胆管闭锁是新生儿阻塞性黄疸最常见的原因之一，以肝内外胆管闭锁和梗阻性黄疸为特点，Kasai手术是其一线治疗方法，但最终仍有70%成功应用Kasai手术治疗的患儿发展为肝硬化，需要接受肝移植治疗^{[1, 2]}。胆管闭锁发病机制至今未明，研究多认为与肝内炎症反应，尤其是激活的CD4⁺细胞Th1亚型及其分泌的细胞因子介导的特异性炎症有关^{[3, 4, 5]}，有研究认为CD4⁺细胞Th2亚型所分泌的细胞因子在胆管闭锁的发病过程中也起着重要作用^[6]。先天性胆管扩张也是临床较常见的小儿胆管发育畸形，有报道胆管闭锁和胆管扩张可能具有共同的病因学基础^[7]。白介素-13(IL-13)是一种多功能细胞因子，主要由Ⅱ型T辅助细胞、肥大细胞、嗜碱性细胞和单核巨噬细胞等在活化状态下分泌，对单核细胞、B细胞、树突状细胞及内皮细胞等具有多种生物学效应，可调节免疫应答、炎症反应等^{[8, 9]}。本研究观察了IL-13在胆管闭锁及先天性胆管扩张患儿外周血及肝组织中的表达情况，初步探讨其在先天性胆管疾病发病中的意义。

样本均来自本院2011年至2013年住院病例。胆管闭锁12例，胆管扩张10例。所有胆管闭锁及胆管扩张病例均经手术探查及病理证实。胆管闭锁组男5例，女7例，平均年龄(2.5±0.3)个月，胆管扩张组男5例，女5例，平均年龄(20.2±9.8)个月。所有全血标本均在清晨空腹时抽取，离心10 min，提取血清，－80℃保存。获取肝组织穿刺活检标本后置于4%甲醛溶液或冻存于－80℃。本研究方案经我院伦理委员会批准，胆管闭锁和胆管扩张患儿监护人均签署知情同意书。

IL-13 ELISA试剂盒及单克隆抗体购自美国R&D公司；RNA提取试剂盒购自北京天根有限公司；反转录及荧光定量试剂盒购自日本TaKaRa公司。

采用ELISA法，按照试剂盒说明书进行。于波长450 nm的酶标仪上读取各孔的光密度(D)值，绘制标准曲线，在标准曲线上查找对应的浓度范围。

采用荧光定量RT-PCR法。IL-13和内参对照β-actin引物由生工生物工程(上海)股份有限公司合成。β-actin 引物上游：5′-CAT CTC TTG CTC GAA CTC CA-3′，下游:5′-ATC ATG TTT GPH AAC CTT CAA CA -3′，产物大小为300 bp。IL-13引物上游：5′-CGG TCA TTG CTC TCA CTT GCC TT-3′，下游5′- TTA CCC CTC CCT AAC CCT CCT T-3′，产物大小为500 bp。按照RNA提取试剂盒说明书，提取肝组织内总RNA，并进行RNA样品的检测。按照反转录及荧光定量试剂盒说明书，将提取的RNA反转录转化为cDNA，并进行PCR扩增，采用标准曲线相对定量法进行结果分析。

采用蛋白质印迹法。液氮法提取蛋白，－80℃保存待用。稀释并定量组织蛋白样品，使用时取样品20 μL，行SDS-PAGE，PVDF转膜，脱脂牛奶封闭，依次加入一抗(IL-13鼠抗人单克隆抗体)、二抗及显色剂后，于暗室中显影、定影，凝胶成像系统扫描条带灰度值，β-actin作为内参照，计算蛋白质表达水平。

采用SPSS13.0软件进行统计学分析，计量资料以 x±s 表示，采用t检验对两组间进行比较。检验水准(α)为0.05。

胆管闭锁患儿血清IL-13水平为(154.50±18.23) ng/L，低于胆管扩张患儿[(268.20±19.30) ng/L]，差异有统计学意义(P<0.01)。

胆管闭锁患儿肝组织中IL-13 mRNA及蛋白表达量分别为0.015 0±0.002 1和0.344 6±0.015 0，均低于胆管扩张患儿(0.032 0±0.005 0，0.576 5±0.021 5)，差异均有统计学意义(P<0.05)。蛋白质印迹检测结果见图 1。

图 1 胆管闭锁(A)和先天性胆管扩张(B)患儿肝组织IL-13 的表达(蛋白质印迹法)

肝内炎症反应主要是CD4⁺细胞Th1亚型及其所分泌的细胞因子介导的特异性炎症过程。天然CD4⁺细胞遇到外来抗原后可分化为Th1细胞和Th2细胞，激活的炎症细胞又会各自分泌特异性细胞因子。Th1特征性细胞因子包括IL-2、IFN-γ、TNF-α和IL-12，Th2特征性细胞因子包括IL-4、IL-5和IL-13。

IL-13调控着表面抗原的表达、抗体依赖性细胞毒性、单核细胞形态的改变和细胞因子合成；并诱导单核巨噬细胞的分化，抑制其产生致炎细胞因子和趋化因子(如IL-1β、IL-6、IL-8、TNF-α等)；同时IL-13促进单核巨噬细胞产生IL-1受体拮抗蛋白，参与抑制炎症反应^[9]。

本研究采用ELISA技术检测IL-13在胆管闭锁和胆管扩张患儿外周血中的表达，发现胆管闭锁患儿血清IL-13表达水平[(154.50±18.23) ng/L]明显低于胆管扩张患儿[(268.20±19.30) ng/L]，差异有统计学意义(P<0.01)。 有报道健康体检儿童[0.5～4(2.3±0.9)岁]血清IL-13水平为(77.27±18.16) ng/L^[10]。本组胆管闭锁或胆管扩张患儿血清IL-13水平是健康体检儿童的数倍之多，提示胆管闭锁和胆管扩张患儿较正常儿童免疫应答反应水平增加。进一步采用RT-PCR和蛋白质印迹法检测IL-13在胆管闭锁和胆管扩张患儿肝组织中的表达，发现类似于外周血中的表达趋势，胆管闭锁患儿肝组织中IL-13的表达在基因和蛋白水平均明显低于胆管扩张患儿，差异均有统计学意义(P<0.05)。

免疫应答起因于Th1和Th2作用之间的平衡，是维持正常免疫功能和身体健康的基础。胆管闭锁患儿血清及肝组织中Th2特征性细胞因子IL-13表达水平均低于胆管扩张患儿，提示IL-13在胆管闭锁和胆管扩张这两类先天性胆管疾病发病中有不同的作用和意义。鉴于本研究样本量有限，尚需积累更多资料，进一步进行深入研究。