RPMI1640(Gibco公司)、新生牛血清(杭州四季青生物工程材料有限公司)、荧光染料Hoechst33342(Sigma)、Ruxolitinib(瑞士诺华)、Cell Counting Kit-8(CCK-8，日本同仁化学研究所)、引物(北京赛百胜基因技术有限公司)、抗体(Santa Cruz 公司)、Caspase-Glo 3/7 检测试剂盒(Promeg，USA)，Gen 5酶标仪(Bio-Tek公司)，BD FACSCalibur流式细胞仪(BD 公司)。

人红白细胞白血病HEL细胞购自中国科学院上海生命科学研究院细胞资源中心。HEL细胞于孵育箱中培养，孵育箱条件为37℃、5%CO₂。细胞培养液为加入10%胎牛血清的RPMI1640培养液。根据细胞生长状况，2~3 d换液1次，取对数生长期细胞进行实验。

将对数期细胞分为实验组和对照组，实验组根据加入Ruxolitinib的浓度不同分为1、5、10、50、100、500 nmol/L组。对照组为不加入Ruxolitinib药物。

收集对数生长期细胞，加入细胞悬液100 μL到96孔板，边缘孔用无菌水或磷酸缓冲盐溶液(phosphate buffer saline,PBS)填充，设置空白组及对照组，空白组加100 μL无细胞培养基及不同浓度Ruxolitinib，对照组加100 μL细胞不加Ruxolitinib，实验组及空白组分别加不同浓度Ruxolitinib，每组设5个平行孔，分别于0、24、48、72 h后加入CCK-8溶液10 μL，待2~ 4 h后酶标仪测定450 nm处光密度D₄₅₀，按照公式:细胞活力(%)= ，绘制细胞生长曲线。

分别取48 h后对照组及100 nmol/L Ruxolitinib处理组的HEL细胞，取100 μL细胞悬液，加入终浓度为10 μg/mL的Hoechst33342，避光染色15~20 min，取40 μL细胞悬液滴于载玻片，荧光显微镜下观察凋亡细胞形态。

收集不同浓度Ruxolitinib作用12、24 h的HEL细胞。PBS清洗2次，加入5 μg/mL罗丹明123，在37℃、5％CO₂条件下作用30 min，流式细胞仪检测各处理组细胞荧光强度。

选取不同浓度Ruxolitinib作用12、24 h后的HEL细胞各约5 000个，分别加入96孔板，每组3个复孔，同时将Caspase-Glo 3/7底物与缓冲液相混合，取100 μL加入孔板，混合孵育4 h，检测波长405 nm处的D值，计算细胞活化程度。

取对数生长期HEL细胞，在6孔板中接种3 mL细胞悬液，约含10⁵个细胞，按照实验分组分别加入不同浓度Ruxolitinib，分别孵育0、24、48、72 h。收取细胞，0.5 mL PBS洗2次，120×g离心，弃去上清液；75%冰乙醇固定过夜，离心，弃上清；0.5 mL PBS洗1次，加入RNAase 1 mL，37℃恒温水浴30 min，120×g离心，弃上清；加入DNA抽提液1 mL，室温静置30 min，1 800×g离心5 min，弃上清。加入500 μL 0.1 mg/mL碘化丙啶(propidium iodide,PI)染液，置于4℃避光染色30 min，流式细胞仪检测。

收集不同浓度Ruxolitinib作用48 h后的HEL细胞，TRIzol法提取各组细胞总RNA，电泳鉴定RNA纯度及含量。根据Vazyme HiScript 合成试剂盒反转录合成cDNA，反转录反应体系20 μL，包括细胞RNA 2 μg，50 U/μL RNasin 0.5 μL，50 μg/mL随机物1 μL，10 mol/L dNTP 2 μL，5×反转录反应缓冲液4 μL，M-MLV反转录酶200 U，余用焦碳酸二乙酯(diethypyrocarbonate，DEPC)处理水补足至20 μL。37℃反应60 min，95℃反应5 min 后终止反应。产物进行PCR扩增或分装稀释，放置于－20℃，保存时间不超过6个月。PCR反应体系20 μL，JAK2上游引物为5′-CAG CAA GTA TGA TGA GCA AGC TTT-3′，下游引物为5′-TGA ACC AGA ATA TTC TCG TCT CCA C-3′。内参基因β-actin上游引物为5′-CTG GCA CCA CAC CTT CTA CAA T-3 ′，下游引物为5′-AAT GTC ACG CAC GAT TTC CCG C-3′。JAK2扩增片段产物长度101 bp，β-actin扩增片段长度382 bp。取cDNA 2 μL 作为模板，建立20 μL反应体系。反应条件：94℃变性5 min，94℃变性45 s，60℃退火1 min，68℃延伸45 s，40个循环。扩增后的产物进行琼脂糖凝胶电泳，全自动凝胶成像仪下分析。

