第二军医大学学报  2016, Vol. 37 Issue (2): 247-250   PDF    
引用本文
罗见春, 何丹, 杨梅, 吴建勇, 张景勍. 去甲氧基姜黄素羟丙基-β-环糊精在体肠吸收特征[J]. 第二军医大学学报, 2016, 37(2): 247-250  
LUO Jian-chun, HE Dan, YANG Mei, WU Jian-yong, ZHANG Jing-qing. Intestinal absorption characteristics of demethoxycurcumin hydroxypropyl-β-cyclodextrin in rats[J]. Academic Journal of Second Military Medical University, 2016, 37(2): 247-250 (in Chinese with English abstract)  
去甲氧基姜黄素羟丙基-β-环糊精在体肠吸收特征
罗见春, 何丹, 杨梅, 吴建勇, 张景勍    
重庆医科大学重庆高校药物工程研究中心, 重庆 400016
收稿日期: 2015-04-21     接受日期: 2015-07-12.
作者简介: 罗见春, 硕士生. E-mail: luojianchuner@163.com
通信作者(Corresponding author): 张景勍, Tel: 023-68485161, E-mail: zjqrae01@163.com
摘要: 目的 研究去甲氧基姜黄素羟丙基-β-环糊精(DECD)及去甲氧基姜黄素(DE)的在体肠吸收情况。方法 使用DE以环糊精包合技术制备DECD,光谱法测定其理化性质,显微照相观察其形态,马尔文粒径测定仪测定DECD的zeta电位。采用大鼠在体肠段单向灌流模型,并建立紫外分光光度法测定DECD及DE在大鼠体内各肠段的吸收速率常数(Ka)、表观渗透系数(Papp)和吸收百分率。结果 成功制得DECD,其溶解度为2.30 g/L,是DE的38.33倍;zeta电位为-32.2 mV。在体肠吸收实验显示DECD的Ka及Papp皆为回肠> 十二指肠> 空肠> 结肠,且其Ka、Papp与吸收百分率较DE均有所提高。结论 DECD能够明显改善DE在大鼠小肠内的吸收情况。
关键词: 去甲氧基姜黄素     去甲氧基姜黄素羟丙基-β-环糊精     肠吸收     紫外分光光度法    
Intestinal absorption characteristics of demethoxycurcumin hydroxypropyl-β-cyclodextrin in rats
LUO Jian-chun, HE Dan, YANG Mei, WU Jian-yong, ZHANG Jing-qing    
Chongqing Research Center for Pharmaceutical Engineering, Chongqing Medical University, Chongqing 400016, China
Abstract: Objective To study the intestinal absorption characteristics of demethoxycurcumin hydroxypropyl-β-cyclodextrin (DECD) and demethoxycurcumin (DE) in rats. Methods DECD was prepared by cyclodextrin inclusion technique and characterized by spectroscopic method. The morphology of DECD was observed by microphotograph and zeta potential was examined by Malvern laser particle sizer. In vivo single-pass intestinal perfusion rat model was adopted; the absorption rate constant (Ka), effective permeability (Papp) and percent absorption of DECD and DE were determined using the ultraviolet spectrophotometry. Results DECD was successfully prepared, with a solubility of 2.30 g/L, which was 38.33 times that of DE. Zeta potential of DECD was -32.2 mV. The results of intestinal absorption experiment showed that the Ka and Papp values of DECD decreased in order in the ileum, duodenum, jejunum, and colon. In addition, the Ka, Papp values and percent absorption of DECD were higher than that of DE. Conclusion DECD can markedly improve the intestinal absorption of DE in rats.
Key words: demethoxycurcumin     demethoxycurcumin hydroxypropyl-β-cyclodextrin inclusion     intestinal absorption     ultraviolet spectrophotometry    

总姜黄素主要来源于天然中药姜黄，为黄色酚类物质，具有广泛的药理作用，如抑菌、抗病毒、抗氧化、抗癌、抗艾滋病毒等[1, 2]。传统中药及印度还有将总姜黄素用于治疗糖尿病的记载[3]。总姜黄素能抑制肺癌、胆囊乳头状腺癌、直肠癌等肿瘤细胞的增殖并促进肿瘤细胞的凋亡[4]。但是由于总姜黄素具有的酚类结构使其在碱性条件下易降解，对光、热、强酸及强碱均呈现不稳定性[5]，并且总姜黄素水溶性极低，导致其药理活性受到限制[6]。

