2016, Vol. 37
, CHENG Hui, TANG Gu-sheng, DING Jing, HU Xiao-xia, YANG Jian-min, WANG Jian-min, LÜ Shu-qing
多发性骨髓瘤(multiple myeloma, MM)是一种恶性浆细胞增殖性疾病，其发病率居血液系统恶性肿瘤的第2位[1]。虽然近年来对其治疗取得了一定进展，如蛋白酶体抑制剂硼替佐米(bortezomib)的应用极大提高了治疗的总反应率，延长了患者的生存期[2]，但MM仍不可治愈，复发率高。除初治不敏感的患者外，有近一半的初治敏感患者复发后对硼替佐米治疗的反应性降低[3]，因此寻找新的治疗药物、探索联合用药方案是进一步提高MM疗效和预后的关键。布鲁顿酪氨酸激酶(Bruton’s tyrosine kinase, BTK)是一种胞质酪氨酸蛋白激酶，主要表达于各分化阶段的B细胞，在除T细胞、NK细胞和正常浆细胞之外的其他造血细胞中也有表达，对正常B细胞的分化、发育及功能有重要影响[4-5]。近年的研究表明，BTK在多种造血系统恶性肿瘤，如慢性淋巴细胞白血病、弥漫大B细胞淋巴瘤、套细胞淋巴瘤、急性髓细胞白血病及MM中的表达均升高[6]。针对BTK的选择性抑制剂依鲁替尼(ibrutinib)可通过与BTK活性位点的半胱氨酸残基(Cys-481)共价结合而抑制其磷酸化，从而不可逆地抑制其激酶活性，其对BTK的半数抑制浓度(median inhibitory concentration, IC50)为0.5 nmol/L[7]，目前已在慢性淋巴细胞白血病、套细胞淋巴瘤、弥漫大B细胞淋巴瘤及急性髓细胞白血病中显示出有效的体内外抗肿瘤活性[8-11]，对MM的作用也有报道[12-13]。AVL-292(CC-292)是另一种新型的BTK选择性抑制剂，其作用机制与依鲁替尼相似，对BTK的IC50＜0.5 nmol/L，目前有关AVL-292的研究正处于针对某些复发难治性B细胞性非霍奇金淋巴瘤及慢性淋巴细胞白血病的临床Ⅰ期试验[14]中，但该药对MM的作用研究报道尚少。本研究通过观察比较两种BTK抑制剂依鲁替尼和AVL-292对人MM细胞系H929、RPMI8226细胞增殖和凋亡的影响，以及与硼替佐米的联合效应，探讨其可能的效应机制，以期为BTK抑制剂的临床应用提供一定的实验依据。
1 材料和方法 1.1 药物及主要试剂依鲁替尼、AVL-292(Selleck公司；目录号：S2680，S7173)，硼替佐米(西安杨森制药有限公司，批号FCZTA00)。RPMI 1640培养基(HyClone公司)，胎牛血清(Gibco公司)，CCK-8细胞增殖及毒性检测试剂盒、AnnexinⅤ-FITC/PI细胞凋亡检测试剂盒[东仁化学科技(上海)有限公司]，p65(NF-κB p65)、p-p65(p-NF-κB p65)、p-BTK (Tyr223)、p-ERK1/2 (Thr202/Tyr204)和cleaved caspase-3单抗(Cell Signaling公司)，ERK1/2单抗(巴傲得生物科技有限公司)，Akt、p-Akt (Ser473)单抗(Affinity公司)，Bcl-xL单抗(Santa Cruz公司)，BTK多抗(Proteintech公司)，β-actin单抗、辣根过氧化物酶(HRP)标记的山羊抗兔和山羊抗小鼠二抗、BCA蛋白定量检测试剂盒、SDS-PAGE凝胶制备试剂盒(武汉谷歌生物科技有限公司)。
1.2 细胞株和细胞培养人MM细胞系H929和RPMI8226购自广州吉妮欧生物科技有限公司。细胞培养于含10%胎牛血清的RPMI 1640培养液中，于37℃、5%CO2、饱和湿度孵箱中培养，2~3 d换液一次，取对数生长期细胞进行实验。
1.3 CCK-8法检测细胞增殖活性取对数生长期细胞，调整细胞密度为5×104/mL，接种于96孔板，每孔200 μL。向各孔加入不同浓度的依鲁替尼(终浓度分别为0.001、0.01、0.1、1、5、10、50、100 μmol/L)或AVL-292(终浓度分别为0.001、0.01、0.1、1、5、10、50、100 μmol/L)。以加药孔为实验孔，不加药孔为对照孔，另设空白孔，每组4个复孔。培养24 h或48 h后，每孔加入CCK-8试剂10 μL，继续培养2 h后检测450 nm处光密度(D)值。实验重复3次。细胞生存率(%)=(D实验孔-D空白孔)/(D对照孔-D空白孔)×100%，增殖抑制率(%)=100%-细胞生存率。用GraphPad Prism 5软件计算药物的IC50。药物联合实验时，将依鲁替尼(5、10 μmol/L)或AVL-292(5、10 μmol/L)分别与不同浓度的硼替佐米(5、10、20、50 nmol/L)联合处理H929和RPMI8226细胞，48 h后采用上述方法评价各组细胞的增殖活性。应用公式R=Sexp/Sobs评价两种药物的协同作用，其中R为协同系数，Sexp为两种单药作用后细胞生存率之乘积，Sobs为实际检测的联合用药的细胞生存率。当R>1.0时，两种药物具有协同作用[15]。
