第二军医大学  2015, Vol. 36 Issue (7): 722-726   PDF    
引用本文
李群益, 陈莉, 张留弟, 王轶, 钟明康, 施孝金. 人参皂苷代谢产物CompoundK抑制TNF-α诱导的人支气管上皮细胞分泌RANTES[J]. 第二军医大学学报, 2015, 35(7): 722-726  
LI Qun-yi, CHEN Li, ZHANG Liu-di, WANG Yi, ZHONG Ming-kang, SHI Xiao-jin. Ginsenoside metabolite Compound K inhibits TNF-α-induced RANTES secretion in human bronchial epithelial cell line[J]. Academic Journal of Second Military Medical University, 2015, 35(7): 722-726 (in Chinese with English abstract)  
人参皂苷代谢产物CompoundK抑制TNF-α诱导的人支气管上皮细胞分泌RANTES
李群益1,2, 陈莉3, 张留弟1,2, 王轶1,2, 钟明康1,2, 施孝金1,2    
1. 复旦大学附属华山医院临床药学室, 上海 200040;
2. 复旦大学附属华山医院北院临床药学室, 上海 201907;
3. 徐汇区中心医院药械科, 上海 200031
收稿日期:2014-12-03     接受日期: 2015-03-23.
基金项目：国家自然科学基金(81302853),教育部博士点基金(20110071120071).
作者简介：李群益,博士,副主任药师. E-mail: qyli1234@163.com; 陈 莉,博士,主管药师. E-mail: mychenli@hotmail.com
通信作者(Corresponding author)：施孝金，xiaojin_shi@hotmail.com
摘要：目的 探讨人参皂苷代谢产物Compound K(CK)对炎症因子TNF-α诱导的人支气管上皮细胞BEAS-2B分泌调节活化正常T细胞表达和分泌趋化因子 (RANTES) 的影响及其机制. 方法 ELISA法测定CK对BEAS-2B细胞上清液中RANTES含量的影响;采用RT-PCR和蛋白质免疫印迹技术检测RANTES mRNA及蛋白的表达情况;采用荧光素酶报告基因系统检测CK对活化蛋白转录因子1(activator protein 1, AP-1)和糖皮质激素受体(glucocorticoid receptor, GR)转录抑制或转录激活的影响;运用GR拮抗剂米非司酮,验证CK对RANTES的抑制效应是否由GR介导. 结果 3~30 μmol/L 的CK抑制了TNF-α诱导的RANTES分泌、mRNA及蛋白水平;CK抑制AP-1的转录激活,在BEAS-2B细胞中激活GR信号通路;并且,CK通过GR抑制了BEAS-2B细胞分泌RANTES. 结论 CK能够抑制炎症因子TNF-α诱导的支气管上皮细胞分泌RANTES,其机制可能与激活GR、抑制AP-1对下游靶基因的调控有关.
关键词： 糖皮质激素受体     人参皂苷类     Compound K     炎症     趋化因子CCL5     细胞因子类     哮喘    
Ginsenoside metabolite Compound K inhibits TNF-α-induced RANTES secretion in human bronchial epithelial cell line
LI Qun-yi1,2, CHEN Li3, ZHANG Liu-di1,2, WANG Yi1,2, ZHONG Ming-kang1,2, SHI Xiao-jin1,2    
1. Clinical Pharmacy Laboratory, Huashan Hospital, Fudan University, Shanghai 200040, China;
2. Clinical Pharmacy Laboratory, Huashan Hospital (North branch), Fudan University, Shanghai 201907, China;
3. Department of Pharmacy and Instrument, Central Hospital of Xuhui District, Shanghai 200031, China
△Co-first authors.
Abstract: Objective To explore the effects of ginsenoside metabolite Compound K (CK) on TNF-α-induced RANTES secretion in human bronchial epithelial cell line BEAS-2B and to elucidate its possible mechanism. Methods BEAS-2B cells were cultured and treated with CK in different dosages, and then the secretion of RANTES in BEAS-2B cells exposed to inflammatory stimuli was measured by ELISA kits. Expressions of RANTES mRNA and protein were detected by RT-PCR and Western blotting analysis, respectively. Reporter gene assay was employed to elucidate the interaction between CK and activator protein 1(AP-1), glucocorticoid receptor (GR). CK antagonist mifepristone was used to observe whether the inhibitory effect of CK against RANTES was mediated by GR. Results TNF-α-induced secretion of RANTES in BEAS-2B was markedly inhibited by CK (3-30 μmol/L). Treatment with CK also reduced RANTES mRNA and protein expression. Reporter gene assays indicated that CK was a GR agonist and could repress TNF-α-induced AP-1 transactivation. The inhibitory effects of CK on RANTES secretion were antagonized by mifepristone, suggesting a pivotal role of GR. Conclusion These results suggest that CK may inhibit TNF-α-induced RANTES secretion in human bronchial epithelial cells, which might be associated with GR pathway activation and AP-1 pathway inhibition.
Key words: glucocorticoid receptors     ginsenosides     Compound K     inflammation     chemokine CCL5     cytokine     asthma    

