2016, Vol. 37
2. 上海交通大学医学院仁济医院南院肿瘤介入科, 上海 201112
2. Department of Tumor Intervention, Renji Hospital, Shanghai Jiaotong University School of Medicine, Shanghai 201112, China
在外科实践中，部分肝切除术(partial hepatectomy,PHx)后肝再生有利于恢复肝功能，预防肝衰竭[1~2]。本课题组在前期实验中发现细胞外基质降解酶——乙酰肝素酶(heparanase，HPSE)对大鼠PHx后肝再生具有正向调控作用[3]，但其机制目前仍不清楚。为此，本研究以70%肝切除大鼠为肝再生模型，运用小干扰RNA(small interfering RNA，siRNA)抑制 HPSE表达，以探讨其调控肝再生的作用机制。
1 材料和方法 1.1 大鼠肝再生模型制备SPF级雄性SD大鼠，体质量250～300 g，由第二军医大学实验动物中心提供[动物生产许可证号：SCXK(沪)2013-0016]。按照Higgins和Anderson[4]的方法行70%肝切除。
1.2 HPSE siRNA的制备和转染实验用HPSE siRNA序列为：sense 5′-AGC UUC GUA CCU UGG CCA GTT-3′，antisense5′-CUG GCC AAG GUA CGA AGC UTT-3′(上海吉凯基因化学技术有限公司)；转染试剂为in vivo-jetPEI-Gal (法国Polyplus公司)。试剂制备和转染方法同文献[3]。
1.3 实验分组将实验大鼠分为5组：对照组(Control组，无手术操作)、假手术组(Sham组，仅开关腹)、70%肝切除组(PHx组，仅行70%肝切除)、空载体组(PHx+vector组，于70%肝切除后立即从尾静脉注射不含siRNA的in vivo-jetPEI-Gal溶液1 mL/鼠)和siRNA干扰组(PHx+siRNA组，于70%肝切除后立即从尾静脉注射in vivo-jetPEI-Gal-siRNA复合物1 mL/鼠)。每组6只大鼠。肝切除后24 h处死所有大鼠，分别取肝组织进行相关检测。
1.4 免疫组化检测肝组织肝细胞生长因子(hepatocyte growth factor，HGF)和血管内皮生长因子(vascular endothelial growth factor，VEGF)蛋白的表达将各组大鼠肝组织标本制成石蜡切片，按照厂家操作说明以enVision法(试剂盒购于丹麦DAKO公司)检测HGF和VEGF蛋白的表达，HGF抗体和VEGF抗体购于美国Santa Cruz公司；二抗染色后，在光镜下连续观察10个高倍视野，分别计数阳性细胞数；然后计算每100个细胞中的阳性细胞数；最后将各组数据以对照组为参照进行标准化，结果以各组与对照组的比值表示。
1.5 蛋白质印迹法检测肝组织基质金属蛋白酶(matrix metalloprotein，MMP)-2和MMP-9蛋白的表达检测按文献[3]方法进行，MMP-2抗体和MMP-9抗体购于美国Santa Cruz公司，最后以Fluor-S多功能成像系统及Quantity One软件(美国Bio-Rad公司)对发光条带进行扫描拍照和定量分析(以GAPDH为内参)。
1.6 肝组织微血管密度(microvessel density,MVD)检测以Ⅷ因子免疫组化染色(方法同1.4项，一抗为Ⅷ因子抗体，购自美国Santa Cruz 公司)标识肝组织微血管，然后进行计数：先用40倍光镜扫视整个切片，寻找高血管密度区域，然后在此区域内以200倍光镜随机取5个视野，计数每个视野中染成棕色的微血管数目，取其平均值。各组数据以对照组为参照进行标准化，结果以各组与对照组的比值表示。
1.7 统计学处理采用SPSS14.0软件进行数据处理。数据以x±s表示，独立样本t检验用于两样本间均数的比较，单因素方差分析用于多个样本间均数的比较。检验水准(α)为0.05。
2 结 果 2.1 HPSE siRNA对大鼠肝组织中HGF蛋白表达的影响免疫组化结果(图 1)显示，PHx组和PHx+vector组大鼠肝组织中HGF蛋白表达较Control组和Sham组增高(P＜0.05)，而PHx+siRNA组HGF蛋白的表达较其他组均降低(P＜0.01)，提示HPSE对大鼠肝组织中HGF蛋白的表达有正向调控作用。
