检测仪测定570 nm处的D值。每组重复3次实验，结果取平均值。

以2×10⁴／孔的密度将生长良好的第3代MG63成骨细胞接种于5组试样各6个的24孔培养板内，分别于1、4、7 d种植培养。培养条件和MTT检测方法同1.7项。

以2×10⁴个/cm²密度将MG63成骨细胞接种于含有5组试样的24孔培养板中，分别于1、3、5 d终止培养，弃去培养液，PBS清洗3次，加入细胞裂解液0.25% Triton X-100,12 000 r/min离心15 min，取上清液收集后置于-80℃冷藏，待所有试样收集完毕后按照ALP试剂盒说明测定405 nm处的D值，用空白管调零。

采用SPSS 16.0软件进行统计学分析，定量数据以 x±s表示，应用独立样本t检验分析组间差异。检验水准(α)为0.05。

如图 1，Sr掺杂HA X射线衍射图谱显示：r(Sr²⁺)>r(Ca²⁺)，Sr²⁺ 取代Ca²⁺，使HA的晶格发生畸变，从而引起晶面间距扩大，结晶度改变。掺Sr后，X射线衍射峰位左移，Sr²⁺含量愈多，偏移量愈大。不同Sr含量的Sr-HA浸提液中Ca²⁺、Sr²⁺浓度研究结果发现，在5组试样中，Ca²⁺浓度以Sr掺杂量为5%组最高，Sr掺杂量为1%组最低；Sr²⁺浓度随着Sr掺杂量增加而增加，Sr掺杂量为20%组最高，Sr掺杂量为0%组最低(表 1)。

图 1 不同含量Sr掺杂Sr-HA试样表面晶相结构X射线衍射图谱 Fig 1 X-ray diffraction of Sr-HA surface crystal phase structure of the five Sr-HA groups Sr-HA: Strontium doped hydroxyapatite

表 1 (Table 1)

表 1 不同含量Sr掺杂Sr-HA试样浸提液中Ca2+、Sr2+浓度 Tab 1 Concentrations of Ca2+and Sr2+ in the leaching liquor of the five Sr-HA groups ρB/(μg·mL-1) Sr-HA Ca2+ Sr2+ 0% Sr 8.24 0 1% Sr 4.10 4.02 5% Sr 26.31 11.03 10% Sr 23.20 17.69 20% Sr 21.05 23.40 Sr-HA: Strontium doped hydroxyapatite

表 1 不同含量Sr掺杂Sr-HA试样浸提液中Ca2+、Sr2+浓度 Tab 1 Concentrations of Ca2+and Sr2+ in the leaching liquor of the five Sr-HA groups ρB/(μg·mL-1)

不同Sr含量(0%、1%、5%、10%、20%)试样的溶血率分别为0.813％、0.922％、0.125％、0.147%、2.451%。试管中红细胞下沉，上层液变清无红色，吸取少量含红细胞的下层液在显微镜下观察，未发现红细胞破裂现象，表明材料在此浓度范围内符合医用材料的溶血实验要求。

由表 2可见，细胞培养2、7 d，各组细胞生长呈明显增长趋势，不同Sr含量(0%、1%、5%、10%、20%)试样总体毒性评级为0级、1级，说明不同Sr含量Sr-HA合格，体外培养对L929细胞无毒性，符合《医疗器械生物学评价》中关于实验材料细胞毒性的要求(国家标准GB／T16886.5-2003)。

表 2 (Table 2)

表 2 不同含量Sr掺杂Sr-HA试样浸提液浓度作用L929成纤维细胞2 d和7 d相对增殖率和毒性分级 Tab 2 Relative growth rate(RGT)and toxicity grade of L929 fibroblasts cultured for 2 and 7 days in the five Sr-HA groups Time Sr-HA 10% Diluted 20% Diluted 50% Diluted Undiluted RGT(%) Toxicity grade RGT(%) Toxicity grade RGT(%) Toxicity grade RGT(%) Toxicity grade Day 2 0% Sr 100.6 0 106.2 0 103.9 0 98.3 1 1% Sr 95.1 1 102.9 0 101.6 0 95.1 1 5% Sr 104.2 0 106.5 0 103.9 0 101.6 0 10% Sr 103.6 0 105.2 0 98.3 1 96.1 1 20% Sr 100.6 0 104.5 0 96.7 1 95.1 1 Day 7 0% Sr 101.3 0 103.4 0 103.2 0 100.6 0 1% Sr 98.5 1 101.1 0 100.3 0 100.0 0 5% Sr 103.6 0 106.2 0 104.9 0 101.6 0 10% Sr 102.9 0 104.2 0 102.9 0 99.1 1 20% Sr 100.1 0 100.8 0 100.0 0 97.0 1 Sr-HA: Strontium doped hydroxyapatite