哮喘是以气道炎性细胞浸润、气道高反应性及气道重塑为主要特征的一种慢性炎症性疾病[1]。嗜酸粒细胞和T淋巴细胞在气道黏膜的浸润是哮喘最重要的组织病理学特征。调节活化正常T 细胞表达和分泌的趋化因子(regulated upon activation normal T cell expressed and secreted factor,RANTES)是趋化性细胞因子CC亚家族成员(CCL5)[2]。在炎性因子IL-1β或TNF-α的刺激下，气道组织可释放RANTES，对嗜酸性粒细胞和T淋巴细胞具有正向趋化作用，因而RANTES在哮喘中的作用引起了越来越多的关注[3]。近来研究表明，RANTES基因多态性是临床哮喘发生的危险因子之一[4]。

目前临床上治疗哮喘的药物主要包括β2受体激动剂和糖皮质激素。β2受体激动剂容易引发心血管不良反应，长期应用糖皮质激素可导致糖尿病、继发感染及骨质疏松等[5]。临床上迫切需要疗效确定、不良反应小的抗哮喘药物。人参(Panax ginseng C．A．Meyer)是五加科多年生草本植物，最近的研究证实，人参及其提取物能有效改善哮喘实验动物模型的症状，抑制炎症反应[6, 7, 8, 9, 10]。人参皂苷作为人参主要的药效成分，是其治疗哮喘的活性物质基础[9, 10]。其中，人参皂苷Compound K(CK)对炎症及免疫应答的调控作用成为研究热点[11]。CK属二醇型皂苷，它在天然的人参中几乎并不存在，主要来自其他二醇型人参皂苷在人肠道内的代谢产物[11]。Yang等[12, 13]运用糖皮质激素受体(GR)-配体竞争性结合实验以及GR转录激活实验发现，CK具有较强的GR结合活性和转录激活活性，可调节多种炎症因子的表达。因此，我们推测CK可能是人参治疗哮喘的主要活性成分之一。

本研究着重考察CK对炎症因子诱导人支气管上皮细胞BEAS-2B表达和分泌RANTES的影响，然后检测其对活化蛋白转录因子1(AP-1)和GR信号通路的影响，最后验证CK是否通过GR发挥其抑制RANTES分泌的效应，为后续研究奠定基础。 1 材料和方法 1.1 材料

人支气管上皮细胞株BEAS-2B购自ATCC。人参皂苷CK(纯度>97％)购自上海同田生物技术股份有限公司；DMEM、F12及胎牛血清(FBS)购自Gibco公司；Lipofectamine 2000、TNF-α及TRIzol试剂购自Invitrogen公司；Human RANTES ELISA Kit购自R&D Systems公司；pAP-1-Luc质粒及pGRE-Luc质粒来自Stratagene公司；RANTES抗体及β-actin抗体购自Santa Cruz公司；CCK-8 试剂盒购自上海碧云天生物技术有限公司；地塞米松(Dex)、米非司酮及二甲亚砜(DMSO)购自Sigma-Aldrich公司；Oligo (dT) Primer、M-MLV反转录酶、dNTP及Steady-Glo® Luciferase Assay system购自Promega公司；引物由生工生物工程(上海)股份有限公司合成。 1.2 人支气管细胞BEAS-2B的培养

