吴茱萸碱(evodiamine，EVO)是植物吴茱萸中一种色胺吲哚类生物碱^[1]。EVO具有抗肿瘤、抗炎、扩张血管、降血压、减肥、免疫抑制等药理作用^[2]，抗肿瘤活性是其最受关注的药理活性之一^[3-5]。但EVO水溶性极差，生物利用度低。包合物作为新的药物载体能够提高难溶性药物的溶解性，提高药物的疗效、减少药物对皮肤黏膜以及胃部的刺激性^[6]。近年来少有研究对EVO及其制剂的在体肠吸收进行报道，本课题首次将EVO与羟丙基-β-环糊精(hydroxypropyl-β-cyclodextrin，HP-β-CD)制备成吴茱萸碱羟丙基-β-环糊精包合物(evodiamine hydroxypropyl-β-cyclodextrin inclusion complex，EHD)，并采用单向肠灌流法研究EHD在大鼠各肠段的吸收特征，为EVO的临床研究提供一定依据。

EVO (纯度 > 99%，武汉远城科技发展有限公司)；HP-β-CD ( > 99%，江苏泰兴新鑫医药辅料有限公司)；Krebs-Ringer缓冲液^[7](自制：NaCl 7.80 g，KCl 0.35 g，CaCl₂ 0.37 g，NaHCO₃ 1.37 g，KH₂PO₄ 0.32 g，MgCl₂ 20 mg，D-葡萄糖1.40 g，蒸馏水溶解定容至1 000 mL，HCl和NaOH调节pH至6.5)；甲醇(色谱纯，上海国药集团化学试剂有限公司)；其余试剂均为分析纯。

1100型高效液相色谱仪(美国Agilent公司)；STA449型综合热分析仪(德国Netzsch公司)；HL-1型恒流泵(上海青浦沪西仪器厂)；TGL-16B型高速台式离心机(上海安亭科学仪器厂)；HHS-4S型电子恒温不锈钢水浴锅(上海康路仪器设备有限公司)。

清洁级雄性SD大鼠购自重庆医科大学实验动物中心[动物许可证号：SCXK (渝) 2012-0001]，体质量(250±20) g。

按处方量(HP-β-CD与EVO的摩尔比为1:1)称取约120 mg HP-β-CD和30 mg EVO于干净的研钵内，加蒸馏水后研磨1 h，40℃真空干燥2 h，用丙酮洗涤，干燥后即得EHD。

采用KBr压片法分别对EVO、HP-β-CD、EVO与HP-β-CD的物理混合物以及EHD在400~4 000 cm^-1内进行红外扫描^[8]。

以空铝坩埚为对照物，另一铝坩锅加入10 mg样品，升温速率为10℃/min，扫描范围0~350℃，量程±25 V，气体为氮气^[9]。分别对EVO、HP-β-CD、EVO与HP-β-CD的物理混合物和EHD进行差示扫描量热分析。

分别取少量的EVO、HP-β-CD、EVO与HP-β-CD的物理混合物和EHD置于不同的载玻片上，将载玻片置于显微镜上，放大200倍观察并照相。

所用色谱柱为大连依利特Lichrospher C₁₈柱(250 mm×4.6 mm，5 μm)；柱温35℃；流动相甲醇:水=75:25(体积比)，流速1.0 mL/min；检测波长225 nm；进样量20 μL。

取适量待测肠灌流液，加入适量甲醇，涡旋混合5 min，16 000×g离心10 min，吸取上清液待测。

按照1.4.1项下色谱条件，将空白肠灌流液、EVO对照品溶液、EHD肠灌流液按1.4.2项处理后分别进样，考察其专属性。

精密称取EVO 10.5 mg，用适量甲醇溶解后，转移至100 mL棕色容量瓶中，甲醇定容至刻度，摇匀，得100 μg/mL对照品溶液。精密量取对照品溶液100、300、500、1 000、2 000、3 000、4 000 μL，分别置于10 mL棕色容量瓶中，加甲醇稀释，定容，摇匀，得到质量浓度为1~40 μg/mL的系列标准溶液。分别取各标准溶液20 μL进样，记录峰面积，以峰面积(A)对EVO的浓度(C)进行线性回归。

