2015, Vol. 36
肝细胞癌(hepatocellular carcinoma，HCC)占我国恶性肿瘤死亡原因第二位[1]。在我国大陆地区，HCC主要是乙型肝炎病毒(hepatitis B virus,HBV)慢性感染所致，大约90%的HCC患者在诊断时血清乙肝表面抗原(hepatitis B surface antigen,HBsAg)和(或)HBV DNA阳性。 HBV慢性感染是遗传因素和病毒因素交互作用的结果，其中Ⅱ类人类白细胞抗原和某些炎症基因遗传多态性和HBV基因型起重要作用[2, 3, 4, 5]。只有在慢性持续性炎症条件下，HBV才能有效致癌[6]。炎症介质除了可以通过激活核酸编辑酶和氧化应激促进基因组变异外，还可以通过表观遗传机制调控信号通路关键分子表达，实现对HCC进化的驱动作用，其中所调控microRNA (miRNA) 在HBV致癌过程中起重要作用。
miRNA是一类长度为19~25 nt的内源性单链小RNA。在HBV所致持续性炎症状态下，许多miRNA表达水平会发生变化。 2012年，我们系统总结了HBV致癌相关miRNA在HCC发生发展过程中的作用，列举了miRNA表达水平改变对HBV复制及表达的影响、对HCC发生发展的影响，分析了miRNA作为HCC诊断、预后标记物及治疗靶标的可能性[7]。本文我们着重论述在此以后报道的相关发现。
1 HBV所致持续性炎症状态可导致 miRNA表达水平改变近期研究表明，HBV持续感染会影响部分miRNA转录过程中关键调节因子的表达。例如DRCR8作为miRNA合成过程中的重要功能蛋白，能够对miRNA进行加工，生成成熟具有一定功能的miRNA。但HBV持续感染会上调转录因子YY1，而YY1对DGCR8启动子区具有抑制作用，使其表达水平相应降低，miRNA合成过程因此受到影响，相应miRNA的表达水平也发生了变化[8]。不仅如此，有些miRNA受慢性炎症的影响表达水平也会发生变化。例如慢性乙肝患者血清中miR-210的水平与炎症的严重程度相关，当血清丙氨酸转氨酶、天冬氨酸转氨酶、总胆固醇等生化指标升高时，miR-210也相应升高；这种升高过程可能与肝癌细胞的脱氢酶活性下降以及低氧环境下HBV的复制有关，当持续性炎症导致肝脏低氧环境形成时，就会引起miR-210表达水平的升高[9]。
2 miRNA异常表达在慢性乙型肝炎、肝硬化、HCC发生和发展中的作用由于miRNA不直接参与蛋白编码过程，而是通过与mRNA的特定序列结合，调控其表达水平，在细胞增殖、分化、凋亡，个体发育乃至疾病发生和发展等过程中起重要作用，因此当miRNA表达水平发生变化时，miRNA对相应生理功能的调节能力也会发生变化，打破机体的内环境稳态，影响某些生理或病理过程的进程。
2.1 慢性乙型肝炎HBV持续感染下，miRNA表达发生了改变，而异常表达的miRNA可以影响HBV的复制及蛋白表达过程，在慢性乙型肝炎的发病过程中起到了十分重要的作用。比如HBV能够反式激活c-Myc的转录，高表达的c-Myc也通过此种方式反式激活miR-17-92簇 (miR-17-5p,miR-18a,miR-19a,miR-19b,miR-20a,miR-92a-1)，当miR-17-92簇过表达时，就会负反馈抑制HBV的复制过程，抑制了HBV的持续感染[10]。某些miRNA表达水平的改变也可以促进HBV病毒的持续感染。比如miR-26b可以与半胱氨酸、组氨酸富集域1(CHORDC1)mRNA 的3′非编码区结合抑制其表达，当miR-26b因HBV感染被抑制时，CHORDC1蛋白表达得到上调。大量表达的CHORDC1通过增强HBV启动子区的活性，促进了HBV的复制与转录，有利于HBV的持续感染[11]。部分miRNA还同细胞因子及趋化因子驱动下的炎症反应通路相关，持续炎症会改变这些miRNA表达水平。比如hsa-miR-1231在持续性炎症作用下表达上调，由于它与HBV核心及X区域序列高度同源，所以其与HBV核心区序列的结合会影响HBV的复制及核心蛋白的表达[12]。由于HBV自然清除是一个动态网络调控的过程，所以任何环节的改变都会影响其进程，miRNA作为其中的重要环节对慢性乙型肝炎进程具有不可忽视的影响。