1.4 流式细胞术检测细胞凋亡率取对数生长期细胞，调整细胞密度为1×105/mL，接种于6孔板。实验设6组：对照组(无药物)、20 nmol/L硼替佐米组、10 μmol/L依鲁替尼组、10 μmol/L AVL-292组、20 nmol/L硼替佐米+10 μmol/L依鲁替尼组和20 nmol/L硼替佐米+10 μmol/L AVL-292组。向各孔加入上述不同浓度药物。培养48 h后收集细胞，离心去上清，磷酸盐缓冲液(PBS)洗2次，将细胞重悬于500 μL结合缓冲液中，取100 μL，加入5 μL Annexin Ⅴ-FITC及5 μL PI，混匀；室温避光反应15 min后，再加入400 μL结合缓冲液。1 h内用流式细胞仪检测细胞凋亡率，总细胞凋亡率(%)=Annexin Ⅴ-FITC单阳性细胞(早期凋亡)百分率+Annexin Ⅴ-FITC和PI双阳性细胞(晚期凋亡)百分率。实验重复3次。
1.5 蛋白质印迹法检测H929细胞内BTK信号通路蛋白及凋亡相关蛋白表达取对数生长期H929细胞，调整细胞密度为1×105/mL，接种于6孔板，实验分组同上。培养24 h后，收集各组细胞，提取总蛋白，BCA法测定蛋白含量，每孔取30 μg蛋白上样，10% SDS-PAGE分离，转膜，5%脱脂牛奶封闭1 h后，分别加入适当稀释的一抗过夜，洗膜后加入HRP标记的二抗，室温孵育2 h，洗膜后ECL显影曝光，扫描胶片。
1.6 统计学处理应用SPSS 22.0软件进行统计学分析，数据以x±s表示，两样本均数比较采用t检验，两个以上样本均数的比较采用单因素方差分析并用LSD法进行两两比较。检验水准(α)为0.05。
2 结果 2.1 依鲁替尼和AVL-292对人MM细胞系增殖活性的影响CCK-8法检测结果显示，依鲁替尼和AVL-292均可抑制H929、RPMI8226细胞增殖，其抑制作用呈浓度依赖性。对于H929细胞，当依鲁替尼浓度为10、50、100 μmol/L，AVL-292浓度为5、10、50、100 μmol/L时，24 h细胞活性与48 h细胞活性差异有统计学意义(P＜0.05，P＜0.01)，呈现出时间依赖性。依鲁替尼对H929、RPMI8226细胞的48 h IC50分别为(10.41±3.29) μmol/L和(51.65±13.58) μmol/L，AVL-292对H929、RPMI8226细胞的48 h IC50分别为(7.77±2.99) μmol/L和(6.44±1.06) μmol/L，两药对RPMI8226细胞的IC50差异有统计学意义(P < 0.01)。见图 1。
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图 1 依鲁替尼和AVL-292对H929、RPMI8226细胞增殖的抑制作用 Fig 1 Inhibitory effect of ibrutinib and AVL-292 against proliferation of H929 and RPMI8226 cells |
2.2 依鲁替尼和AVL-292与硼替佐米联合对人MM细胞系增殖活性的影响
将不同浓度的依鲁替尼(5、10 μmol/L)和AVL-292(5、10 μmol/L)分别与不同浓度的硼替佐米(5、10、20、50 nmol/L)联合处理H929、RPMI8226细胞48 h。CCK-8法检测结果显示，随着硼替佐米作用浓度的增加，H929和RPMI8226细胞的生存率逐渐降低。联合依鲁替尼或AVL-292后，生存率下降更为明显；各联合用药组对两种MM细胞的增殖抑制作用均高于相应浓度的单药组(P＜0.05，P＜0.01)；并且两种细胞各联合用药组的协同系数R均＞1.0，表明依鲁替尼与硼替佐米、AVL-292与硼替佐米对H929、RPMI8226细胞增殖的抑制具有协同作用(图 2)。
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图 2 依鲁替尼、AVL-292和硼替佐米对H929、RPMI8226细胞的增殖抑制作用 Fig 2 H929 and RPMI8226 cells were treated with ibrutinib and AVL-292 alone or in combination with bortezomib |