收集各组细胞，提取蛋白；根据蛋白定量结果分装蛋白，将分装好的蛋白置于沸水中煮沸变性5 min，配电泳分离胶、浓缩胶，蛋白上样，电泳使蛋白分离，转移至PVDF膜上，配5%脱脂奶粉，37℃烤箱中封闭2 h，封一抗，4℃过夜；Tris盐酸缓冲液洗膜，封二抗，37℃烤箱中2 h，化学发光液混合，应用Alpha Innotech 系统对PVDF膜进行扫描及图像分析。

采用SPSS 19.00统计软件进行分析处理，所有数据均以 x±s 表示，两样本均数比较采用t检验，多组均数比较采用方差分析，组间两两比较选用q检验。检验水准(α)为0.05。

CCK-8结果显示：不同浓度的Ruxolitinib(1、5、10、50、100、500 nmol/L)作用HEL细胞后，随着时间延长细胞活力逐渐下降，Ruxolitinib作用48 h后，HEL细胞活力分别为(97.0±4.4)%、(92.0±3.9)%、(88.0±3.7)%、(81.0±3.1)%、(64.0±2.9)%、(38.0±2.2)%；随着Ruxolitinib药物浓度增大，HEL细胞活力下降，并呈时间依赖性，通过计算48 h Ruxolitinib IC₅₀为283.47 nmol/L(图 1)。

图 1 CCK-8检测不同浓度Ruxolitinib作用不同时间的HEL细胞活力 Fig 1 HEL cell viability was detected by CCK-8 assay after treated with Ruxolitinib at different concentrations for different periods *P＜0.05 vs 0 h. n=3, x±s

100 nmol/L Ruxolitinib作用HEL细胞48 h后，Hoechst33342染色对照组Hoechst着色为淡蓝色，细胞核内DNA分布均匀，核呈圆形或卵圆形，无固缩、变形(图 2A)。实验组Hoechst着色核由于浓集而呈亮蓝色，细胞出现凋亡，核固缩、变形(图 2B)。100 nmol/L Ruxolitinib组亮蓝色细胞[(49.21±1.80)%]较对照组[(10.02±1.40)%]增多(P<0.05)。

图 2 Hoechst33342荧光染色检测Ruxolitinib作用HEL细胞48 h后凋亡形态图 Fig 2 Apoptosis was detected by Hoechst33342 staining in HEL cells after treated with Ruxolitinib for 48 h A: Control group； B: 100 nmol/L Ruxolitinib treatment group

Ruxolitinib作用HEL细胞不同时间(12及24 h)后，罗丹明123荧光强度在对照组HEL细胞内均最强，随着Ruxolitinib浓度的增加，罗丹明123荧光强度逐渐减弱，呈剂量依赖性降低(表 1)。

表 1 (Table 1)

表 1 不同浓度Ruxolitinib作用12及24 h后HEL细胞内线粒体膜电位的变化 Tab 1 Mitochondrial membrane potential in HEL cells treated with different concentrations of Ruxolitinib for 12 or 24 h n=3， x±s Treating time t/h Control Ruxolitinib c B/(nmol·L -1) 1 5 10 50 100 500 12 380±51 340±40 ** 296±38 ** 245±32 ** 201±26 ** 134±25 ** 98±21 ** 24 411±55 302±32 ** 256±31 ** 197±29 ** 142±24 ** 103±22 ** 56±18 ** **P<0.01 vs control group

表 1 不同浓度Ruxolitinib作用12及24 h后HEL细胞内线粒体膜电位的变化 Tab 1 Mitochondrial membrane potential in HEL cells treated with different concentrations of Ruxolitinib for 12 or 24 h

不同浓度Ruxolitinib干预HEL细胞12 、24 h后凋亡蛋白Caspase-3/7活性呈现剂量依赖性升高(P<0.01)。见表 2。

表 2 (Table 2)

