丹红注射液由丹参和红花组成，是拥有自主知识产权的中药复方制剂^{[1, 2]}，具有活血化瘀、通脉舒络功效，用于瘀血闭阻所致的冠心病、心绞痛、心肌梗死等疾病^{[3, 4, 5, 6]}。丹参素(DSS)、原儿茶酸(PA)是丹参的主要酚酸类成分，具有保护缺血心肌、改善缺血再灌注损伤、抗炎等作用^{[7, 8]}，红花的主要有效成分羟基红花黄色素A(HSYA)可抑制血小板激活因子诱发的血小板聚集与释放，竞争性抑制血小板激活因子与血小板受体的结合^{[9, 10]}。它们都是丹红注射液中的主要药效成分。

由于复方制剂组成复杂、成分多样等特点，近年来关于DSS、PA和HSYA的单一成分或配伍在不同方剂中的含量测定^{[11, 12]}以及在大鼠体内的药代动力学已有报道^{[13, 14, 15, 16, 17]}，但同时对丹红注射液中这3种成分在寒凝血瘀证中的药代动力学研究未见报道。本研究采用HPLC法探讨丹红注射液中这3种主要成分在正常大鼠和寒凝血瘀大鼠中的药代动力学特征，为临床合理用药提供实验依据。 1 材料 1.1 仪器

Agilent 1100 series高效液相色谱-DAD检测器系统(安捷伦科技有限公司，美国)；Agilent TC-C₁₈色谱柱(安捷伦科技有限公司，美国)；TGL-16G高速离心机(上海安亭科学仪器公司)；KQ5200DE型数控超声波清洗仪(昆山市超声仪器有限公司)；XS105 Dual Range 十万分之一天平(瑞士METTLER-TOLEDO公司)。 1.2 药品及试剂

丹红注射液(菏泽步长制药有限公司，批号：100627)；丹参素、原儿茶酸及羟基红花黄色素A标准品(中国食品药品检定研究院，批号分别为：110855-200506，101800-200205，111637-200905)；色谱纯甲醇(美国Fisher公司)；肝素钠注射液(河北常山生化药业有限公司，批号：100109)；自制超纯蒸馏水；其他试剂均为分析纯。 1.3 实验动物

SPF级雄性SD大鼠，购自西安交通大学实验动物中心，合格证号：陕医动证字2006105，5个月龄，体质量200～230 g。 2 方法和结果 2.1 标准品的配制

分别精密称取DSS、PA、HSYA标准品各15.00 mg，用甲醇在5 mL避光容量瓶中定容，配成质量浓度为3.00 mg/mL的混合对照品母液，－20℃冷冻备用。 2.2 模型的建立

大鼠放入0℃的冰水中刺激5 min，每天2次，持续20 d，建立寒凝血瘀证模型^[18]，并检测血液流变学相关指标，如表 1所示，与正常组对比各指标差异均有统计学意义，表明模型制作成功。

表 1 (Table 1)

表 1 寒凝血瘀大鼠血液流变学指标 Tab 1 Blood rheology indices of cold-coagulation and blood-stasis rats n=10,x±s Group Blood viscosity η/(mPa·s ) Plasma viscosity η/(mPa·s) Red blood cell specific volume Normal group 9.15±1.72 1.32±0.12 0.52±0.02 Model group 11.53±1.98* 1.48±0.14* 0.55±0.03* *P<0.05 vs normal group

表 1 寒凝血瘀大鼠血液流变学指标 Tab 1 Blood rheology indices of cold-coagulation and blood-stasis rats

取正常和造模成功的SD大鼠各6只，分别为正常组和模型组。禁食12 h，自由饮水，各组均按10 mL/kg的剂量单次尾静脉注射丹红注射液，给药后分别于2、5、10、15、20、25、30、40、50、60、90 min眼底静脉丛取血0.3 mL，置于肝素化离心管中，4 568×g离心10 min，分离血浆，于－20℃冻存。每次取血后补充等量的生理盐水。 2.4 血样处理方法

取2.3项下血浆100 μL，加入3倍量乙腈沉淀蛋白，涡旋1 min后，8 121 ×g离心10 min，取出上清液，沉淀反复处理3次，合并上清液，氮气吹干，残渣用100 μL甲醇水(甲醇∶0.2%甲酸水=20∶80)超声溶解，用0.45 μm有机滤膜过滤，于24 h内进样分析。 2.5 色谱条件