分别制备低、中、高质量浓度(1、10、30 μg/mL)的EVO溶液，各质量浓度分别平行配制3份，测定回收率。同日内每个浓度连续进样5次，计算日内精密度；连续5 d测定浓度，计算日间精密度。

用大鼠空白肠灌流液配制低、中、高质量浓度(1、10、30 μg/mL)的EVO溶液，各质量浓度平行配制3份，置于(37.0±0.5)℃的水浴中孵育，分别于0、1、2、4 h取样测定EVO含量。

称取EVO 18.0 mg，用Krebs-Ringer液稀释并定容至200 mL，配制成质量浓度为90 μg/mL的EVO灌流液。

称取含EVO 18.0 mg的EHD，用Krebs-Ringer液稀释并定容至200 mL，配制成质量浓度为90 μg/mL的EHD灌流液。

将SD大鼠随机分成2组，禁食12 h，全程不禁水，分别用EVO及EHD进行在体肠灌流实验。每只大鼠分别腹腔注射3.5%水合氯醛(10 mL/kg)麻醉后固定。沿腹中线打开腹腔约3 cm。分别在十二指肠上端和往下10 cm处、空肠上端和往下10 cm处、盲肠上端往上10 cm处，以及结肠上端往下10 cm处剪开一个小口，插管结扎。将这4个肠段用生理盐水浸润的纱布盖上，并将肠内容物冲洗干净。将100 mL Krebs-Ringer循环液放入恒温水浴(37℃)中，再将恒温至37℃的Krebs-Ringer液以0.4 mL/min流速在肠段灌流10 min，平衡后将Krebs-Ringer液排空。然后换15 mL的EHD或EVO药物循环液(相当于含EVO 90 μg/mL)，以流速0.25 mL/min进行单向灌流实验。4肠段出口处分别用25 mL的容量瓶接流出液体，1 h后结束灌流实验。取下4个25 mL容量瓶用Krebs-Ringer液稀释至刻度。实验结束后处死大鼠，剪下肠段，测量长度(L)和内径(R)，计算药物的吸收速率常数(Ka)和有效渗透系数(P_eff)。Ka=(X₀-X_t)/C₀tπR²L；P_eff=Q×ln (X_in/X_out)/2πRL；其中，X₀为0时药物量，X_t为t时灌流液中剩余药物量，C₀为0时药物浓度，t为灌注时间，Q为流速，X_in和X_out分别为流入和流出的药物量，R和L分别为各灌流肠段的内径和长度^[10]。

应用Origin 8软件分别对Ka和P_eff进行统计学分析，检验水准(α)为0.05。

由图 1可知，EVO的特征吸收峰是1 144 cm^-1(C-N)、1 510 cm^-1和1 507 cm^-1(苯环的吸收峰)、746 cm^-1和733 cm^-1(苯环上的邻位取代基)，HP-β-CD的特征吸收峰是1 630 cm^-1(糖苷键结构)，EHD和EVO与HP-β-CD的物理混合物图谱中药物特征吸收峰1 144 cm^-1峰消失，746 cm^-1和733 cm^-1峰消失，代表苯环的1 510 cm^-1吸收峰减弱，且EHD减弱程度明显强于EVO与HP-β-CD的物理混合物，表明EHD形成。

图 1 EVO、HP-β-CD、EVO与HP-β-CD的物理混合物和EHD的红外图谱 Fig 1 FTIR of EVO, HP-β-CD, physical mixture and EHD

由图 2可知，EVO在287.5℃有一个吸热峰，为药物的熔融峰。HP-β-CD没有吸热峰，EVO与HP-β-CD的物理混合物在该温度时有此吸热峰，而在EHD中该吸热峰明显减小，表明EVO与HP-β-CD形成了包合物EHD。

图 2 EVO、HP-β-CD、EVO与HP-β-CD的物理混合物和EHD的差示扫描量热法分析图谱 Fig 2 DSC curves of EVO, HP-β-CD, physical mixture and EHD