总姜黄素主要包括姜黄素、去甲氧基姜黄素(demethoxycurcumin,DE)、二去甲氧基姜黄素，结构式如图 1所示。虽然姜黄素是总姜黄素的主要成分[2, 7]，但研究表明DE也有广泛的药理作用，甚至某些活性明显高于姜黄素，显示了广泛的药用前景[8]。本课题将以总姜黄素中分离出的DE单体作为考察对象，通过与羟丙基-β-环糊精(hydroxypropyl-β-cyclodextrin,HPCD)络合，制备成去甲氧基姜黄素羟丙基-β-环糊精包合物(demethoxycurcumin hydroxypropyl-β-cyclodextrin,DECD)，采用紫外分光光度法测定了以DECD为模型药物在大鼠在体肠单向灌流实验中各肠段的吸收情况，为其临床研究提供理论基础和方法。

图 1 总姜黄素中3种化合物的结构式 R1=R2=OCH3，姜黄素；R1=OCH3，R2=H，去甲氧基姜黄素；R1=R2=H，二去甲氧基姜黄素
1 材料和方法 1.1 仪器与试剂

FA1004A电子天平(上海精天电子仪器有限公司)；DZF-6020真空干燥箱(上海博迅实业有限公司医疗设备厂)；KQ-2200B超声波清洗器(民山市超声仪器有限公司)；BCD-649WE冰箱(青岛海尔股份有限公司)；DF-101S集热式恒温加热磁力搅拌器(巩义市予华仪器有限责任公司)；HHS-4S电子不锈钢恒温水浴锅(上海康路仪器有限公司)；UV-7504型紫外可见分光光度仪(上海精密科学仪器有限公司)；HL-1恒流泵(上海青浦沪西仪器厂)；白金硫化硅胶管(兰格恒流泵有限公司)；Zetasizer Nano激光粒度仪(英国Malvern公司)。

DE(>99%，自制)；Lipoid S 75(PC，德国Lipoid公司)；羧甲基纤维素钠(CMC-Na,上海时代生物科技有限公司)；超纯水；Krebs-Ringer缓冲液[9](自配，1 000 mL内含氯化钠7.80 g，氯化钾0.35 g，氯化钙0.37 g，碳酸氢钠 1.37 g，磷酸二氢钠0.32 g，氯化镁20 mg，葡萄糖1.40 g，HCl和NaOH调节pH为6.5)；其余试剂为分析纯。

1.2 DE检测波长及含量测定

取DE乙醇溶液、HPCD乙醇溶液，以无水乙醇为空白，在200~800 nm范围内全波段扫描，确定DE的检测波长。精密称取DE适量，无水乙醇溶解后定容，摇匀，作为贮备液。精密吸取上述贮备液用Krebs-Ringer液稀释得DE质量浓度分别为1.03、2.06、3.09、4.12、5.15、6.18 μg/mL的标准品溶液。以Krebs-Ringer液为空白，在420 nm下测定其光密度(D)值，以D值对浓度进行线性回归。

1.3 DECD的制备

称取适量的HPCD后加入少量超纯水，研磨均匀，再缓慢加入一定量的DE(DE与HPCD的物质的量比为1∶1)，边加边研磨1 h，真空干燥2 h，研细即得DECD[8, 10]，备用。

1.4 DECD的理化性质测定

取适量DE、HPCD、DECD和DE+HPCD物理混合物，分别进行红外光谱(IR)分析和差示扫描量热法(DSC)分析。IR采集条件为室温(25±2)℃，扫描范围4 000～400 cm-1。DSC以Al2O3实验条件为参比，温度为-20～350℃，升温速率为10 K/min，量程为-25～25 V，气体为氮气，流速为20 mL/min，取样量为3～5 mg。另称取过量DECD和DE，分别加入超纯水形成过饱和水溶液，(25±2)℃搅拌24 h后取1 mL样品，6 375×g离心10 min，取适量上清液，无水乙醇稀释，于420 nm处测定D值，计算DECD和DE的溶解度。