将BEAS-2B细胞种于含有5％FBS、105 IU/L青霉素、105 IU/L链霉素的DMEM/F12培养液中，于37℃、5％CO2的培养箱中培养。BEAS-2B细胞生长到80%～90％融合后，培养液换成不含FBS的DMEM/F12，饥饿24 h。加入TNF-α(终浓度25 ng/mL)1 h，向细胞中添加Dex、CK和(或)米非司酮，继续培养24 h。 1.3 RANTES酶联免疫检测

收集BEAS-2B细胞上清液，按照RANTES ELISA Kit说明书进行测定。最后反应体系中加入终止液(H2SO4 3.6 mol/L)，生成的产物用9602酶标仪(北京普朗仪器)在450 nm及490 nm分别读取光密度(D)值，根据标准曲线计算培养液中RANTES的含量(pg/mL)。 1.4 BEAS-2B细胞增殖测试

取BEAS-2B以细胞密度5×103/孔接种至96 孔板中,5% FBS 培养贴壁后换成含0.1% FBS 的DMEM/F12 培养液 (每孔100 μL) 培养24 h；弃去原培养液,换为100 μL含不同浓度CK的5% FBS DMEM/F12培养液干预24 h后,每孔加入CCK-8 试剂10 μL,置于37℃培养箱中孵育2 h；以酶标检测仪在单波长450 nm 处检测D450值。 1.5 RNA抽提、反转录及PCR反应

BEAS-2B细胞处理同1.2项下步骤，使用TRIzol试剂抽提细胞内的总RNA，在260 nm波长下用B-600紫外分光光度计测定其RNA含量，按照M-MLV反转录酶说明书进行反转录反应，以cDNA为模板进行PCR扩增。以β-actin为对照，PCR引物序列参考文献[14]，RANTES： 5′-CGC TGT CAT CCT CAT TGC TA-3′(forward)，5′-CAC ACA CTT GGC GGT TCT T-3′(reverse)；β-actin：5′-GAC TAC CTC ATG AAG ATC-3′(forward)，5′-GAT CCA CAT CTG CTG GAA-3′(reverse)。取10 μL PCR扩增产物，进行1.2%琼脂糖凝胶电泳分析，紫外线透射下拍照。 1.6 蛋白免疫印迹

用预冷PBS洗涤BEAS-2B细胞，细胞刮刀收集细胞，加入总蛋白抽提液，置冰上使其完全裂解。将细胞裂解液转入1.5 mL EP管中，在4℃10 000×g条件下离心20 min，吸取上清，煮沸5 min后冻存于－80℃备用。在280 nm波长处用B-600紫外分光光度计测定标准和样本蛋白的D值，根据标准曲线计算相应的各样品蛋白浓度。采用SDS-聚丙烯酰胺凝胶进行蛋白质电泳，依次进行半干法转膜，5％脱脂奶粉封闭，与各自的一抗和二抗孵育，最后使用显影定影试剂盒(碧云天)进行显影定影。 1.7 荧光素酶报告基因的测定

接种BEAS-2B细胞于6 cm细胞培养皿，6×105/皿，培养液为含5% 活性炭/葡萄糖处理的 FBS (CDT-FBS)的DMEM/F12。37℃，5%CO2继续培养24 h。用Lipofectamine 2000 将pAP-1-Luc质粒或pGRE-Luc质粒(2 μg/皿)转染入BEAS-2B。转染8 h后，细胞消化计数后以每孔8 000个细胞均匀接种至96孔培养板。加入用DMSO配制的化合物进行孵育(DMSO％＜0.5％)，培养24 h后，用Steady-Glo® Luciferase Assay system测定细胞中的荧光素酶活性。 1.8 统计学处理

实验数据应用GraphPad Prism 5.0软件进行曲线拟合与统计学分析，结果以x±s表示。多组间比较用One-way ANOVA，两组比较则采用双侧t检验，检验水准(α)为 0.05。 2 结 果 2.1 人参皂苷CK对TNF-α诱导的BEAS-2B细胞分泌RANTES的影响