由图 3D可见有新的物质形成，即形成了包合物EHD, 形态与EVO与HP-β-CD的物理混合物明显不同。

图 3 EVO、HP-β-CD、EVO与HP-β-CD的物理混合物和EHD的显微照片 Fig 3 Microphotographs of EVO, HP-β-CD, physical mixture and EHD

在1.4.1项色谱条件下，EVO峰形良好且辅料不干扰其测定，保留时间为5.7 min。

图 4 肠灌流液的色谱图 Fig 4 Chromatogram of intestinal perfusion liquid

建立标准曲线得回归方程：A=213.68C-23.633，r=0.999 7，结果表明EVO在1~40 μg/mL浓度范围内与峰面积呈良好的线性关系。

EVO的平均回收率为99.85%，RSD为0.162%，符合方法学要求。低、中、高浓度的日内精密度RSD分别为2.2%、1.8%、1.4%，日间精密度RSD分别为1.2%、2.7%、2.5%，符合方法学要求。

结果显示低、中、高浓度EVO溶液的RSD分别为1.1%、0.9%、0.7%，说明在4 h内EVO肠灌流液稳定性较好。

由图 5可知，EHD在各肠段的Ka值以及P_eff值均高于EVO，且EHD在十二指肠、空肠、回肠、结肠中的Ka值分别为EVO的9.07、16.22、11.04、28.86倍, P_eff值分别为EVO的2.41、1.52、1.82、1.09倍。EHD在结肠处的Ka值大于十二指肠、空肠、回肠的Ka值(P < 0.05)；在十二指肠处的P_eff值大于空肠、回肠、结肠的P_eff值(P < 0.05)。EVO在不同肠段的Ka值和P_eff值差异均无统计学意义。各肠段EHD与EVO的Ka值差异均有统计学意义(P < 0.05);十二指肠处EHD与EVO的P_eff值差异有统计学意义(P < 0.05)，其他肠段处差异均无统计学意义。说明将EVO制备成EHD后能提高EVO的吸收。

图 5 大鼠各肠段的吸收速率常数(Ka, A)和有效渗透系数(Peff, B) Fig 5 Absorption rate constants (Ka, A) and effective permeability coefficients (Peff, B) in each intestinal segment

肠灌流法分为单向灌流法和循环灌流法，它是最接近体内真实吸收状态的药物肠道吸收模型，与体内情况相关性很好，可用于研究药物在肠道的吸收程度及药物透过率等^[11]。其中，单向灌流法是药物肠吸收动力学研究的主要方法。本实验采用单向灌流法对大鼠各肠段药物吸收进行研究。

实验结果表明，EHD和EVO在整个肠段均有吸收，且EHD在肠道内的吸收高于游离EVO。EHD与EVO各肠段间的Ka值差异均有统计学意义(P < 0.05)，说明制备成EHD后EVO在各肠段的吸收都有明显提高；EVO不同肠段的Ka值差异无统计学意义，EHD的Ka值分别为结肠>空肠>十二指肠>回肠，其在结肠处的Ka值与十二指肠、回肠、空肠处差异均有统计学意义(P < 0.05)，说明将EVO制备成EHD后药物在结肠处吸收程度最好。胡江波等^[12]将EVO制备成水包油型复方吴茱萸碱纳米乳，并考察其在体肠吸收情况，结果显示EVO的Ka值是十二指肠大于空肠、回肠、结肠，复方吴茱萸碱纳米乳的Ka值是回肠大于空肠、结肠、十二指肠，说明将EVO制备成制剂后不同肠段的吸收情况发生了改变。研究表明，根据P_eff的大小将吸收能力分为3类：P_eff < 0.3×10^-5 cm·s^-1表明吸收差，P_eff > 2×10^-5 cm·s^-1表明吸收完全，介于两者之间为中等吸收^{[7, 13]}。EHD和EVO在4个肠段的P_eff均大于2×10^-5 cm·s^-1，表明其在大鼠各肠段的吸收完全。且EHD的Ka值和P_eff值与EVO相比都有明显的提高。可能是由于EHD的组成成分HP-β-CD能提高难溶性药物EVO的溶解性，减少药物对胃肠道的刺激，促进药物与肠黏膜的融合，从而提高胃肠道对药物的吸收。