2016, Vol. 37
海战及海上作业发生意外时可能会导致开放性颅脑外伤伤员落水，使海水浸入伤口而加重原有的颅脑外伤[1]。临床经验表明目前此类伤员的临床症状比陆地伤员更为严重，病理变化更为突出，救治难度更大，治疗效果亦更差[2~3]。为此，我们建立了模拟遭海水浸泡的开放性颅脑外伤大鼠模型，初步研究遭海水浸泡的开放性颅脑外伤伤情特点，现报告如下。
1 材料和方法 1.1 人工海水的配制人工海水的配制参照文献[4~5]报告的配方：氯化钠26.518 g/L，硫酸镁3.305 g/L，氯化镁2.447 g/L，氯化钙 1.141 g/L，氯化钾0.725 g/L。取浙江大麦屿离海岸 5 km 处的海水作为对照，同时检测配制的人工海水和天然海水的渗透压和电解质情况，结果证明人工海水与天然海水的渗透压和主要电解质含量极为接近。
1.2 动物及分组健康雄性SPF级SD大鼠100只[动物许可证号：SCXK(沪) 2013-0006]，体质量(300±20) g，采用随机数字表法结合随机数余数调整法将大鼠平均分为5组，分别为对照组、轻型颅脑外伤海水浸泡组、中型颅脑外伤海水浸泡组、重型颅脑外伤海水浸泡组和重型颅脑外伤生理盐水浸泡组。因海水浸泡过程中重型颅脑外伤组大鼠死亡1只，后该组再补充1只300 g雄性SPF级SD大鼠。死亡大鼠的各项数据均未列入后续统计结果。
1.3 开放性颅脑外伤海水浸泡动物模型的制备使用戊巴比妥按35 mg/kg剂量腹腔注射麻醉大鼠，麻醉成功后将大鼠以俯卧位固定。以牙科钻磨开颅孔直径约6 mm，内侧距矢状缝3 mm，后端距人字缝3 mm。采用精密颅脑撞击器(PinPointTM PCI3000 Precision Cortical Impactor，美国Hatteras Instruments Inc.)建立开放性颅脑外伤动物模型；撞击头直径5 mm，撞击速度2 m/s，接触时间为500 ms。其中轻型颅脑外伤组撞击深度为1 mm，中型颅脑外伤组撞击深度为2 mm，重型颅脑外伤组撞击深度为3 mm。动物致伤后用细针头小心将硬膜十字型挑破至骨孔边缘。对照组钻孔并挑开硬膜但不致伤。暴露的脑组织表面覆盖脑棉片，输液器导管末端部分剪2个侧孔，侧孔面向脑棉片。缝合头皮切口中间部分，在脑表面形成两端开放的皮下隧道。将海水持续从输液器中滴入，使包含挫伤部位在内的大脑皮质模拟持续浸泡于海水环境。对照组和生理盐水浸泡组均采用生理盐水代替海水浸泡。所有动物浸泡时间均为60 min。
1.4 检测指标 1.4.1 大鼠的生命体征、昏迷时间和神经功能评分动物模型制作完成后记录大鼠的昏迷时间，并于模型制作完成后1、8、24 h观察大鼠的呼吸、心率及神经功能评分。大鼠意识状态分为6级：1级，在笼内活动如常；2级，在笼内活动减少；3级，在笼内活动减少并运动失调；4级，翻正反射存在但不能站立；5级，翻正反射消失但痛刺激有肢体回缩反应；6级，对任何刺激无反应。其中5、6级被认为是昏迷状态。记录大鼠麻醉后翻正反射消失至评分达到4级时的时间，即为昏迷时间。大鼠神经功能评分采用Longa评分法，分5个等级：0分，正常、无神经功能缺损；1分，左侧前爪不能完全伸展、轻度神经功能缺损；2分，行走时大鼠向左侧(瘫痪侧)转圈、中度神经功能缺损，3分，行走时大鼠身体向左侧(瘫痪侧)倾倒、重度神经功能缺损；4分，不能自发行走、意识丧失。
1.4.2 影像学检查造模后24 h采用西门子Magnetom Trio 3T磁共振仪行大鼠头颅磁共振检查。采用T2W1序列对大鼠头颅行冠状位扫描。
1.4.3 病理学检查每组取2只大鼠用于病理学检查。采用H-E染色观察各组大鼠的病理结果，采用伊文思蓝染色显示血脑屏障破坏范围。
1.4.4 脑含水量检测每组取2只大鼠用于脑含水量检测，于模型制备完成后24 h断头取脑。将鼠脑沿矢状缝切开，区分两侧大脑半球，用精密电子天平称湿质量。置80℃烤箱中，连续烘烤48 h至恒质量后称干质量。按Elliott公式计算脑组织含水量：脑组织含水量(%)=(湿质量－干质量)/湿质量×100%。