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图 1 各组大鼠肝组织中HGF蛋白的表达(免疫组化) Fig 1 Expression of HGF in rat liver (immunohistochemistry) A: Control group; B: Sham group; C: PHx group; D: PHx+vector group; E: PHx+siRNA group; F: Relative expression compared to control group. HGF: Hepatocyte growth factor; PHx: Partial hepatectomy; siRNA: Small interfering RNA. Original magnification: ×400 (A-E). *P＜0.05,**P＜0.01 vs control and sham groups; △△P＜0.01 vs PHx and PHx+vector groups. n=6,x±s |
2.2 HPSE siRNA对大鼠肝组织中VEGF蛋白表达的影响
免疫组化结果(图 2)显示PHx组和PHx+vector组大鼠肝组织中VEGF蛋白的表达较Control组和Sham组增高(P＜0.05)，而PHx+siRNA组VEGF蛋白的表达较其他组均降低(P＜0.01)，提示HPSE对大鼠肝组织中VEGF蛋白的表达有正向调控作用。
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图 2 各组大鼠肝组织中VEGF蛋白的表达(免疫组化) Fig 2 Expression of VEGF in rat liver (immunohistochemistry) A: Control group; B: Sham group; C: PHx group; D: PHx+vector group; E: PHx+siRNA group; F: Relative expression compared to control group. VEGF: Vascular endothelial growth factor; PHx: Partial hepatectomy; siRNA: Small interfering RNA. Original magnification: ×400 (A-E). *P＜0.05，**P＜0.01 vs control and sham groups; △△P＜0.01 vs PHx and PHx+vector groups. n=6,x±s |
2.3 HPSE siRNA对大鼠肝组织中MVD的影响
实验结果(图 3)显示PHx组和PHx+vector组大鼠肝组织中MVD较Control组和Sham组增高(P＜0.05)，而PHx+siRNA组的MVD较其他组均降低(P＜0.01)，提示HPSE对大鼠肝组织中的MVD有正向调控作用。
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图 3 各组大鼠肝组织中的MVD(免疫组化) Fig 3 Expression of MVD in rat liver (immunohistochemistry) MVD: Microvessel density; PHx: Partial hepatectomy; siRNA: Small interfering RNA. *P＜0.05，**P＜0.01 vs control and sham groups; △△P＜0.01 vs PHx and PHx+vector groups. n=6,x±s |
2.4 HPSE siRNA对大鼠肝组织中MMP-2和MMP-9蛋白表达的影响
PHx组和PHx+vector组大鼠肝组织中MMP-2和MMP-9蛋白表达较Control组和Sham组增高(P＜0.01)，而PHx+siRNA组MMP-2和MMP-9蛋白的表达较其他组均降低(P＜0.01，图 4)，提示HPSE对大鼠肝组织中MMP-2和MMP-9的表达有正向调控作用。