2.2 肝硬化慢性乙型肝炎发展到肝硬化的过程中，众多miRNA表达水平发生变化，它们对肝细胞、肝星形细胞等调节能力也发生了改变，影响了肝硬化进程。研究发现，转化生长因子β (TGF-β)在肝硬化中起着重要作用，当肝星形细胞或肝细胞的TGF-β信号通路受到抑制时肝硬化进程被显著阻滞。在此过程中，miR-101可以通过抑制TβRⅠ(TGF-β受体)及其转录激活因子KLF6来减弱TGF-β的信号；不仅如此，miR-101还可以逆转肝星形细胞的活性使之转变为静息状态，因此miR-101在TGF-β通路所致肝硬化中起着十分重要的抑制作用。然而，肝硬化组织中miR-101的表达水平是下调的，使得肝硬化组织中的miR-101不能有效抑制TGF-β信号通路，促进了肝硬化的发生、发展[13]。此外，细胞外基质的分泌情况也对肝硬化的进程具有影响。通过与跨膜脯氨酰羟化酶mRNA的3′非编码区特异性结合，miR-122可以负向调控其表达，抑制细胞外基质蛋白的分泌，减缓肝硬化进展[14]。某些miRNA还可以作为预测肝硬化的分子标记物。比如，miR-29在不同肝硬化分期患者血清中的表达水平不同，与肝硬化程度以及坏死性炎症程度成负相关，有望成为预测慢性乙肝患者疾病进展的分子标记物[15]。
2.3 HCC 2.3.1 HCC细胞增殖HCC组织中某些miRNA表达水平的改变会引起部分细胞增殖相关基因及信号通路的变化，改变细胞增殖速率，影响HCC的发生与发展。比如HCC中下调表达的miR-342-3p可以通过NF-κB通路调节其下游靶基因IKK-γ、TAB2及TAB3，使之表达水平上调，促进HCC细胞的增殖[16]。miR-122在哺乳动物肝脏中特定表达，并对肝脏多种生物功能起关键调节作用，其表达水平的降低与HBV感染所致HCC预后不良以及静脉血管侵袭有关。HBV感染情况下，肝细胞核因子表达受到抑制，miR-122的表达水平相应降低，作为miR-122下游靶基因的多肽N-乙酰氨基半乳糖转移酶(polypeptide N-acetylgalactosaminyl-transferase，GALNT10) 表达随之上调。由于GALNT10能够增强表皮生长因子受体功能，所以miR-122下调能够增强表皮生长因子受体诱导的细胞增殖过程，促进HCC发生与发展[17]。HBx蛋白可以通过白介素6通路激活STAT3转录因子，促进miR-21的表达。作为癌基因类miRNA，miR-21可以抑制包括PTEN在内的抑癌基因的表达，并且抑制细胞凋亡蛋白酶-3介导的凋亡过程，最终促进HCC的发生与发展[18, 19]。在HBV感染下，miR-181a启动子区活性增强，表达上调，并通过与3′非编码区域结合降低E2F转录因子5 (E2F transcription factor 5，E2F5) 基因的表达水平。由于E2F5具备抑制细胞增殖的能力，所以E2F5表达下调促进了HBV相关HCC的发生与发展[20]。
编码miRNA基因的单核苷酸多态性(single nucleotide polymorphism,SNP) 也对HCC有影响。我们前期研究发现，位于pre-miR-218 假定启动子区的rs11134527和pre-miR-34b/c的rs4938723 (T>C)可能是HCC的危险因素；pre-miR-196a2的rs11614913 (T>C)、miRNA-122的rs3783553 SNP位点则会影响HBV突变，进而影响HCC的发生与发展[21, 22, 23]。
2.3.2 HCC细胞凋亡细胞增殖与凋亡失衡是癌症发生和发展的主要原因，部分miRNA对凋亡相关蛋白的调节作用可以影响到HCC细胞的凋亡过程，进而影响HCC的发生与发展。比如高表达的miR-29能够引起抗凋亡蛋白bcl-2家族成员mcl-1的下调，并通过mcl-1参与的线粒体凋亡途径诱导细胞凋亡。由于HCC中miR-29处于低表达状态，mcl-1参与的线粒体凋亡途径受到抑制，抑制了HCC细胞的凋亡[24]。HBV感染能够引起与miR-15a/16互补的序列大量产生，其与miR-15a/16结合会降低内源性miR-15a/16的浓度，促使miR-15a/16下游基因Bcl-2的表达上调。由于bcl-2蛋白家族能够抑制细胞凋亡过程，所以miR-15a/16下调能够抑制HCC细胞凋亡[25]。除了可以调节凋亡蛋白的表达外，部分miRNA还可以通过某些信号通路对HCC凋亡过程起影响。肿瘤初始阶段，TGF-β信号通路具有抑制细胞增殖并诱导细胞凋亡的作用。当HBV感染肝脏后，HBV mRNA能通过下调miR-15a来实现对SMAD家族成员7 (SMAD family member 7，Smad7 ) 的调控，引起Smad7表达上调。由于Smad7是TGF-β信号通路的关键抑制因子，所以TGF-β信号通路随着Smad7表达水平的升高被抑制，HCC细胞凋亡过程也被抑制[26]。HBV相关HCC组织中，miR-429的表达通常是下调的，其下游靶基因Notch1的表达则相应上调。由于Notch1可以促进细胞增殖、抑制细胞凋亡过程，并且可以促进HBV表面抗原HBsAg及e抗原(HBeAg)的分泌，所以miR-429表达水平的降低对于HBV相关HCC的发生与发展起促进作用[27]。