表 2 不同浓度Ruxolitinib作用HEL细胞12和24 h后凋亡蛋白Caspase-3和Caspase-7活性变化 Tab 2 Caspase-3 and -7 protein activity change of HEL cells after treated with different concentrations of Ruxolitinib for 12 or 24 h n=3， x±s Treating time t/h Control Ruxolitinib c B/(nmol·L -1) 1 5 10 50 100 500 12 0.145±0.010 0.198±0.014 ** 0.221±0.016 ** 0.275±0.020 ** 0.340±0.023 ** 0.410±0.028 ** 0.523±0.035 ** 24 0.151±0.011 0.225±0.019**△△ 0.287±0.021**△△ 0.315±0.027**△△ 0.357±0.031**△△ 0.451±0.034**△△ 0.589±0.039**△△ **P<0.01 vs control group; △△P<0.01 vs 12 h group

表 2 不同浓度Ruxolitinib作用HEL细胞12和24 h后凋亡蛋白Caspase-3和Caspase-7活性变化 Tab 2 Caspase-3 and -7 protein activity change of HEL cells after treated with different concentrations of Ruxolitinib for 12 or 24 h

孵育0、24、48、72 h不同浓度下Ruxolitinib对HEL细胞周期的影响结果显示，随着 Ruxolitinib药物浓度的增加及作用时间的延长，G₀/G₁期细胞比率逐渐上升，G₂/M期比率减少。100 nmol/L Ruxolitinib作用细胞48 h后，G₀/G₁期细胞比率[(73.1±3.6)%]明显高于对照组[(45.2±3.0)%]。见图 3、表 3。

图 3 流式细胞术检测Ruxolitinib对HEL细胞周期的影响 Fig 3 Cell cycle was detected by flow cytometry after HEL cells were treated with Ruxolitinib A: Control group; B: 100 nmol/L Ruxolitinib treatment group

表 3 (Table 3)

表 3 不同浓度Ruxolitinib对HEL细胞周期的影响结果 Tab 3 Changes of HEL cell cycle after treated with different concentrations of Ruxolitinib n=3， x±s Cell cycle Control Ruxolitinib c B/(nmol·L -1) 1 5 10 50 100 500 G 0/G 1 45.2±3.0 49.1±3.0 ** 54.6±3.4 ** 59.8±3.4 ** 67.4±3.6 ** 73.1±3.6 ** 80.4±3.7 ** G 2/M 28.0±2.1 21.5±1.9 ** 17.4±1.8 ** 12.3±1.7 ** 8.4±1.1 ** 4.6±0.9 ** 3.6±0.4 ** **P<0.01 vs control group

表 3 不同浓度Ruxolitinib对HEL细胞周期的影响结果 Tab 3 Changes of HEL cell cycle after treated with different concentrations of Ruxolitinib

不同浓度Ruxolitinib作用HEL细胞48 h后，实验组JAK2 mRNA表达比对照组减低，并随着药物浓度的增加呈逐渐减低趋势(图 4)，对照组和5、10、50、100、500 nmol/L Ruxolitinib组JAK2 mRNA相对表达量分别为(0.98±0.09)、(0.83±0.07)、(0.65±0.06)、(0.52±0.04)、(0.32±0.03)、(0.12±0.01)。

图 4 RT-PCR检测不同组细胞JAK2 mRNA表达结果 Fig 4 mRNA level of JAK2 was measured by RT-PCR in each group M: Marker;1: Control group; 2: 5 nmol/L Ruxolitinib; 3: 10 nmol/L Ruxolitinib; 4: 50 nmol/L Ruxolitinib; 5: 100 nmol/L Ruxolitinib; 6: 500 nmol/L Ruxolitinib

与对照组(0 h)相比，100 nmol/L Ruxolitinib作用HEL细胞0、24、48 h后，HEL细胞p-JAK2、p-ERK、Bcl-2蛋白表达逐渐下降，Bim蛋白表达增加(P<0.01，图 5)。

图 5 Ruxolitinib 作用HEL细胞后p-JAK2、p-ERK、Bcl-2及Bim蛋白表达变化 Fig 5 Changes of p-JAK2, p-ERK, Bcl-2, and Bim protein expressions in HEL cells after treated with 100 nmol/L Ruxolitinib **P<0.01 vs 0 h group; △△P<0.01 vs 24 h group. n=3， x±s