Agilent TC-C₁₈色谱柱(4.6 mm×250 mm，5 μm)；流动相：0.2 %甲酸水(A)-甲醇(B)组成，梯度洗脱(0~18 min，8%B→13%B；18~38 min，13% B→22%B；38~60 min，22%B→60%B)；检测波长：280 nm(0~40 min)，402 nm(40~60 min)；柱温：25℃；流速：0.6 mL/min；进样量：20 μL。 2.6 数据处理

运用SPSS 2.0软件和t检验对实验结果进行统计分析，所得数据均以x±s表示，药代动力学参数用DAS 3.0 软件处理分析。 2.7 方法学考察

分别将空白血浆、空白血浆加对照品以及给药后血浆样品进样20 μL，在2.5项色谱条件下检测，色谱图如图 1所示。结果显示，血浆中的内源性物质与DSS、PA和HSYA分离良好，无干扰，且基线较平稳，噪音小。

图 1 血浆样品的色谱图 Fig 1 HPLC chromatograms of plasma samples A：Blank plasma; B:Blank plasma spiked with standard; C: Plasma sample after injection of Danhong Injection. 1: Danshensu (DSS); 2: Protocatechuic acid (PA); 3: Hydroxysafflor yellow A (HSYA)

DSS、PA及HSYA的检测限分别为0.07、0.35、0.10 mg/L(S/N=3)，定量限分别为0.17、0.89、0.19 mg/L(S/N=10)。 2.7.2 线性关系

用一定量的空白血浆将DSS、PA和HSYA的混合对照品溶液稀释成浓度分别为1.00、2.00、5.00、25.00、125.00、375.00、750.00 mg/L的系列空白血浆加对照品溶液，在2.5项色谱条件下进样分析，分别以浓度(X，mg/L)为横坐标，以峰面积(Y)为纵坐标，采取加权(W=1/X²)最小二乘法计算回归曲线^[19]，得到DSS、PA和HSYA的线性方程(n=6)分别为：Y=2.38X+20.40，r=0.999 2；Y=17.46X+37.87，r=0.999 8；Y=10.32X+35.91，r=0.999 0。这表明3种成分在1.00~750.00 mg/L范围内具有良好的线性关系。 2.7.3 回收率和精密度

在标准曲线范围内选择高、中、低 3 个浓度，以空白血浆配制成混合对照品的相应血浆样品，每个浓度5份；同时配制相同浓度以流动相为基质的对照品溶液。标准血浆样品在经考察的样品稳定期内，按照2.4项下方法处理后进样测定，对照品溶液直接进样分析。对照品血浆测定值和对照品溶液测定值之比为提取回收率，结果见表 2。将上述 3 个浓度的样品在 1 d 内不同时间重复测定5次和 5 d 内每天测定1次，分别计算日内、日间精密度，结果见表 2。

表 2 (Table 2)

表 2 DSS、PA及HSYA回收率和精密度结果 Tab 2 Recoveries and precisions of DSS，PA and HSYA in plasma Compound Concentration ρB/(mg·L-1) Recovery (%，n=5，x±s) Precision (RSD，%) Intra-day Inter-day DSS 375.00 92.05±3.40 1.31 2.89 25.00 82.85±4.21 0.97 2.19 2.00 83.70±2.32 0.79 2.36 PA 375.00 88.99±3.65 0.32 2.01 25.00 84.01±1.53 1.88 2.99 2.00 77.98±1.24 0.98 2.82 HSYA 375.00 87.45±1.37 0.76 2.43 25.00 79.50±2.70 0.34 2.16 2.00 85.06±4.14 1.25 3.79 DSS:Danshensu; PA: Protocatechuic acid; HSYA: Hydroxysafflor yellow A

表 2 DSS、PA及HSYA回收率和精密度结果 Tab 2 Recoveries and precisions of DSS，PA and HSYA in plasma

精密吸取100 μL空白血浆，加入DSS、PA及HSYA混合标准品适量，将样品置于室温0、4、8、12、18、24 h后分别进样分析，观察温度对样品的影响。结果表明，DSS、PA及HSYA的短期稳定性RSD分别为1.90%、2.67%和2.43%，表明在血样中这3种物质在24 h内基本稳定。 2.8.2 长期稳定性

