吴茱萸碱(evodiamine,EVO)是从芸香科植物吴茱萸成熟果实中提取的一种色胺吲哚类生物碱^[1]。研究表明EVO具有抗肿瘤、降血压、抗炎镇痛、减肥、调节内分泌等多种药理活性^[2-4]，其中抗肿瘤作用是近年来的研究热点。EVO抗肿瘤机制有多种，如阻滞肿瘤细胞周期，改变周期相关蛋白的表达^[5]；阻断肿瘤细胞信号通路，抑制肿瘤细胞的侵袭和转移等^[6]。然而，游离EVO具有水溶性差、半衰期短、口服生物利用度低等不足^[7]，限制了其在临床上的应用。

研究者们试图通过各种制剂技术改善EVO的缺点。柳珊等^[8]采用单一的磷脂复合物技术将EVO制备成EVO磷脂复合物，改善了其口服生物利用度；严春临等^[9]将吴茱萸次碱制备成环糊精包合物，增加了吴茱萸次碱的溶解度和生物利用度。但这些单一的制剂技术并未很好解决EVO的不足。研究表明，将多个药物载体组合形成的新载体可能兼具单个载体的优点，联合应用多种制剂技术使得药物具有协同作用^[10]。本实验同时采用羟丙基-β-环糊精与磷脂2个药物载体，联合应用包合物技术、磷脂复合物技术及纳米乳技术，将EVO与羟丙基-β-环糊精、磷脂在一定条件下形成EVO-羟丙基-β-环糊精磷脂复合物，然后制备成新型纳米乳(evodiamine novel nano emulsion,ENNE)，希望能同时解决EVO水中溶解度低、生物半衰期短、口服生物利用度低等问题。

EVO(纯度＞99%，武汉远城科技发展有限公司)，羟丙基-β-环糊精(江苏泰兴新鑫医药辅料有限公司)，卵磷脂(德国Lucas Meyer公司)，单辛酸甘油酯(河南正通化工有限公司)，聚氧乙烯氢化蓖麻油(南京都莱生物技术有限公司)，PEG-400(国药集团化学试剂有限公司)，甲醇(色谱纯，美国新天地科技有限公司)，其他试剂均为分析纯；LC-20A型高效液相色谱仪(日本岛津公司)，AB204S电子分析天平(瑞士Mettler Toledo仪器公司)，HWCL-3型集热式恒温磁力搅拌器(郑州长城科工贸有限公司)，G-16医用离心机(北京白洋医疗器械有限公司)，VOS-30A型真空干燥箱[施都凯设备(上海)有限公司]；雄性SD大鼠12只，体质量(250±20) g，由第三军医大学实验动物中心提供[动物生产许可证号：SCXK(渝)2012-0005]。

分别称量适量EVO、羟丙基-β-环糊精238 mg、卵磷脂136 mg溶于20 mL无水乙醇中，置于50 ℃水浴中磁力搅拌3 h，40 ℃旋转蒸发除去无水乙醇，真空干燥得固体。分别称取上述固体86 mg、单辛酸甘油酯4.40 g、PEG400 3.75 g、聚氧乙烯氢化蓖麻油1.25 g于烧杯，置于恒温水浴锅中搅拌混匀后，缓慢滴入0.6 g水，继续恒温水浴搅拌，待溶液变澄清后超声除去气泡，即得外观澄明且伴有蓝色乳光的油包水型ENNE。

称取适量EVO于25 mL 容量瓶中，加入适量0.5% 羧甲基纤维素钠水溶液，超声混匀，最后加入0.5% 羧甲基纤维素钠水溶液稀释至刻度，即得EVO混悬液。

将12只雄性SD大鼠随机平均分成参比组与受试组，给药前禁食12 h，灌胃给药，参比组给予EVO混悬液(100 mg/kg)，受试组给予ENNE(相当于EVO 100 mg/kg)^[12]，两组分别于给药前取空白血，分别于给药后5 min、10 min、15 min、30 min、45 min、1 h、2 h、5 h、8 h、12 h、24 h、48 h、72 h从大鼠眼底取血0.3 mL，收集的血液样品置于含少许肝素的离心管，3 187×g离心10 min，收集上层血浆备用。

精密量取血浆样品200 μL，加入甲醇800 μL，涡旋3 min后，4 250×g离心10 min，吸取上清液，真空干燥挥去甲醇，用150 μL 甲醇复溶，9 562×g离心5 min，取上清液。

色谱柱：Hypersil ODS2 C₁₈柱(4.6 mm×250 mm，5 μm；大连依利特分析仪器有限公司)；柱温：25 ℃；流动相：甲醇-0.1%甲酸水溶液(66∶34，体积比)；流速：1.0 mL/min；进样体积：100 μL；检测波长：225 nm。