25 ng/mL的TNF-α诱导BEAS-2B细胞分泌RANTES，从基础状态的(245.2± 21.7) pg/mL上升至(1 449.5 ± 56.3) pg/mL，增加了491.1%。经典糖皮质激素Dex在0.1 μmol/L浓度时抑制了RANTES的分泌，抑制率达到94.5％(P<0.001)，与文献[14, 15]报道近似。CK剂量依赖性地抑制RANTES的分泌，3 μmol/L时CK对RANTES的抑制率达36.1％(P<0.01)；10 μmol/L时CK对RANTES的抑制率达40.3％(P<0.01)；30 μmol/L时CK对RANTES的抑制率达86.0％(P<0.001)。CCK-8实验显示，在高浓度(30 μmol/L)时CK对BEAS-2B细胞具有一定的增殖抑制效应，抑制率为21.2％(P<0.05)；而在10 μmol/L及以下浓度时CK对BEAS-2B细胞没有增殖抑制效应。这些结果表明，CK对BEAS-2B中RANTES分泌抑制并不是由细胞增殖抑制引起的。

10、30 μmol/L人参皂苷CK 对BEAS-2B细胞中RANTES分泌有较显著的抑制作用。因此，在后续的实验中人参皂苷CK的剂量为10、30 μmol/L。 2.2 人参皂苷CK对TNF-α诱导的BEAS-2B细胞RANTES的mRNA及蛋白表达的影响

RT-PCR结果显示，10、30 μmol/L人参皂苷CK组RANTES mRNA表达量低于TNF-α组(图 1A)。蛋白质印迹实验也显示，10、30 μmol/L人参皂苷CK抑制BEAS-2B细胞内RANTES蛋白水平(图 1B)。这些结果表明，人参皂苷CK对RANTES mRNA转录水平有抑制效应，进而导致细胞内RANTES蛋白翻译下降。

图 1 人参皂苷CK对TNF-α诱导的BEAS-2B细胞RANTES的mRNA及蛋白表达的影响 Fig 1 Effects of ginsenoside Compound K on RANTES mRNA and protein expression in TNF-α-treated BEAS-2B cells CK： Compound K; Dex: Dexamethasone. BEAS-2B cells were treated with CK or Dex for 24 h after TNF-α (25 ng/mL) stimulation for 1 h. The mRNA (A) and protein (B) levels of RANTES were detected by RT-PCR and Western blotting analysis,respectively. 1: Control; 2: TNF-α (25 ng/mL) induction; 3: TNF-α plus 10 μmol/L CK; 4: TNF-α plus 30 μmol/L CK; 5: TNF-α plus 0.1 μmol/L Dex
2.3 人参皂苷CK对AP-1信号通路的影响

应用基因瞬时转染技术，将pAP-1-Luc导入BEAS-2B细胞，结果发现10 μmol/L和30 μmol/L人参皂苷CK对AP-1的活化有抑制效应，10 μmol/L时抑制率为30.0％(P<0.05)，30 μmol/L时抑制率达到了50.4％(P<0.001)，推测CK可能通过抑制AP-1进而下调RANTES表达。 2.4 人参皂苷CK对GR转录激活的影响

结果表明，10 μmol/L和30 μmol/L人参皂苷CK可以诱导BEAS-2B细胞内GR的活化，尽管其GR激活效应低于Dex，CK在10 μmol/L时激活效应上升了472.5％(P<0.05)，在30 μmol/L时激活效应上升了705％(P<0.01)。 2.5 GR在人参皂苷CK抑制BEAS-2B细胞分泌RANTES中的作用

结果(图 2)表明，在没有米非司酮存在的情况下，CK有效地抑制RANTES的分泌(P<0.01)；在米非司酮存在的情况下，CK对RANTES的分泌抑制被翻转，表明人参皂苷CK通过激活GR抑制了BEAS-2B细胞中RANTES的分泌。