给空白血浆添加适量DSS、PA及HSYA混合标准品，置于-20℃冷冻保存，分别于冻存1、2、4、8周后取出，置于室温下解冻，按2.4项血样制备方法处理后，在2.5项色谱条件下进样分析。结果表明，DSS、PA及HSYA的长期稳定性RSD分别为5.39%、4.13%和6.01%，表明在血样中这3种物质长期稳定性良好。 2.8.3 冻融稳定性

将-20℃条件下冷冻24 h的空白血浆加混合标准品取出，于室温下解冻，在2.5项色谱条件下进样分析。完全解冻后样品再次冷冻24 h，重复6次。结果表明，DSS、PA及HSYA的冻融稳定性RSD分别为2.19%、2.94%、3.40%，表明在血样中这3种物质的冻融稳定性良好。 2.9 药代动力学结果

处理后的血浆样品在拟定色谱条件下，进样20 μL，记录峰面积，计算其中DSS、PA及HSYA的含量。药-时曲线见图 2，药代动力学参数见表 3～表 5。

图 2 DSS、PA和HSYA在正常和模型大鼠体内的药-时曲线 Fig 2 Concentration-time curves of DSS,PA,and HSYA in normal and cold-coagulation and blood-stasis model rats A：Danshensu (DSS); B: Protocatechuic acid (PA); C: Hydroxysafflor yellow A (HSYA). n=6，x±s

药代动力学参数显示，与正常组相比，在寒凝血瘀大鼠体内DSS的分布半衰期t_1/2α(P<0.05)、总清除率CL(P<0.05)和达峰浓度C_max(P<0.01)均增大，而药时曲线下面积AUC降低(P<0.01)；PA的分布半衰期t_1/2α降低(P<0.01)，而消除半衰期t_1/2β(P<0.05)、总表观分布容积V(P<0.01)、中央室分布容积V₁(P<0.01)、药时曲线下面积AUC(P<0.01)和达峰浓度C_max(P<0.01)均增大；HSYA的分布半衰期t_1/2α和t_1/2β降低(P<0.01)，而消除半衰期t_1/2γ(P<0.05)、药时曲线下面积AUC (P<0.01)、总表观分布容积V(P<0.01)、中央室分布容积V₁(P<0.05)和达峰浓度C_max(P<0.05)均增大，其他相关参数差异无统计学意义。

表 3 (Table 3)

表 3 DSS在正常和模型大鼠体内的药代动力学参数拟合结果 Tab 3 Pharmacokinetic parameters of DSS in normal and cold-coagulation and blood-stasis model rats n=6,x±s Pharmacokinetic parameter Normal group Model group t1/2α t/min 2.387±0.626 3.151±0.562* t1/2β t/min 27.653±5.815 26.052±3.201 AUC0~t (mg·min·L-1) 7 965.326±25.376 6 723.233±19.975** AUC0~∞ (mg·min·L-1) 8 942.673±30.732 8 326.355±24.532** CL(L·min-1·kg-1) 0.006±0.002 0.008±0.001* V(L·kg-1) 0.086±0.001 0.088±0.003 V1(L·kg-1) 0.038±0.003 0.034±0.005 Cmax ρB/(mg·L-1) 413.552±18.201 532.211±25.501** Tmax t/min 2.000±0.000 2.000±0.000 *P<0.05,** P<0.01 vs normal group

表 3 DSS在正常和模型大鼠体内的药代动力学参数拟合结果 Tab 3 Pharmacokinetic parameters of DSS in normal and cold-coagulation and blood-stasis model rats

表 4 (Table 4)

表 4 PA在正常和模型大鼠体内的药代动力学参数拟合结果 Tab 4 Pharmacokinetic parameters of PA in normal and cold-coagulation and blood-stasis model rats n=6,x±s Pharmacokinetic parameter Normal group Model group t1/2α t/min 12.142±2.101 5.881±1.974** t1/2β t/min 27.252±2.842 32.201±5.082* AUC0~t (mg·min·L-1) 387.019±18.501 421.661±16.162** AUC0~∞ (mg·min·L-1) 466.847±21.092 501.121±20.693** CL(L·min-1·kg-1) 0.002±0.001 0.002±0.001 V(L·kg-1) 0.014±0.001 0.017±0.002** V1(L·kg-1) 0.005±0.002 0.010±0.003** Cmax ρB/(mg·L-1) 16.053±2.244 25.902±6.613** Tmax t/min 2.000±0.000 2.000±0.000 *P<0.05,**P<0.01 vs normal group