精密称取EVO 10 mg，置于100 mL容量瓶中，用甲醇溶解稀释至刻度，作为贮备液；精密量取EVO贮备液1 mL，置10 mL容量瓶中，用甲醇稀释至刻度，即得EVO对照品溶液。精密量取适量EVO对照品溶液，用甲醇稀释成8、16、30、60、120、240、480、1 000、2 400 ng/mL系列对照溶液，室温放置备用。

取EVO对照品溶液、空白血浆、血浆样品、EVO对照品＋空白血浆各200 μL，按1.5项下方法操作，按1.6项下色谱条件进行分析，记录色谱图。

精密吸取空白血浆样品100 μL，分别加入不同浓度的EVO系列对照溶液100 μL，即得4、8、15、30、60、120、240、500、1 200 ng/mL系列模拟血浆样品溶液，按1.5项下方法操作，按1.6项下条件进行分析，记录色谱图。以EVO浓度(X)对峰面积(Y)进行线性回归，得回归方程。

取空白血浆100 μL，加入EVO对照品溶液，分别配制成低、中、高3个质量浓度(8、60、500 ng/mL)的血浆样品各5份，按1.5项下方法操作，按1.6项下条件进行分析，记录峰面积，通过标准曲线计算实测浓度(Cr)，以实测浓度与理论浓度之比(Cr/Cs)考察方法回收率。

取空白血浆100 μL，加入EVO对照品溶液，配制成低、中、高3个质量浓度(8、60、500 ng/mL)的EVO血浆样品各5份，按1.5项下方法操作，按1.6项下条件进行分析，记录峰面积，分别在同一天内连续测定考察日内精密度，连续测定3 d考察日间精密度。

精密量取空白血浆100 μL，加入EVO对照品溶液配成低、中、高3个质量浓度(8、60、500 ng/mL)的血浆样品各5份，室温放置8 h、1 d、3 d后，按1.5项下方法操作，按1.6项下条件进行分析，计算RSD，考察血浆样品室温稳定性。精密量取空白血浆样品100 μL，加入EVO对照品溶液配成低、中、高3个质量浓度(8、60、500 ng/mL)的血浆样品各5份，-20 ℃冷冻保存7、14、30 d后，按1.5项下方法操作，按1.6项下条件进行分析，计算RSD，考察生物样品-20 ℃冻存的稳定性。

以血药浓度对时间绘制血药浓度-时间曲线，实验数据分别采用DAS 2.1.1 软件与统计矩法处理，计算非房室模型与房室模型时ENNE与EVO的主要药动学参数，根据公式F(相对生物利用度)=AUC_ENNE/AUC_EVO×100%计算ENNE的相对生物利用度。达峰时间(peak time,T_max)、峰浓度(peak concentration,C_max)采用实测值。采用DAS 2.1.1软件将AUC_0-t、AUC_0-∞ 及C_max经对数转换后进行双单侧t检验和[1-2α] 90%置信区间考察，比较ENNE与EVO的生物等效性。

EVO对照品、空白血浆、血浆样品色谱图结果见图 1。结果表明，血浆中的内源性物质及其他杂质对EVO色谱峰无干扰，EVO的峰形良好，对称因子为0.98，EVO的保留时间为10.45 min。

图 1 专属性色谱图 Fig 1 Chromatogram of specificity

所得回归方程为Y=185.09X+247.67，r=0.999 9。结果表明，血浆中EVO的质量浓度在4~1 200 ng/mL范围内浓度与峰面积呈良好的线性关系，符合体内分析方法学要求。当信噪比为3时血浆中EVO的检测限为1 ng/mL，当信噪比为10时定量限为4 ng/mL。

血浆样品中EVO浓度为8、60、500 ng/mL时测得的方法回收率分别为(99.95±1.49)%、(101.61±1.05)%、(101.54±1.19)%，结果表明该方法回收率良好。

血浆样品中低、中、高3个质量浓度(8、60、500 ng/mL) EVO的日内精密度分别为7.62%、5.51%、2.28%，日间精密度分别为8.77%、6.92%、3.49%，结果表明该分析方法的精密度良好。

低(8 ng/mL)、中(60 ng/mL)、高(500 ng/mL)质量浓度的EVO血浆样品室温放置8 h、1 d、3 d后计算得到RSD分别为10.42%、9.68%、5.73%；低(8 ng/mL)、中(60 ng/mL)、高(500 ng/mL)质量浓度EVO血浆样品-20 ℃放置7、14、30 d后计算得到RSD分别为10.84%、8.73%、5.75%。结果表明，计算所得的RSD均＜15%，血浆样品在室温下放置3 d内和-20 ℃冻存30 d内稳定性好，能够保证血浆样品完成测定。

结果见图 2。ENNE与EVO灌胃给药后在大鼠体内均有吸收、分布和消除过程，ENNE在约3 h内完成吸收分布，C_max约为773 μg/L，EVO在约2 h内完成吸收分布，C_max约为107 μg/L；随后EVO进入消除相，在约24 h时血药浓度几乎为0，但此时ENNE的血药浓度约为39 μg/L，约在30 h时ENNE血药浓度几乎为0。结果表明，ENNE比EVO吸收好，能够在大鼠体内缓慢地释放药物，并能在较长时间内维持较高的血药浓度。