表 2 不同含量Sr掺杂Sr-HA试样浸提液浓度作用L929成纤维细胞2 d和7 d相对增殖率和毒性分级 Tab 2 Relative growth rate(RGT)and toxicity grade of L929 fibroblasts cultured for 2 and 7 days in the five Sr-HA groups

通过倒置相差显微镜观察，不同Sr含量(0%、1%、5%、10%、20%)试样浸提液(未稀释)培养的L929细胞与阴性对照组比较细胞形态无明显差异，细胞均贴壁生长，形态呈梭形或多角形，细胞突充分伸展，并见圆形的分裂状态细胞，胞质内有离散颗粒，细胞无溶解(图 2)。

图 2 不同含量Sr掺杂Sr-HA试样作用L929成纤维细胞7 d细胞形态观察 Fig 2 Morphology of L929 fibroblasts on day 7 of culture in the five Sr-HA groups and control groups A： Negative control; B: 0% Sr; C: 1% Sr; D: 5% Sr; E: 10% Sr; F: 20% Sr. Sr-HA: Strontium doped hydroxyapatite. Original magnification: ×200

由图 3可见，细胞在不同Sr含量(0%、1%、5%、10%、20%)试样表面黏附量随培养时间延长而增加。培养1 h时，5组试样随着Sr含量的增加，MG63细胞黏附量增加，但差异无统计学意义(P>0.05)；4 h时，5% Sr含量、10%Sr含量、20%Sr含量3组表面细胞黏附量明显上升,与0% Sr含量、1% Sr含量2组比较差异有统计学意义(P<0.05)；12 h时，5% Sr含量、10% Sr含量、20% Sr含量3组与0% Sr含量、1% Sr含量2组表面细胞黏附量差异有统计学意义 (P<0.01)，1% Sr含量组与0% Sr含量组差异亦有统计学意义(P<0.05)。说明与纯HA相比，随着Sr掺杂量的增加，促进了MG63细胞的黏附，但高于5%的Sr掺杂量促进作用无进一步增强，5% Sr掺杂量取得了更有效的作用。

图 3 MG63成骨细胞在不同含量Sr掺杂Sr-HA试样表面培养1、4、12 h的黏附情况 Fig 3 Adhesion of MG63 osteoblasts after 1, 4, and 12 h culture on the surface of Sr-HA material in the five Sr-HA groups Sr-HA: Strontium doped hydroxyapatite.* P<0.05，** P<0.01. n=6, x±s

由图 4可见，不同Sr含量(0%、1%、5%、10%、20%)试样表面细胞增殖数量随培养时间增加而增加。第1天各组间细胞增殖数量随Sr含量呈递增趋势但差异无统计学意义(P>0.05)；第4天5% Sr含量、10% Sr含量、20% Sr含量3组与0% Sr含量、1% Sr含量2组相比细胞增殖数量明显增加且差异有统计学意义(P<0.05)；第7天5% Sr含量、10% Sr含量、20% Sr含量3组与0% Sr含量、1% Sr含量2组比较明显增加且差异有统计学意义(P<0.05)，1% Sr含量组与0% Sr含量组比较差异亦有统计学意义(P<0.05)。说明Sr的掺杂能够促进MG63细胞的增殖，但Sr含量的增加与促进细胞增殖作用非线性关系，Sr掺杂量10%以上时促增强作用不再加强，5% Sr含量、10% Sr含量2组表现出良好的促进成骨细胞增殖作用。

图 4 MG63成骨细胞在不同含量Sr掺杂Sr-HA试样表面培养1、4、7 d增殖情况 Fig 4 Proliferation of MG63 osteoblasts after 1, 4, and 7 d of culture on the surface of Sr-HA material in the five Sr-HA groups Sr-HA: Strontium doped hydroxyapatite.*P<0.05. n=6, x±s

由图 5可见，MG63成骨细胞在不同Sr含量(0%、1%、5%、10%、20%)试样表面ALP活性随培养时间的增加而增加。第1天ALP在各组试样表面表达差异无统计学意义(P>0.05)；第3天，5% Sr含量、10% Sr含量2组试样表面ALP的活性明显高于0% Sr含量、1% Sr含量2组(P<0.05)；第5天，5% Sr含量、10% Sr含量、20% Sr含量3组 ALP的表达明显高于0% Sr含量、1% Sr含量2组 (P<0.05)，1% Sr含量组明显高于0% Sr含量组(P<0.05)。说明Sr掺杂HA能够促进成骨细胞ALP的活性，但当掺杂量到一定比例后再增加Sr量不能进一步提高其促进作用。

图 5 MG63成骨细胞在不同含量Sr掺杂Sr-HA试样表面培养1、3、5 d时ALP表达 Fig 5 ALP expression in MG63 osteoblasts after 1, 3, and 5 d of culture on the surface of Sr-HA material in the five Sr-HA groups Sr-HA: Strontium doped hydroxyapatite; ALP: Alkaline phosphatase.*P<0.05. n=6, x±s