2.3 依鲁替尼和AVL-292与硼替佐米对人MM细胞系凋亡的影响
流式细胞分析结果显示，经20 nmol/L硼替佐米、10 μmol/L依鲁替尼、10 μmol/L AVL-292、20 nmol/L硼替佐米+10 μmol/L依鲁替尼和20 nmol/L硼替佐米+10 μmol/L AVL-292作用48 h后，H929细胞的凋亡率均较对照组升高(P＜0.05，P＜0.01)；且20 nmol/L硼替佐米+10 μmol/L依鲁替尼组和20 nmol/L硼替佐米+10 μmol/L AVL-292组的细胞凋亡率均高于相应单药组，差异有统计学意义(P＜0.01)，说明联合用药对凋亡诱导具有协同作用。而同样的处理后，10 μ mol/L依鲁替尼组和10 μmol/L AVL-292组RPMI8226细胞的凋亡率与其对照组相比差异有统计学意义(P＜0.05)；20 nmol/L硼替佐米组RPMI8226细胞的凋亡与对照组相比差异无统计学意义(P＞0.05)；联合用药组RPMI8226细胞的凋亡率亦高于相应单药组，差异有统计学意义(P＜0.01)，说明联合用药对RPMI8226细胞凋亡诱导亦具有协同作用。见图 3。
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图 3 依鲁替尼、AVL-292和硼替佐米对H929、RPMI8226细胞凋亡的诱导作用 Fig 3 Apoptosis of H929 and RPMI8226 cells induced by ibrutinib and AVL-292 alone or in combination with bortezomib |
2.4 依鲁替尼和AVL-292与硼替佐米对人MM细胞内BTK信号通路蛋白磷酸化及凋亡相关蛋白表达的影响
蛋白质印迹分析法检测药物作用前后H929细胞内BTK信号通路蛋白BTK、NF-κB p65、Akt、ERK和磷酸化蛋白p-BTK、p-p65、p-Akt、p-ERK以及凋亡相关蛋白Bcl-xL、cleaved caspase-3表达水平，结果显示10 μmol/L依鲁替尼和10 μmol/L AVL-292作用24 h后，H929细胞内p-BTK、p-p65、p-Akt、p-ERK和Bcl-xL蛋白水平均较对照组降低(P＜0.05)，cleaved caspase-3蛋白水平均较对照组升高(P＜0.01)；两药分别联合20 nmol/L硼替佐米后，p-BTK、p-p65、p-Akt、p-ERK和Bcl-xL蛋白降低及cleaved caspase-3蛋白增加的程度均较依鲁替尼、AVL-292单独用药组进一步增强(P＜0.05，P＜0.01)。见图 4。
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图 4 依鲁替尼、AVL-292和硼替佐米对H929细胞内BTK信号通路蛋白及凋亡相关蛋白的调节作用 Fig 4 Effects of ibrutinib, AVL-292 and bortezomib on expression of multiple BTK-associated signaling pathway proteins and apoptosis-associated proteins in H929 cells |
3 讨论
NF-κB是一种重要的信号转录因子，其家族由p65(RelA)、RelB、c-Rel、p50 (NF-κB 1)和p52 (NF-κB 2)5个成员组成。在未激活的细胞中，大部分NF-κB与胞质中的抑制因子IκB结合而以无活性状态存在，当细胞受到外界信号刺激后，IκB激酶复合体(IκB kinase, IKK)活化将IκB磷酸化，磷酸化的IκB经泛素-26S蛋白酶体系统降解，使得NF-κB与之分离，并进入细胞核内参与众多介导细胞增殖、抗凋亡及细胞因子分泌的基因的表达[16]。在MM中，NF-κB蛋白表达及活性水平升高，对疾病发生、发展产生重要影响[17]。蛋白酶体抑制剂硼替佐米能够抑制泛素-26S蛋白酶体对IκB的降解，逆转NF-κB活化而发挥抗肿瘤效应[18]。然而，Hideshima等[19]发现硼替佐米也可诱导MM细胞中IKK活化及IκB磷酸化降解，从而激活NF-κB信号，降低硼替佐米的疗效甚至导致耐药。