1.4.5 血脑屏障通透性检测每组取10只大鼠用于血脑屏障通透性检测。于处死前2 h股静脉注射20 g/L伊文思蓝，剂量为2 mL/kg。断头取脑后，按横断面切取损伤平面厚约5 mm的脑组织，将其分为致伤侧与对侧两部分。分析天平上称量湿质量后将其匀浆，匀浆液为2 mL的50%三氯乙酸。充分匀浆后，将组织匀浆液22 866×g离心20 min，取1 mL 上清与3 mL无水乙醇混合，应用荧光分光光度计在激发波长620 nm、发射波长680 nm的条件下比色，依据光密度(D)值计算伊文思蓝的质量分数。
1.5 统计学处理采用SPSS 19.0软件进行数据处理，组间比较采用方差分析。检验水准(α)为 0.05。
2 结 果 2.1 大鼠一般情况撞击后部分重型颅脑外伤组大鼠出现短暂的呼吸暂停和轻度全身抽搐，1 min后均自行缓解。海水浸泡过程中重型颅脑外伤海水浸泡组大鼠死亡1只，其余各组均未发生大鼠死亡。致伤后1 h时大鼠的心率、呼吸均有不同程度的加快，重型颅脑外伤海水浸泡组大鼠尤为明显，其心率为(309.8±4.2) 次/min，呼吸为(98.7±4.6) 次/min。对照组、轻型颅脑外伤海水浸泡组、中型颅脑外伤海水浸泡组、重型颅脑外伤海水浸泡组和重型颅脑外伤生理盐水浸泡组大鼠昏迷时间分别为(0.21±0.06)、(0.48±0.28)、(2.15±0.17)、(3.30±0.24)、(2.45±0.19) h，中型颅脑外伤海水浸泡组、重型颅脑外伤海水浸泡组和重型颅脑外伤生理盐水浸泡组大鼠的昏迷时间均长于对照组和轻型颅脑外伤海水浸泡组(P<0.05)，重型颅脑外伤海水浸泡组大鼠的昏迷时间长于重型颅脑外伤生理盐水浸泡组(P<0.05)。
2.2 大鼠神经功能评分各实验组大鼠神经功能评分变化见图 1。造模后1 h重型颅脑外伤海水浸泡组、中型颅脑外伤海水浸泡组和重型颅脑外伤生理盐水浸泡组大鼠的Longa评分均高于对照组(P<0.05)；造模后8、24 h重型颅脑外伤海水浸泡组与重型颅脑外伤生理盐水浸泡组之间、轻型颅脑外伤海水浸泡组与对照组之间的Longa评分差异均无统计学意义，其他各组之间两两比较差异均有统计学意义(P<0.05)。
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图 1 各组大鼠Longa评分变化 *P<0.05与对照组比较; △P<0.05与轻型颅脑外伤海水浸泡组比较; ▲P<0.05与中型颅脑外伤海水浸泡组比较. n=20,x±s |
2.3 头颅磁共振检查
造模后24 h行大鼠头颅磁共振检查，结果如图 2所示。可见轻型颅脑外伤海水浸泡组大鼠头颅损伤主要累及皮质浅表，重型颅脑外伤海水浸泡组大鼠头颅创伤直达深部核团、水肿波及对侧脑，中型颅脑外海水浸泡伤组介于以上两者之间；海水浸泡组大鼠头颅的出血和水肿较同等致伤条件下生理盐水浸泡组更为明显。
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图 2 造模后24 h各组大鼠头颅磁共振图像 A: 重型颅脑外伤海水浸泡组; B: 中型颅脑外伤海水浸泡组; C: 轻型颅脑外伤海水浸泡组; D: 重型颅脑外伤生理盐水浸泡组; E: 对照组 |
2.4 病理学检查 2.4.1 大体标本
大鼠左侧半球损伤部位可见直径约5 mm的圆形致伤灶，致伤灶底部可见轻重不一的挫伤脑组织，周围脑组织水肿。伤情越重，脑组织挫伤和坏死范围越大(图 3)。横断面显示重型颅脑外伤组损伤深度直达丘脑，周围可见大片脑组织因血脑屏障破坏而被伊文思蓝染色，损伤灶周边有大片的出血；海水浸泡组与生理盐水浸泡组相比血脑屏障破坏范围明显增大。中型颅脑外伤海水浸泡组损伤深度直达海马，周围亦可见出血和蓝染区域。轻型颅脑外伤海水浸泡组损伤范围局限于皮质，血脑屏障破坏范围、程度较重度和中等颅脑外伤组亦明显减少。对照组脑组织表面仅轻度水肿，剖面可见皮质及以下各层脑组织完好。
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图 3 造模后24 h各组大鼠脑大体标本 |
2.4.2 H-E染色结果
光镜下可见各致伤组损伤中心区域脑组织缺损，蛛网膜和皮质连续性被破坏；周围脑组织内有散在的出血灶，血管周间隙扩大；部分神经胞核呈三角形深染，核染色重，胞周出现空泡；更远的部位白质出现疏松改变，胞周出现空泡，整个脑组织呈海绵样改变表现。重型颅脑外伤海水浸泡组和重型颅脑外伤生理盐水浸泡组相比，出血、胞周空泡样改变和血管周间隙扩大更为明显(图 4)。