表 4 PA在正常和模型大鼠体内的药代动力学参数拟合结果 Tab 4 Pharmacokinetic parameters of PA in normal and cold-coagulation and blood-stasis model rats

表 5 (Table 5)

表 5 HSYA在正常和模型大鼠体内的药代动力学参数拟合结果 Tab 5 Pharmacokinetic parameters of HSYA in normal and cold-coagulation and blood-stasis model rats n=6,x±s Pharmacokinetic parameters Normal group Model group t1/2α t/min 9.602±2.543 2.292±0.211** t1/2β t/min 76.592±5.176 58.384±4.683** t1/2γ t/min 89.324±2.501 94.116±4.345* AUC0~t (mg·min·L-1) 362.322±15.271 389.642±11.334** AUC0~∞ (mg·min·L-1) 3 076.865±38.057 3 896.234±29.993** CL(L·min-1·kg-1) 0.002±0.001 0.002±0.001 V(L·kg-1) 0.035±0.006 0.045±0.004** V1(L·kg-1) 0.009±0.003 0.013±0.003* Cmax ρB/(mg·L-1) 4.527±0.213 5.903±1.442* Tmax t/min 2.000±0.000 2.000±0.000 *P<0.05,**P<0.01 vs normal group

表 5 HSYA在正常和模型大鼠体内的药代动力学参数拟合结果 Tab 5 Pharmacokinetic parameters of HSYA in normal and cold-coagulation and blood-stasis model rats

本研究对DSS、PA及HSYA的色谱条件进行了优化。考察了等度和梯度洗脱两种方式以及不同配比乙腈-水、甲醇-水、乙腈-0.2%甲酸水、甲醇-0.2%甲酸水等系统，由于DSS和PA的结构相似，且极性相近，等度洗脱很难将两者分开且无法排除内源性物质的干扰，故最终采用甲醇-0.2%甲酸水作为梯度洗脱系统。又因经全波长扫描后发现DSS和PA与HSYA的最大紫外吸收差别很大，最终DSS和PA选择最大吸收波长280 nm，HSYA选择402 nm，保证了检测灵敏度。在此条件下，该3种成分与血浆中的内源性物质和代谢产物实现良好的分离，基线平稳，目标色谱峰对称性良好。

药动学结果显示，DSS和PA在大鼠体内药动学过程均符合二室开放模型，这与文献报道结果一致^[15]。而HSYA呈三室模型，与文献^[20]报道的二室模型不一致，这可能是由于丹红注射液中其他成分的影响所致。DSS具有抗血栓形成、抗血小板聚集、降低血液黏稠度等活血化瘀作用^[21]。寒凝血瘀模型大鼠DSS的t_1/2α、C_max和CL均增大，而AUC降低。这说明在寒凝血瘀病理模型下DSS在大鼠体内分布减慢，生物利用度降低，可能是由于在该血瘀模型下血液黏度增加，DSS主要作用于血液，影响了向其他组织的分布；又因清除速度加快，因而降低了生物利用度。PA具有降低心肌耗氧量、提高心肌耐氧能力、减慢心率等药理作用^[22]。HSYA作为丹红注射液中主要指标性成分，具有活血化瘀作用，在寒凝血瘀模型大鼠中，PA和HSYA的分布半衰期t_1/2α(t_1/2α，t_1/2β)降低，而t_1/2β(t_1/2γ)、V、V₁和AUC均增大，提示可能由于寒凝血瘀病理环境的影响，使这2种成分在体内分布加快，消除减慢，表观分布容积增加，药物在体内分布广泛，所以生物利用度增加，能更有效地发挥药理作用。

与正常组相比，模型组血液中3种酚酸成分的达峰浓度C_max都增加，说明在寒凝血瘀病理模型下，由于血液流动变慢，在静脉给药后首个取血点时药物进入其他组织的浓度降低。此外，发现不管在正常还是模型大鼠中，DSS的清除率都大于PA和HSYA，说明DSS的排出速率大于PA和HSYA，这可能与DSS的化学性质有关。