1.5 DECD的形态及zeta电位测定

取适量DE、HPCD、DECD和DE+HPCD物理混合物，显微照相观察形态。另取6 mg DECD，加入无水乙醇少许，后再加入10 mL 0.5%的CMC-Na溶液，超声使DECD分散混匀，配制成DECD质量浓度为0.6 mg/mL的混悬液。混悬液用蒸馏水稀释10倍后，采用马尔文粒径测定仪测定DECD的zeta电位。同法测定DE的zeta电位。

1.6 大鼠在体肠吸收评价[9]

清洁级健康雄性SD大鼠12只，体质量(250±20)g，由重庆医科大学实验动物中心提供，许可证号：CQLA-2012-100。将12只SD大鼠随机分为DECD组和DE组(n=6)。大鼠使用前未用过其他药物，禁食不禁水12 h，3.5%水合氯醛10 mL/kg腹腔注射麻醉并固定于实验台。沿腹中线打开腹腔，在需要测定的肠段上端和下端分别剪开一个小口，然后插管结扎稳固，先用37℃保温的生理盐水将肠内容物冲洗干净，排出生理盐水，用空白Krebs-Ringer循环液循环15 min，流速0.2 mL/min，然后更换含药循环液(DECD溶液或DE混悬液，相当于含DE 60 μg/mL)，以流速为0.2 mL/min进行灌流，计时1 h。四段出口处分别用25 mL容量瓶接流出液体。实验后取下容量瓶用Krebs-Ringer循环液稀释至刻度。剪下肠段，测量其长度(l)和内径(r)。根据下列公式计算其结果：

Ka=(X0-Xt)/C0t

Papp=Q×ln(Xin/Xout)/2πrl

P(%)=(X0-Xt)/X0

式中：Ka为吸收速率常数，Papp为表观渗透系数，P为吸收百分率，X0为药物的初始质量，Xt为时间t时药物灌流液中剩余的药物质量，C0表示药物初始浓度，t为灌流时间，Q为流速，Xin和Xout分别表示流入和流出的药物量，l和r分别为被灌流肠段的长度和横截面半径。

1.7 统计学处理

采用SPSS 17.0软件进行统计学分析，组间比较采用t检验，检验水准(α)为0.05。

2 结 果 2.1 DE检测波长及含量测定结果

DE的最大吸收波长为420 nm，且在420 nm波长处HPCD没有吸收，故以420 nm为DE的检测波长。检测结果表明，DE在1.03~6.18 μg/mL浓度范围内与D值呈良好的线性关系。以紫外分光光度法测定DE的含量，日内精密度及日间精密度良好，稳定性实验能满足测定需要，平均加样回收率为99.95%，RSD 为0.18%(n=3)，符合分析要求。

2.2 DECD的理化表征 2.2.1 IR分析

DE的特征吸收峰：1 624.52 cm-1代表C=O的吸收峰，1 574.93 cm-1和1 509.19 cm-1、1 137.30 cm-1及1 167.86 cm-1代表-OH的吸收峰，1 281.60 cm-1、1 235.23 cm-1代表双键上氢的吸收峰。DECD在IR图谱中药物特征吸收峰1 261.70 cm-1峰(代表双键上的氢)消失，而1 574.93 cm-1和1 509.19 cm-1吸收峰强度明显减弱，1 281.60、1 235.23 cm-1、1 137.30 cm-1及1 167.86 cm-1吸收峰消失。DE的特征吸收峰1 624.52 cm-1吸收强度明显减弱，表明DE被部分或全部包合进了HPCD的空穴中。而HPCD的特征吸收峰是1 653 cm-1，DECD在1 653 cm-1处有吸收峰。DE+HPCD物理混合物图谱中药物特征吸收峰1 574.93 cm-1峰消失，1 509.19 cm-1吸收峰减弱，但是DECD减弱程度明显强于物理混合物，表明DECD已形成(图 2)。

图 2 DECD系列红外(IR)扫描结果图 a: DE; b: HPCD; c: DE+HPCD物理混合物; d: DECD. DE: 去甲氧基姜黄素; HPCD: 羟丙基-β-环糊精; DECD: 去甲氧基姜黄素羟丙基-β-环糊精
2.2.2 DSC分析