图 2 灌胃后ENNE与EVO的血药浓度-时间曲线图 Fig 2 The concentration-time curves of ENNE and EVO after intragastric administration

由表 1中非房室模型参数可见，ENNE的C_max约是EVO的7倍，T_max约是EVO的2倍，MRT_0-∞约是EVO的1.1倍，计算得到ENNE的相对生物利用度是EVO的934.71%。

表 1 (Tab 1)

表 1 ENNE与EVO的主要药动学参数 Tab 1 The main pharmacokinetic parameters of ENNE and EVO n=6,x±s Non-compartmental model Compartmental model ENNE EVO ENNE EVO Cmax ρB/(μg·L-1) 773.07±38.24 107.58±6.58 773.07±38.24 107.58±6.58 Tmax t/h 5±0 2±0 5±0 2±0 AUC0-t (μg·h·L-1) 8 824.33±183.40 928.08±54.84 8 238.35±55.50 857.96±74.07 AUC0-∞ (μg·h·L-1) 8 833.06±177.80 945.99±48.92 8 248.88±62.92 884.82±83.52 MRT0-t t/h 8.99±0.27 7.59±1.11 MRT0-∞ t/h 9.06±0.35 8.21±0.97 t1/2 t/h 1.70±0.60 1.05±0.45 ENNE: Evodiamine novel nano emulsion; EVO: Evodiamine; AUC: Area under curve; MRT: Mean residence time

表 1 ENNE与EVO的主要药动学参数 Tab 1 The main pharmacokinetic parameters of ENNE and EVO

根据偏差分析最小原则和权重残差平方和(R²)拟合度越接近1的拟合模型判断最优房室模型，结果判断ENNE与EVO均符合二室模型。由表 1可见，房室模型与非房室模型的T_max与C_max一致。由房室模型主要参数计算得到ENNE的相对生物利用度是EVO的932.27%。结果表明，采用房室模型与非房室模型分析所得药动学参数基本一致。

结果显示,ENNE的AUC_0-t和AUC_0-∞经对数转换后[1-2α] 90%置信区间分别为132.9%～134.4%、132.7%～133.8%，不在等效标准80%～125%范围内；ENNE的C_max对数转换后[1-2α] 90%置信区间为140.9%～143.4%，不在等效标准70%～143%范围内；T_max采用实测值，对T_max进行Wilcoxon非参数检验，结果表明ENNE和EVO差异有统计学意义(P=0.001)。ENNE与EVO的主要药代参数之间的差异有统计学意义，但受试周期和受试个体之间的差异没有统计学意义。按照生物等效性标准判定，ENNE与EVO不具有生物等效性。

本研究成功建立了HPLC法测定大鼠血浆中EVO的含量，血浆中基质与溶剂均对EVO血浆样品的测定无干扰，该方法专属性强、准确度高，能够满足体内样品分析的要求。

羟丙基-β-环糊精是一种低毒、安全、有效的药用辅料，将EVO与羟丙基-β-环糊精制成包合物能改善药物水溶性差等问题^[13]。磷脂是生物膜的主要成分，广泛用作药物载体，能使药物顺利通过细胞膜，促进药物吸收^[14]。纳米乳能增加难溶性药物的溶解度，使药物在体内有一定的缓释作用^[15]。本研究采用羟丙基-β-环糊精与磷脂2个药物载体，联合应用包合物技术、磷脂复合物技术及纳米乳技术，将EVO制备成新型纳米乳ENNE，并通过计算房室模型与非房室模型主要药代动力学参数研究了ENNE与EVO的药代动力学行为。结果表明，采用房室模型与非房室模型分析药代动力学参数所得结果基本一致。ENNE的C_max为(773.07±38.24) μg/L，约是EVO的7倍，T_max为(5±0) h，约是EVO的2倍，将EVO制成ENNE促进了EVO的吸收，延长了T_max。EVO口服吸收差，C_max较ENNE低，使得EVO在大鼠体内维持时间短，而ENNE的包封率高，在大鼠体内消除慢，清除率低，半衰期长，达到C_max后能够长时间维持较高浓度，从而减少给药次数，提高患者顺应性。

本研究由房室模型和非房室模型的药动学参数计算的ENNE相对生物利用度分别为932.27%与934.71%，Hu等^[16]发现EVO超分子纳米乳在大鼠体内的相对生物利用度为630.35%，结果表明ENNE比EVO超分子纳米乳的相对生物利用度提高得更多。经生物等效性分析，ENNE与EVO不具有生物等效性，ENNE的生物利用度高于EVO。本研究首次将EVO制备成ENNE并研究了其体内药代动力学行为，为药物新剂型研究提供一定的参考依据。