胆道系统肿瘤简称胆系肿瘤，是起源于胆囊和胆管上皮的恶性肿瘤，包括肝内胆管癌、肝外胆管癌、胆囊癌以及壶腹癌^[1]。手术切除仍是目前最主要的治疗方法，但手术切除难度较大，且术后复发、转移概率高，对放疗不敏感，预后较差^{[2, 3]}。因此，探讨新的有效的胆系肿瘤治疗方法显得十分必要。肿瘤免疫治疗近年来受到了广泛研究和关注，其中树突状细胞(dendritic cells，DC)是目前所知在体内功能最强的抗原递呈细胞，能够诱导机体产生特异性抗肿瘤免疫反应； 细胞因子诱导的杀伤细胞(cytokine induced killer cells，CIK细胞)是由IFN-γ、IL-2及CD3单抗诱导的一种广谱抗肿瘤免疫细胞，二者联合，能够更加有效地发挥抗肿瘤作用，是目前过继细胞免疫治疗的首选方法^[4]。本研究采用自体DC疫苗联合CIK细胞治疗胆系肿瘤患者，初步观察其临床疗效，探讨二者联合治疗胆系肿瘤的可行性。

2012年1月至2014年10月第二军医大学东方肝胆外科医院生物治疗科收治的85例符合入选标准的胆系肿瘤患者，其中男46例，女39例，年龄20~75岁，平均(56.0±10.5)岁。患者中肝内胆管癌41例，肝门部胆管癌12例，肝外胆管癌7例，胆囊癌23例，壶腹癌2例；45例经病理证实，40例经临床资料及影像学诊断。41例为初治的局部晚期患者，32例为术后复发或转移患者，12例为术后辅助治疗。ECOG评分0分8例，1分53例，2分23例，3分1例；根据UICC/AJCC第7版TNM分期：Ⅳ期62例，Ⅲ期17例，Ⅱ期6例。

入选标准：(1)年龄≥18岁，且≤75岁；(2)预期寿命至少为6个月；(3)ECOG评分0~3；(4)主要实验室指标：白细胞≥3.0×10⁹/L、血小板≥60×10⁹/L、血红蛋白≥85 g/L，总胆红素正常范围或≤1.5倍正常值上限，转氨酶正常范围或≤5倍正常值上限，血清肌酐正常范围或≤1.5倍正常值上限。本研究经第二军医大学东方肝胆外科医院伦理委员会批准，所有患者或授权家属均签署DC-CIK治疗知情同意书。

治疗周期当天用FRESENIUS COM.TEC血细胞分离机(FRESENIUS KABI公司)进行PBMC采集，采用auto MNC程序，P1YA耗材，采集数量约为2×10⁸/L。

采集的PBMC用不含血清的AIM-Ⅴ培养液(Gibco)洗涤2次后，稀释至4×10⁶/L。将细胞转移至培养袋中培养2 h，收集非贴壁细胞，用于培养CIK细胞，贴壁细胞用于制备DC细胞，向其中加入含有GM-CSF(1 000 ng/mL)、IL-4(1 000 U/mL)和FLT-3(50 ng/mL)的培养液，每2 d更换1/2培养液，补充细胞因子，第6天用包含多种肿瘤抗原(TAA)的腺病毒(血清35型)进行转染，收集DC细胞，培养24 h后，向其中加入TNF-α(100 ng/mL)和CD40L(50 ng/mL)，然后继续培养2 d。非贴壁细胞收集后将密度调整至2×10⁹/mL，然后放入37℃、5%CO₂孵箱中，加入IFN-γ(1 000 U/mL)培养，每天更换1/2培养液，加入CD3多克隆抗体(50 ng/mL)和IL-2(1 000 U/mL)。第9天将经过多抗原刺激的DC加入CIK培养液中，在上述条件下共同培养2 d。经细菌、真菌及内毒素检测阴性后分别于第11、15天收集悬浮的、经表型鉴定的成熟DC，溶于1 mL生理盐水中，皮内注射于腹股沟淋巴结；分别于第11、13、15天收集CIK细胞，细胞总数>2×10¹⁰/L，离心、洗涤后，溶于含0.25％人血白蛋白生理盐水溶液300 mL中，静脉滴注，30 min回输入患者体内。所有细胞因子均购自Novoprotein公司(上海)，所有细胞培养过程均在GMP标准车间内完成。