JAK-STAT转导通路在细胞生长、分化、免疫功能和造血中发挥重要生理病理作用。JAK2-STAT5信号通路在多种组织及细胞系中异常表达和活化，并与肿瘤的增殖、分化、凋亡、血管新生及肿瘤侵袭有密切关系^[1]。骨髓增殖性肿瘤患者大多存在JAK2 V617F突变，此突变作为一种组成性激活酪酸激酶，在缺乏细胞因子的情况下自发性激活JAK2-STAT5信号通路^{[4, 5]}。HEL细胞是JAK2 V617F突变阳性人红白血病细胞，JAK2 V617F突变可使JAK2-STAT5信号通路活化，进而使细胞异常表达。Oku等^[6]通过干扰RNA(siRNA)阻断JAK2-STAT5，发现JAK2 V617F突变的骨髓增殖性肿瘤细胞增殖明显受到抑制，认为JAK2 V617F具有促进细胞增殖及抑制凋亡作用。

Ruxolitinib是选择性JAK1/2激酶抑制剂，现已应用于临床，口服单剂量为每日5～200 mg，能够被迅速吸收，在1～2 h 内达到最大血药浓度^[7]。其通过抑制JAK/STAT的磷酸化发挥作用。在JAK2 V617F突变阳性的骨髓增殖性肿瘤动物模型中，Ruxolitinib可明显逆转脾肿大，减少循环中炎性细胞因子的水平，优先消除肿瘤细胞，显著延长生存期而未抑制骨髓及免疫功能^{[8, 9]}。一项在欧洲九国进行的开放、随机化COMFORT-Ⅱ期研究结果显示，Ruxolitinib在治疗48周后，28.5%患者脾脏体积至少缩小至原体积的35%^[10]。Quintás-Cardama等^[11]研究显示，不同浓度Ruxolitinib 能剂量依赖性抑制JAK2 V617F阳性Ba/F3细胞活力，其IC₅₀为127 nmol/L。本研究结果显示Ruxolitinib作用于人JAK2 V617F阳性红白血病HEL细胞后，细胞活力随着时间及浓度的加大而下降，48 h IC₅₀ 为283.47 nmol/L。荧光染色显示Ruxolitinib作用HEL细胞后，细胞形态出现明显凋亡改变。G₀/G₁期细胞呈剂量依赖性增加，G₂/M期细胞减少，考虑Ruxolitinib诱导HEL细胞G₀/G₁期周期阻滞。

在细胞凋亡过程中，线粒体膜渗透性转换通道开放，线粒体膜电位减低，释放细胞色素C，导致凋亡蛋白Caspase-3的激活，从而诱导细胞凋亡^[12]。线粒体膜电位在细胞凋亡早期就开始下降，并早于DNA片段化。本实验结果表明，1~500 nmol/L的Ruxolitinib作用HEL细胞12、24 h，线粒体膜电位水平进行性降低，呈剂量依赖性减低。Caspase-3/7蛋白活性逐渐增加，从而诱导细胞凋亡。

BCL-2家族是细胞凋亡通路中重要的调节蛋白，根据功能可以分为抗凋亡BCL-2亚家族和促凋亡BAX 亚家族以及促凋亡BH3亚家族(也称BH3-only蛋白)。Bim作为BH3亚家族成员之一，在细胞凋亡的启动和调节上具有重要的作用，并已被证实与JAK2信号通路有关^[13]，可通过结合Bcl-2蛋白促进凋亡Bax和Bak样蛋白释放，诱导细胞凋亡。通过siRNA抑制Bim基因后，细胞凋亡明显减少。Bim受多种刺激调节，包括PI3K-AKT-FOXO-3A和ERK 1/2的MAP激酶途径，这两条通路均可被JAK2-STAT5活化^{[14, 15]}。本研究结果显示，1~500 nmol/L Ruxolitinib 作用于HEL细胞48 h后，JAK2 mRNA及p-JAK2蛋白表达水平呈剂量依赖性减低，p-ERK蛋白表达亦降低，Bcl-2活性减低，同时Bim表达上调，表明Ruxolitinib通过抑制JAK2通路阻断ERK 1/2，抑制Bim磷酸化，Bim蛋白降解减少，Bim活化增强，进而抑制细胞增殖，诱导肿瘤细胞凋亡^{[14, 16, 17]}。

综上所述，Ruxolitinib可通过抑制JAK2及ERK 1/2的MAPK激酶途径抑制人红白血病HEL细胞增殖及促进肿瘤细胞凋亡，这为Ruxolitinib治疗骨髓增殖性肿瘤及白血病提供了实验依据。