图 2 GR在人参皂苷CK抑制BEAS-2B细胞分泌RANTES中的作用 Fig 2 Role of GR in ginsenoside Compound K (CK) inhibiting RANTES secretion in TNF-α-treated BEAS-2B cells The concentration of RANTES in BEAS-2B supernatant was determined by ELISA method. TNF-α (25 ng/mL); Dex (0.1 μmol/L); CK (10 μmol/L); Mifepristone (1 μmol/L). **P<0.01 vs TNF-α induction. n=3,x±s
3 讨 论

哮喘患者的气道经常出现上皮损伤的现象[16]。嗜酸性粒细胞是哮喘气道炎症反应中的主要效应细胞。在变态反应性炎症部位，募集的嗜酸性粒细胞及其他效应细胞释放多种炎症因子、毒性蛋白及脂质介质，导致气道局部的组织结构发生病变和损伤[16]。

研究表明，在以嗜酸性粒细胞富集为特征的炎症性疾病中，支气管上皮细胞可分泌RANTES[15]。RANTES对多种变态反应性炎症细胞如CD45RO+记忆T淋巴细胞、嗜酸性粒细胞及肥大细胞均具有强力及选择性的趋化效应，能募集嗜酸性粒细胞等迁移至气道管腔黏膜部位，扩大炎症反应。并且，RANTES通过诱导炎症部位募集嗜酸性粒细胞等来激活2型辅助性T淋巴细胞[17]。荟萃分析表明，RANTES基因多态性与哮喘发作有密切的关联[4]。因此，抑制RANTES的表达、阻断嗜酸粒细胞的生成及活化可能成为治疗哮喘的一种途径。

人参皂苷CK作为多种原人参二醇型皂苷(Rb1、Rb2、Rc)的体内代谢产物，是体内吸收和发挥药效的真正实体分子[18]。CK在多种体内和体外实验模型中表现出良好的抗炎活性[19, 20]，我们推测CK或许是人参及其提取物治疗哮喘的活性成分之一。本实验结果显示，在支气管上皮细胞中，CK剂量依赖性地抑制TNF-α诱导的RANTES分泌。并且，RANTES mRNA转录被CK有效抑制，表明CK至少部分在转录水平上调节RANTES的表达。

研究表明，RANTES基因5′侧翼区存在一系列转录调节因子的潜在结合位点，如AP-1等[21, 22]。作为一类重要的转录调节因子，AP-1在炎症反应中介导多种细胞因子的表达。AP-1由2个分别属于Jun家族和Fos家族的蛋白通过亮氨酸拉链形成同源或异源二聚体。炎症细胞因子(如TNF-α)通过JNK磷酸化c-Jun，促使Jun家族和Fos家族形成活性二聚体。活化的AP-1与靶基因启动子区域的AP-1应答元件结合，激活目标基因的转录[23]。我们的结果提示，CK可抑制AP-1对其应答元件的结合，进而抑制下游靶基因RANTES的转录。

GR通过与AP-1的c-Jun亚单位之间以直接的蛋白-蛋白相互作用方式，阻止AP-1与其应答元件的结合，从而阻断AP-1的信号转导[23]。GRE驱动的荧光素酶报告基因结果表明，在支气管上皮细胞中，CK展现出GR激动剂的特质，在10 μmol/L和30 μmol/L浓度时，GR转录激活活性分别提高了4.7倍和7.1倍。我们推断，人参皂苷CK结合并激活BEAS-2B细胞内GR，活化的GR以蛋白-蛋白的相互作用方式抑制AP-1的活性，效应之一是抑制了BEAS-2B细胞分泌RANTES。于是，我们应用GR拮抗剂米非司酮检验这一假设。本实验运用GR强效类固醇类拮抗剂米非司酮，揭示CK对BEAS-2B细胞中RANTES的分泌抑制是由GR介导的。这可能是人参及其提取物抑制哮喘、改善炎症的机制之一。当然，CK对哮喘病理进程中重要的其他炎症致病因子，如eotaxin、粒-巨噬细胞集落刺激因子 (GM-CSF)等的效应，将是下一步研究的目标。

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