观察指标包括生活质量、疗效评价、免疫功能、不良反应及生存时间。生活质量评价：对患者临床症状进行问卷调查，然后进行统计和比较。疗效评估：根据WHO制定的实体瘤疗效评估标准进行评估，分为完全缓解(CR)、部分缓解(PR)、疾病稳定(SD)及疾病进展(PD)。免疫功能的评价：采用流式细胞仪检测患者外周血中CD3⁺、CD3⁺CD4⁺、CD3⁺CD8⁺、CD4⁺/CD8⁺、CD3⁺CD56⁺及调节性T细胞的变化。生存时间从第1次接受细胞治疗开始计算，每30 d 1个疗程，2个疗程后复查增强CT进行疗效评估，随访时间至2014年12月。

采用SPSS 17.0统计软件，计量资料以 x±s 表示，不同时间点的比较采用重复测量方差分析，生存分析采用Kaplan-Meier生存曲线分析，计算中位生存时间。检验水准(α)为0.05。

2 结 果 2.1 临床症状改善情况

治疗前及治疗后2周分别对患者临床症状进行问卷调查、统计和比较，结果(表 1)表明：与治疗前相比，DC-CIK治疗后患者临床症状有明显改善，差异有统计学意义(P<0.05)。

表1(Table 1)

表 1 胆系肿瘤患者免疫治疗后临床症状改善情况 N=85，n 临床症状 免疫治疗前 免疫治疗后 P值 失眠 34 11 <0.05 癌性疼痛 6 2 <0.05 乏力 18 5 <0.05 纳差 21 9 <0.05 恶心、呕吐 2 0 <0.05

表 1 胆系肿瘤患者免疫治疗后临床症状改善情况

大多数患者治疗后为SD(63.5%，54/85)及PR (16.5%,14/85)，个别患者甚至达到CR(2.3%,2/85)，但也有部分患者为PD(17.6%,15/85)。其中1例68岁的女性患者，诊断为肝内胆管癌伴肝门部等多发淋巴结转移，治疗后不但达到了PR，且治疗结束后1年病灶仍保持稳定(图 1)。

图 1 1例患者免疫治疗前后影像学资料对比 A：免疫治疗前；B：免疫治疗后即刻；C：免疫治疗后6个月；D：免疫治疗后1年

结果(表 2)表明：DC-CIK治疗后，淋巴细胞亚群中CD3⁺、CD3⁺CD4⁺、CD3⁺CD8⁺、CD3⁺CD56⁺及CD4⁺/CD8⁺比值均明显升高，而调节性T细胞则明显降低(P<0.05)。

表2(Table 2)

表 2 DC-CIK治疗后外周血淋巴细胞亚群的变化 n=85,x±s 时间 CD3+(%) CD3+CD4+(%) CD3+CD8+(%) CD3+CD56+(%) CD4+/CD8+ Treg(%) 治疗前 61.89±16.51 33.15±11.84 31.52±12.93 2.56±2.21 1.13±0.84 7.36±5.10 治疗后 67.06±14.89* 36.72±12.83* 34.97±13.54* 5.10±5.43* 1.78±0.76* 4.92±3.84* *P<0.05与治疗前比较