DE在30.3℃和174.8℃分别有一个吸热峰，为DE的熔融峰。HPCD在29.1℃有一个吸热峰。DE+HPCD物理混合物在30.4℃及172.9℃分别有一个吸热峰；而DECD在33.2℃有吸收峰，其在174.8℃没有吸收峰出现，表明成功制备了DECD(图 3)。

图 3 DECD系列差示扫描量热法分析结果图 a: DECD; b: DE; c: HPCD; d: DE+HPCD物理混合物. DE: 去甲氧基姜黄素;
DECD: 去甲氧基姜黄素羟丙基-β-环糊精； HPCD: 羟丙基-β-环糊精
2.2.3 溶解度

DECD的平均溶解度为2.30 g/L，是游离药物DE的38.33倍，结果表明将DE制备成DECD后，溶解度得到了很大的改善。

2.3 DECD的形态及zeta电位

DE在显微镜下为红棕色的块状物质，HPCD呈现为均匀的灰色球状固体，DE+HPCD物理混合物为红棕色的块状物质和灰色球状固体的物理混合状态，而DECD呈现为深棕色的不规则状态，和DE、HPCD及DE+HPCD物理混合物的显微形态有明显区别，辅助说明DECD初步包合成功(图 4)。采用马尔文粒径测定仪测得DECD的zeta电位为-32.2 mV，而DE的Zeta电位为-59.1 mV。

图 4 DECD系列的显微形态 A: DE; B: HPCD; C: DE+HPCD物理混合物; D: DECD. DE: 去甲氧基姜黄素;
HPCD: 羟丙基-β-环糊精； DECD: 去甲氧基姜黄素羟丙基-β-环糊精. Original
magnification: ×200
2.4 DECD的大鼠在体肠吸收评价

各个肠段吸收情况如图 5所示。DECD在各肠段的平均Ka为(176.76±72.20)×10-5 s-1，是DE的180.88%；平均Papp为(19.28±7.46)×10-5 cm/s，较DE提高了171.97%；平均P为(46.49±5.29)%，是DE的158.96%，表明DECD能明显增加DE在大鼠各肠段的吸收，改善其在大鼠各肠段内的吸收动力学特征。

图 5 DECD和DE在不同胃肠段的吸收情况 A: 吸收速率常数(Ka); B: 表观渗透系数(Papp); C: 吸收百分率(P). DE: 去甲氧基
姜黄素; DECD: 去甲氧基姜黄素羟丙基-β-环糊精. *P＜0.05与DE比较. n=6, x ± s
3 讨 论

环糊精是由淀粉经酶解环合得到的6～8个葡萄糖分子以α-1,4苷键连接的环状低聚物，可在分子水平上包合各种活性成分并赋予新的理化特性，是目前最简单的包合材料[10, 11]。HPCD是β-环糊精类包合材料中应用最广泛的药用辅料[10]，相对β-环糊精和其他环糊精而言具有更好的生物相容性和水溶性，是被美国食品药物管理局(FDA)批准的可用于注射的药用辅料。有研究表明无论是难溶性的抗癌药还是非抗癌药，与HPCD络合形成包合物后，其水溶性、物理化学性质以及药代动力学/药效学性质都有明显改善[10]。本研究通过环糊精包合技术将DE制备成DECD包合物，明显改善了DE的溶解度。DE在碱性环境不稳定易变质，故本研究在进行在体肠吸收实验过程中，选择pH 6.5的Krebs-Ringer液作为循环液，并且在前期实验中考察了DE和DECD在肠道灌流液中的稳定性，发现DE和DECD在37℃的肠道灌流液中能稳定放置180 min。

本研究将单体DE作为考察对象，成功制备得DECD，通过单向灌流法考察了DECD和DE在大鼠小肠内的吸收情况，结果表明DECD比DE具有更好的P值，并且Ka和Papp都有一定程度的改善，其中在回肠有显著性改善。根据Papp可将吸收性能分为3类：Papp＜0.03×10-4 cm/s，吸收差；Papp＞0.2×10－4 cm/s，吸收完全，介于两者之间的为中等吸收[9]，本实验结果表明DECD在大鼠肠段的吸收完全。

本研究通过紫外分光光度法测定DE含量及DECD在大鼠肠段的吸收情况，灵敏度高，操作简单，而制备的DECD在大鼠肠段的吸收良好，有望为DE新的制剂设计和临床合理用药提供参考。

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