HA作为一种骨修复植入生物材料，良好的生物相容性是其得以应用的重要前提。我们采用溶血实验、体外细胞毒性实验等方法考察了不同Sr含量(0%、1%、5%、10%、20%)Sr-HA材料的生物相容性。溶血实验是常用的急性毒性实验中的初筛实验方法之一，通过检测材料对红细胞溶解的作用来评价材料的毒性^[12]。本研究结果显示，各组Sr-HA的溶血率均小于5%，同时显微镜观察血细胞未见细胞破裂。提示制备的不同Sr含量的Sr-HA不引起溶血反应，符合相关溶血实验要求。体外细胞培养法具有简便、快速、灵敏、重复性好的优点，MTT法是常用的检测材料体外细胞毒性的方法^[13]。我们选用L-929小鼠成纤维细胞对试样材料进行细胞毒性分析，结果发现制备的不同Sr含量的5组Sr-HA试样材料细胞毒性评级均为0或1级，各组材料表面细胞形态良好，未见明显毒性反应。实验结果与陈德敏等^[14]关于Sr掺杂HA的细胞毒性研究结论相似，说明Sr掺杂HA材料具有较好的生物安全性。

成骨细胞属于锚合依赖性细胞，其在材料表面的黏附是材料骨界面锚合的第一步，是由一系列动态的蛋白质、生长因子介导的细胞活动^[15]。当细胞黏附、铺展后，经过滞留期，开始增殖。既往实验结果表明，掺入Sr的Sr-HA能有效地促进成骨细胞的增殖^{[16, 17]}。我们通过MTT法研究了不同Sr含量掺杂的HA对MG63细胞黏附、增殖的影响，结果发现，各组材料表面细胞黏附、增殖数量随培养时间增加而增加，Sr掺杂量为5%时促进细胞黏附作用最为显著。在细胞增殖实验中，培养第1天，各组材料表面细胞增殖数量并无明显差异，这可能与作用时间短有关，研究认为Sr²⁺促进成骨细胞显著增殖的作用时间始于48 h^{[18, 19]}；培养4、7 d时，Sr掺杂量为5%和10% 2组表现出良好的促进成骨细胞增殖的作用。Sr²⁺通过钙离子感受器作用，启动相关联的信号受体，促进生长因子的释放、细胞的黏附及增殖^{[20, 21]}。Sr掺杂量较高(20%)时对促进细胞黏附、增殖作用并无明显优势，表明Sr的掺入量与材料的离解度并非成简单的正比关系，不是随Sr²⁺代替Ca²⁺比例增加Sr-HA的生物降解度也直线增加^[22]，当Sr掺杂量在10％以上时，虽然Sr²⁺浓度较高，但其对成骨细胞的黏附、增殖作用不会显著增强。Choudhary等^[23]研究动物体内骨种植的实验结果也证实了这一现象。

ALP是成骨细胞分化、矿化过程中必需的酶之一，分析检测ALP活性是评价成骨细胞分化的重要指标。有研究证实Sr²⁺具有促进成骨细胞分化作用^{[24, 25]}，能增加ALP的表达。本研究结果发现，Sr掺杂量的增加可以促进ALP的表达，但Sr掺杂量在5%、10%和20%时，3组间差异无统计学意义。同时Sr²⁺促进ALP的表达具有一定的延迟性，在培养第3天后出现了明显促进作用。Chung等^[18]研究认为，Sr²⁺、Ca²⁺都是Ca受体激活剂，但亲和力有一定差异，Ca²⁺强而Sr²⁺弱，它们在介导的钙敏受体传导通道中的活性作用存在差异。我们认为，Sr-HA作用早期，降解的Ca²⁺浓度明显高于Sr²⁺，在高Ca／Sr摩尔比下，Sr²⁺并不能竞争Ca²⁺，Sr²⁺生物活性较Ca²⁺弱^[26]。此时，Ca²⁺因高浓度、高活性成为促进ALP表达的主要因素。随着作用时间延长，Sr²⁺浓度进一步增加，其对ALP表达的作用逐渐增强，在Sr²⁺及Ca²⁺双重作用下共同促进了ALP的表达。因此，Sr²⁺促进ALP显著增强表达具有延迟性，始于48 h后^[19]。我们推测，Sr²⁺作用于成骨细胞分化存在可能的负反馈调节，即Sr²⁺存在最佳体液-细胞平衡浓度范围，此时，细胞膜表面与Sr²⁺相关作用受体饱和，当高于这一浓度范围时，Sr²⁺促进成骨细胞分化作用无进一步增强或可能减弱，但还需要进一步在细胞水平和分子水平上阐明其促进成骨细胞ALP表达的作用机制。

综上，本研究发现，不同Sr掺杂量的Sr-HA具有良好的生物相容性，Sr掺杂能够促进成骨细胞的黏附、增殖和分化。在提高HA生物学活性方面，Sr掺杂量存在一个适合范围，掺杂量为5%和10%时Sr-HA具有良好的生物学性能。