近年的研究表明，BTK在多种造血系统恶性肿瘤中的表达及活性升高[6]，其选择性抑制剂依鲁替尼在抑制BTK磷酸化激活的同时，也可降低PI3K/Akt、MAPK/ERK和NF-κB信号通路活性而发挥良好的抗肿瘤效应[8-11]。Rushworth等[12]证明，MM细胞系及原代MM细胞中有BTK表达，依鲁替尼抑制RPMI8226、U266和原代MM细胞中NF-κB p65的磷酸化，而p65是NF-κB经典通路中最重要的效应元件，从而抑制NF-κB通路活性来发挥抗肿瘤效应。Tai等[13]发现，依鲁替尼能够抑制MM细胞系ANBL6、INA6和原代CD138+ MM细胞中NF-κB及ERK磷酸化激活，抑制肿瘤细胞增殖。Yu等[20]发现，在多种B淋巴细胞系和原代B细胞中，BTK可以诱导NF-κB的活化，而活化后的NF-κB又可以促进BTK的转录，这种正反馈显著地放大了BTK及NF-κB的信号强度。尤其在硼替佐米耐药的MM细胞中，NF-κB和BTK的磷酸化水平显著升高，并且硼替佐米失去了对NF-κB活化的抑制作用[21]。
本研究中，我们评估了BTK抑制剂依鲁替尼和AVL-292单药及与蛋白酶体抑制剂硼替佐米联合应用对MM细胞系H929和RPMI8226细胞增殖、凋亡的影响，并观察了对BTK、NF-κB等信号通路蛋白和凋亡相关蛋白的表达及磷酸化的调节作用。在前期实验中我们发现，RPMI8226细胞对生长环境变化较敏感，传代、铺板等操作会对细胞活性产生一定影响。即便在不加药对照组，铺板后24 h以内的细胞活性分析亦显示较大的组内差异；而于铺板后48 h检测细胞活性时，复孔间的组内差异减小至正常范围，药物作用趋势清晰，考虑细胞已适应孔板中的生长环境，细胞本身状态一致，组间结果差异主要是由药物浓度差异引起的。因此，在评估依鲁替尼和AVL-292对细胞增殖的影响时，对于H929细胞，我们选取了24 h和48 h的结果进行分析；对于RPMI8226细胞，我们仅以48 h的结果进行分析。结果显示，依鲁替尼对H929和RPMI8226细胞具显著增殖抑制作用，与硼替佐米联合应用有明显的协同增殖抑制作用。Kokabee等[22]发现前列腺癌细胞中有BTK表达，AVL-292(1、10、20、30 μmol/L)能够抑制表达BTK的前列腺癌细胞系LNCaP和DU145细胞增殖。本研究证实AVL-292亦可有效地抑制H929、RPMI8226细胞增殖，与硼替佐米也有明显的协同增殖抑制作用。依鲁替尼和AVL-292对H929细胞48 h的IC50分别为(10.41±3.29)μmol/L和(7.77±2.99)μmol/L，对RPMI8226细胞48 h的IC50分别为(51.65±13.58)μmol/L和(6.44±1.06) μmol/L，AVL-292对两株细胞的48 h IC50值均较依鲁替尼更低；在RPMI8226细胞，两药IC50值差异具有统计学意义(P＜0.01)。流式细胞术分析发现，依鲁替尼和AVL-292均可诱导H929、RPMI8226细胞凋亡，相同浓度(10 μmol/L)的AVL-292对H929和RPMI8226细胞的凋亡诱导率均高于依鲁替尼，而且两药与硼替佐米都有明显的协同凋亡诱导作用，AVL-292联合硼替佐米较依鲁替尼联合硼替佐米能够更显著地诱导细胞凋亡。进一步研究发现，H929细胞有BTK蛋白及活化的BTK蛋白的表达，依鲁替尼和AVL-292作用后p-BTK、p-p65、p-Akt、p-ERK蛋白水平均下调，表明这两种BTK抑制剂可通过抑制BTK活性来抑制下游NF-κB、Akt、ERK信号通路的活性；另外检测结果显示两药分别与硼替佐米联合后，对此3条信号途径的抑制作用进一步增强。此外，依鲁替尼和AVL-292均能下调H929细胞中抗凋亡蛋白Bcl-xL表达，诱导caspase-3剪切，从而激活caspase-3依赖的凋亡；联合硼替佐米后，对Bcl-xL、cleaved caspase-3的调节作用也明显增强。
综上所述，本研究表明，依鲁替尼和AVL-292一方面通过抑制BTK激酶活性，阻断BTK下游NF-κB、Akt和ERK促生存信号通路，抑制人MM细胞增殖；另一方面，通过下调抗凋亡蛋白Bcl-xL表达、促进caspase-3酶解活化，诱导人MM细胞凋亡；与硼替佐米联合应用，对这些信号通路蛋白及凋亡相关蛋白的调节作用增强，从而发挥协同抗MM效应。因此，依鲁替尼和AVL-292作为新型的BTK抑制剂，与硼替佐米联合应用有协同作用，在治疗MM中显示出良好的应用前景，为进一步提高MM患者临床疗效、延缓耐药、改善预后提供新的治疗方案选择。
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