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图 4 各组大鼠肝组织中MMP-2(A)和MMP-9(B)表达 Fig 4 Expression of MMP-2 (A) and MMP-9 (B) in rat liver MMP: Matrix metalloprotein; PHx: Partial hepatectomy; siRNA: Small interfering RNA. **P＜0.01 vs control and sham groups; △△P＜0.01 vs PHx and PHx+vector groups. n=6,x±s |
3 讨 论
研究表明肝脏再生与细胞外基质(ECM)密切相关，ECM降解重塑一方面能够为再生细胞提供排列骨架，另一方面能够促进肝细胞增殖[5]。HPSE是一种特异性糖苷内切酶，其降解底物是硫酸乙酰肝素，后者是ECM中的重要成分。HPSE能够通过参与ECM的降解和重塑、释放活化ECM中的各类生长因子、激活信号转导等多种机制在胚胎发育、组织修复等过程中发挥重要作用[6]。Carmel等[7]研究证实HPSE能够促进肝再生过程中肝细胞和内皮细胞的增殖。
HGF已被证实是最强有力的促肝细胞分裂原，也是启动肝再生的关键因子[8~9]。本研究发现 HPSE能够显著增加HGF活性蛋白的表达，提示HPSE可能通过HGF通路调控肝再生。Carmel等[7]报道 HPSE不能增加肝切除后的HGF mRNA表达水平，提示HPSE主要在蛋白质水平调控HGF的表达。其可能机制为正常 ECM中绑定有大量无活性的HGF前体蛋白，HPSE表达增加后，特异性水解ECM，将HGF前体蛋白释放，并对其进行剪切活化，使活性HGF蛋白大量增加[6]，从而在肝切除后启动肝细胞再生过程中发挥作用。
血管生成是肝再生的重要条件之一[10~11]，VEGF 是强效促血管生长因子。本研究发现，HPSE能够明显促进大鼠残肝VEGF的表达和增高MVD，提示HPSE可能通过促进血管生成调控肝再生。HPSE可通过3条途径促进血管生成：途径1是与HPSE水解酶活性相关的经典途径，即HPSE通过水解ECM释放和活化其中储存的各种生长因子，如VEGF和碱性成纤维生长因子(bFGF)等，从而刺激血管内皮细胞增殖和迁移，促进血管生成[12~13]。途径2是HPSE通过激活蛋白激酶B(Akt)途径刺激内皮细胞迁移，促进血管生成[14]；另有研究发现HPSE能够通过激活p38磷酸化促进内皮细胞迁移和血管生成[15]。途径3是HPSE通过上调VEGF表达促进血管生成，研究发现无酶活性的HPSE能够上调VEGF mRNA和蛋白表达，其调控作用是通过激活Src家族成员的磷酸化实现的，给予Src磷酸化抑制剂可有效阻断这一通路[15~16]。途径2和途径3均是新近发现的不依赖于HPSE水解酶活性的新的通路，也是目前研究的热点。
已有实验证实MMP-2和MMP-9在肝再生中发挥重要作用，其表达增加能够促进肝再生[17]。本研究发现HPSE表达减少能够下调MMP-2和MMP-9的表达，提示HPSE可能通过MMP-2和MMP-9通路调控肝再生。Purushothaman等[18]研究发现，HPSE能够通过丝裂原活化蛋白激酶/细胞外信号调节蛋白激酶(mitogenactivated protein kinase/extracelluar regulated protein kinase，MAPK/ERK)路径在mRNA水平调控MMP-2和MMP-9的表达，上调HPSE表达可促进ERK磷酸化，ERK磷酸化后MMP-2和MMP-9表达增加；而给予MAPK/ERK通路抑制剂阻断ERK磷酸化能够抑制MMP-2和MMP-9的表达；HPSE还能够促进尿激酶型纤维蛋白酶原激活剂及其受体 (urokinase-type plasminogen activator/urokinase-type plasminogen activator receptor,uPA/uPAR)的表达，后者对MMP-2和MMP-9的基质降解功能有协同作用，可共同促进肝再生。
综上所述，HPSE可能通过以下机制调控肝再生：(1)释放激活ECM中的HGF等生长因子，促进肝细胞增殖；(2)促进血管生成；(3)上调MMP-2和MMP-9的表达，促进肝再生。当然，肝再生是一个非常复杂的生物过程，其调控机制仍有待进一步深入探讨。
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