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图 4 各组大鼠的H-E染色表现 A1,A2: 轻型颅脑外伤海水浸泡组; B1,B2: 中型颅脑外伤海水浸泡组; C1,C2: 重型颅脑外伤海水浸泡组; D1,D2: 重型颅脑外伤生理盐水浸泡组; E1,E2: 对照组. A2~E2分别为A1~E1的放大图，黑框提示放大部位. Original magnification: ×2 (A1~E1)，×200 (A2~E2) |
2.5 脑组织含水量
重型颅脑外伤海水浸泡组、中型颅脑外伤海水浸泡组、轻型颅脑外伤海水浸泡组、重型颅脑外伤生理盐水浸泡组和对照组大鼠脑组织含水量分别为(80.18±0.07)%、(79.56±0.05)%、(79.25±0.07)%、(79.65±0.07)%和(77.72±0.06)%，除中型颅脑外伤海水浸泡组与重型颅脑外伤生理盐水浸泡组之间差异无统计学意义外，其余各组两两比较差异均有统计学意义(P<0.05)。
2.6 血脑屏障通透性采用脑组织伊文思蓝含量评价血脑屏障的通透性，结果见表 1。伤侧脑组织除中型颅脑外伤海水浸泡组与重型颅脑外伤生理盐水浸泡组差异无统计学意义外，其余各组两两比较差异均有统计学意义(P<0.05)；健侧脑组织除中型颅脑外伤海水浸泡组与重型颅脑外伤生理盐水浸泡组、轻型颅脑外伤海水浸泡组与对照组差异无统计学意义外，其余各组两两比较差异均有统计学意义(P<0.05)。
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表 1 各组大鼠脑组织伊文思蓝含量 |
3 讨 论
开放性颅脑外伤合并海水浸泡是一类特殊创伤，建立合适的动物模型有利于研究其损伤机制和救治方法。我们采用控制性皮质撞击法造成大鼠脑外伤，致伤后将局部损伤的脑组织浸泡在人工海水中，成功构建了大鼠开放性颅脑外伤海水浸泡模型。SD大鼠作为标准化实验动物，遗传背景明确，动物个体差异小，廉价，利于大批量重复实验。控制型皮质撞击法是利用气动或电磁冲击装置驱动刚性撞击头，冲击暴露的脑皮质造成损伤。在该模型中，可通过改变活塞的速率、打击深度、停留时间来调节脑损伤的严重程度，这种方法具有重复性高、受个体差异因素影响较小等优点，避免了重物落体造成的反弹伤害风险[6~7]。模型建立后通过磁共振检查和大体标本研究发现，重型颅脑外伤组损伤深度直达丘脑，中型颅脑外伤组损伤深度可达海马，轻型颅脑外伤组损伤范围局限于皮质。由于致伤程度可精确调节，采用该方法制备动物模型具有安全性高、死亡率低的优势。本次实验共有81只大鼠进行致伤(对照组20只仅开颅未致伤)，仅有1只实验大鼠死亡。我们认为采用直径5 mm的撞击头，撞击速度2 m/s，接触时间为500 ms，轻型、中型、重型颅脑外伤的撞击深度分别为1、2和3 mm，可以安全、有效地精确重复制作不同严重程度的开放性颅脑外伤海水浸泡动物模型。
伤后24 h是颅脑外伤临床治疗的重要时间点，一般而言外伤后24 h活动性出血明显减少而脑水肿逐渐加重，是影响治疗成败的关键因素[8~10]。因此本实验选择了造模后24 h作为观测点，以了解海水对脑组织的破坏程度和作用机制。根据实验结果，我们发现同等致伤条件下，海水浸泡组较生理盐水浸泡组在大鼠脑组织含水量、血脑屏障破坏程度等方面均有显著加重。两组H-E染色病理切片对比研究亦发现，海水浸泡组标本呈现出血管周间隙扩大、白质出现疏松改变、胞周出现空泡、整个脑组织呈海绵样改变等特点。虽然颅脑外伤后早期海水浸泡降低了血管的通透性，抑制了水分向组织间隙和细胞内的转移，从而导致脑水肿的高峰期被延迟，但我们发现随着时间的推移，海水对脑组织的破坏性影响将逐渐表现出来，并且占了主要作用，导致血脑屏障破坏加剧，最终加重创伤性脑水肿。海水浸泡导致细胞膜内外离子浓度紊乱、自由基增多，使得血脑屏障破坏加剧，神经元和神经胶质细胞膜水通道异常开放[9]可能是导致上述表现的原因。今后我们将在该实验动物模型的基础上针对氧化应激水平和水通道蛋白等环节开展进一步研究，以揭示其深层次的机制。
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