2.3.3 HCC转移HCC转移是影响肝癌患者生存的重要因素，研究如何降低肝癌的侵袭及转移能力有着十分重要的临床意义。在众多影响HCC转移的机制中，miRNA对HCC转移的影响可以从转录后水平的层面进行解释。部分miRNAs通过负向调控某些可以促进HCC细胞转移的蛋白或信号通路来抑制HCC细胞转移，当这些miRNAs表达水平异常下调时，就会促进HCC的转移。星形胶质细胞上调基因1 (astrocyte elevated gene-1，AEG-1)在多种肿瘤组织中都有表达上调现象，并在肿瘤细胞转移和侵袭方面起着十分重要的作用。HBV相关HCC细胞中，miR-375和miR-136 在HBx的作用下表达下调，作为其下游靶基因的AEG-1表达随之升高，从而促进了HCC的转移[28]。与癌旁组织相比，HCC组织中miR-152的表达显著下调，下游靶基因肿瘤坏死因子受体超家族成员6b (tumor necrosis factor receptor superfamily member 6b，TNFRSF6B) 的表达随之上调。由于TNFRF6B能够提高细胞运动能力、促进细胞增殖并抑制细胞凋亡，所以其表达水平的上调促进了HCC的发生与发展[29]。 ras相关GTP结合蛋白(ras-related GTP-binding protein，RAB) GTP酶5A(RAB5A)是Rab亚家族成员，它具有类似癌基因的作用，常常在多种细胞功能，如细胞增殖、分化、凋亡及血管生成中起关键作用。HBV感染时，miR-101-3p启动子区活性下降致使其表达降低，与3′非编码区结合抑制RAB5A (RAS致癌基因家族成员) 表达的作用减弱，Rab5a表达水平因此上调，促进了HCC细胞的转移及增殖能力[30]。此外，某些过表达miRNA也可以促进HCC的转移。有研究发现，自噬小体介导的选择性自噬过程可以降解miR-224。而在HBV相关HCC中，这一自噬过程出现异常，使得miR-224不被降解，累积增多，其下游靶基因SMAD家族成员4 (SMAD family member 4，Smad4) 表达相应降低，从而促进了细胞的转移以及肿瘤的形成[31]。表 1总结了2012年以来报道的在HBV致癌进化发育过程中起重要作用的miRNA及其影响的主要信号通路。
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表 1 miRNA表达水平发生改变对肝癌发生发展的影响 Tab 1 The effect of miRNA expression changes on hepatocellular carcinoma (HCC) development |
慢性乙型肝炎、肝硬化发展为HCC的过程是一个漫长的进化发育过程。当HBV感染人体后会导致机体免疫系统作出相应反应，如果此时机体免疫能力较弱则不能有效清除HBV，炎症反应进入持续阶段。此时HBV及宿主体细胞突变增多，并在炎症微环境下选择出了有利于HCC发生和发展的突变，同时许多有利于HCC发生和发展的表观遗传学变化也被诱发出来，比如miRNA表达水平的改变就可以通过对靶基因及相关通路的调控影响疾病进程。根据miRNA在HCC发生和发展中所起的作用，可将miRNA分为癌基因类miRNA和抑癌基因类miRNA。正常情况下，两者存在平衡关系，而在HBV感染和(或)持续炎症作用下，这种平衡被打破，癌基因类miRNA上调、抑癌基因类miRNA下调，这种表观遗传学上的改变使得疾病进程向着有利于HCC进化的方向进行。抑癌基因类miRNA如miR-342-3p、miR-29、miR-375等表达水平的下调可以促进细胞增殖、凋亡及转移能力；癌基因类miRNA如miR-181a、miR-224的上调可以抑制细胞的凋亡、促进细胞的转移能力。但是目前研究存在以下问题：(1)现有的研究主要通过细胞系及动物模型来进行，由于其中的miRNA与人体微环境条件下miRNA表达水平存在差异，很难阐明miRNA在HBV致癌过程中的具体作用；(2)现有研究主要是探讨表达异常的miRNA对癌症进化发育过程所起的作用，缺乏对其异常表达机制的探讨，miRNA表达水平变化和持续性炎症的因果关系尚不明确。因此，应开展大样本长期的队列研究以明确miRNA在HCC发生和发展中的作用，并通过对重要miRNA进行控制，以阻遏HBV促进HCC进化发育进程。
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