表 2 DC-CIK治疗后外周血淋巴细胞亚群的变化

不良反应一般发生于回输后1～2 h，以发热为主，其中低热(≤38.0℃)22例，未经任何处理体温自行恢复正常；中度热(38.0～39.0℃)8例，其中3例未经特殊处理体温自行恢复，另外5例使用解热镇痛药后体温降至正常；高热(≥39.0℃) 5例，持续时间在2～8 h，行血常规、C反应蛋白等检测无明显异常改变，使用解热镇痛药后体温降至正常。85例患者中，有2例在细胞治疗2 h后出现血压轻度升高(≤160/110 mmHg,1 mmHg=0.133 kPa)，经硝苯地平舌下含化后降至正常，无头晕、恶心、呕吐等伴随症状。有26例患者经观察后无任何不良反应。

至随访结束，共有58例患者死亡，2例失访，25例存活，中位生存期为16.5个月(95% CI： 12.1～20.9个月，图 2)。

图 2 胆系肿瘤患者DC-CIK治疗后生存曲线

胆系肿瘤的发病原因尚不明确，可能与胆道结石有一定关系^[5]，发病率逐年增长，目前暂无有效的治疗方法。自Valle等^[3]报道吉西他滨联合顺铂一线化疗取得较好的结果后，该方案已作为一线治疗被广泛应用，但多数晚期患者不能耐受，同时化疗有可能打破肿瘤与机体间的动态免疫平衡，使肿瘤细胞进一步增殖及播散^[6]。随着分子生物学和免疫学的快速发展，肿瘤生物治疗近年来日益受到重视，已成为与手术、放疗及化疗并列的肿瘤第四大治疗模式^[6]。其中过继性细胞免疫治疗以其突出的临床安全性以及能与手术、放疗和化疗有效地结合，显示出良好的临床应用前景^[7]。

DC是目前发现的最有效的抗原递呈细胞，它可以激发T细胞应答，参与主动免疫与被动免疫反应，有效抵制肿瘤细胞的免疫逃逸机制^[8]。CIK是一群经细胞因子激活和培养后获得的异质细胞，其主要效应细胞的表面标志为CD3⁺CD56⁺，对肿瘤细胞的杀伤作用具有高效性和非主要组织相容性复合体(MHC)限制性的特点，是一类杀瘤活性强和抗瘤谱广的新型抗肿瘤效应细胞。CIK扩增速度快，体外制备相对容易，有效成分相对稳定，且同时可增强肿瘤患者的免疫功能^[9]。将DC与CIK共培养后产生的细胞群体比同源CIK细胞具有更强的增殖活性，且两者能相互调节而增加细胞因子释放和增强细胞毒性，提高CIK细胞的杀伤活性，同时也能提高DC的功能^[10]。

本研究结果发现，DC疫苗联合自体CIK细胞回输可明显改善患者生活质量，包括减轻癌痛、乏力、纳差、恶心、呕吐等症状。同时，可延缓肿瘤进展，减慢肿瘤生长速度，即使在停止细胞免疫治疗后，仍可获得持续的作用。本研究中CR的例数不多，考虑可能与入组患者临床分期绝大多数较晚、肿瘤负荷过大有关，但PR、SD例数较多，且中位生存时间为16.5个月，较以往研究^[3]明显延长。研究结果提示，免疫细胞治疗对绝大多数患者可起到延缓及稳定肿瘤生长、延长生存期的作用。本研究中经过治疗的患者T细胞亚群中的效应细胞比例及CD4⁺/CD8⁺比值均较治疗前明显上升，差异有统计学意义(P<0.05)。结果说明细胞治疗可提高患者免疫功能，同时Treg比例较治疗前降低(P<0.05)，而Treg细胞介导的是抗肿瘤免疫耐受，促进肿瘤生长，Treg的降低提示对肿瘤的预后有明显改善。细胞治疗的不良反应主要为低热，且症状轻微，大多可自行缓解，说明细胞治疗安全可靠。

综上所述，DC疫苗联合CIK细胞回输在晚期胆系肿瘤的治疗中有很大的潜力，是一种疗效满意、临床安全性好、可接受性强的治疗方法，但仍需大样本的随机对照试验来进一步观察其远期疗效。