脑缺血性损伤发病率高，可致死致残或造成脑损伤和功能障碍；其主要表现形式是神经元活性降低、凋亡和死亡^[1]。因此，研究脑缺血性损伤机制及保护药物，对预防缺血性脑血管疾病的发生、发展具有重要意义。PNU-282987是α7烟碱型乙酰胆碱受体(α7nAchR)的激动剂，胆碱能抗炎通路通过迷走神经作用于α7nAchR从而抑制炎症细胞因子的产生和释放，抑制炎症反应。应用PNU-282987可减少神经细胞死亡，降低脑水肿，改善蛛网膜下隙出血(subarachnoid hemorrhage，SAH)的神经功能状态^[2]。本实验利用原代培养的氧糖剥夺 (oxygen-glucose deprivation,OGD) 大脑皮质神经元模型，研究α7nAChR激动剂PNU-282987对氧糖剥夺损伤后大脑皮质神经元的影响及可能机制，以期为脑缺血性损伤的治疗提供新的潜在靶点。 1 材料和方法 1.1 实验动物、药物和试剂

孕15~18 d的SD大鼠由上海西普尔-必凯实验动物有限公司[动物生产许可证号：SCXK (沪) 2013-0016]提供。Neurobasal medium、B27、胎牛血清、胰蛋白酶 (Gibco公司)，PNU-282987、多聚赖氨酸、阿糖胞苷 (Sigma公司)，乳酸脱氢酶 (lactate dehydrogenate,LDH)试剂盒(Promega公司)，AnnexinⅤ-FITC试剂盒(BD公司)，血红素氧化酶(HO-1，ENZO公司)，缺氧诱导因子1α(HIF-1α，Abcam公司)，GAPDH、活性氧(ROS)检测试剂盒(碧云天生物技术研究所)，CCK-8试剂盒 (日本同仁化学研究所)。 1.2 原代大脑皮质神经元的培养

无菌环境下，取孕15~18 d大鼠，分离大脑皮质，将其剪成1 mm³的组织块，用0.125%胰蛋白酶在37℃条件下消化8 min，每间隔2 min轻摇1次。FBS终止消化后，轻轻吹打数次，352×g离心5 min，弃上清。用DMEM吹打混匀，取细胞悬液，用细胞计数板计数。调整细胞密度为每毫升1×10⁶个，接种于预先用0.1 mg/mL多聚赖氨酸溶液包被的96孔培养板或6孔培养板中(96孔板每孔100 μL，6孔板每孔 2 mL)，置于37℃、5% CO₂培养箱孵育。于培养36 h 在培养液中加入阿糖胞苷以抑制神经胶质细胞的增殖。培养7 d后，以微管相关蛋白2 (microtubule-associated protein-2,MAP-2) 单克隆一抗和含绿色荧光的二抗标记神经元，Hoechst 33258标记细胞核进行免疫荧光细胞化学分析。 1.3 大脑皮质神经元氧糖剥夺损伤模型

取原代培养的大脑皮质神经元，随机分为正常对照组 (control)、氧糖剥夺组、PNU-282987组。在氧糖剥夺前24 h，在培养液中加入PNU-282987，使其终浓度为10 μmol/L，更换无糖DMEM培养液，然后将除对照组外的各组细胞同时移至恒温 (37℃) 密闭容器内，连续充以无氧气体 (90% N₂,10% CO₂)，在氧糖剥夺条件下培养12 h后，进行各项实验。 1.4 大脑皮质神经元存活率检测

将原代培养的大鼠大脑皮质神经元接种入96孔板中，每孔接种100 μL，使每孔细胞数为每毫升10⁶个。7 d后，将细胞分为正常对照组 (control)、氧糖剥夺组、PNU-282987组。PNU-282987组加入PNU-282987干预24 h后，以氧糖剥夺损伤神经元，并于损伤后12 h加入CCK-8检测各组细胞活性。每孔加入10 μL CCK-8，置37℃孵箱孵育1 h，酶联免疫检测仪选取490 nm波长，测定光密度值。记录对照组及各实验组的光密度值，计算各组大脑皮质神经元存活率。 1.5 大脑皮质神经元LDH含量检测

将原代培养的大鼠大脑皮质神经元接种入96孔板中，每孔接种100 μL，细胞密度为每毫升10⁶个。分组同前，在氧糖剥夺12 h后，取细胞培养上清测定LDH含量。 1.6 大脑皮质神经元凋亡检测

将原代培养的大鼠大脑皮质神经元以每毫升10⁵个的细胞密度接种于6孔板中，培养7 d后，分组及给药同前，在氧糖剥夺12 h后，收集细胞悬液，用AnnexinⅤ-FITC和PI室温避光染色，15 min后终止反应，流式细胞仪分析细胞凋亡情况。 1.7 大脑皮质神经元ROS产量检测

将原代培养的大鼠大脑皮质神经元接种入6孔板中，每孔接种2 mL，细胞密度为每毫升10⁶个。分组同前，在氧糖剥夺12 h后，收集细胞悬液，加入2’,7’-二氯荧光黄双乙酸盐(dichloro-dihydro-fluorescein diacetate,DCFH-DA)于37℃避光染色20 min，终止反应，流式细胞术测定细胞内ROS产量。 1.8 大脑皮质神经元HIF-1α和HO-1蛋白表达检测

取各组大脑皮质神经元，提取细胞蛋白，取蛋白样品用10% SDS-PAGE分离后，用湿转法转移至硝酸纤维素膜上，用5% BSA于37℃封闭1 h，用抗HIF-1α、HO-1和GAPDH等抗体4℃孵育过夜，加入二抗室温孵育30 min，用Odyssey仪器扫描、分析各蛋白质条带，蛋白激活水平以免疫印迹中条带的灰度值与内参的比值来表示。 1.9 统计学处理

采用GraphPad Prism 5软件作为作图和数据分析工具，组间比较采用单因素方差分析(one-way ANOVA)，数据以 x±s 表示，检验水准(α)为0.05。 2 结 果 2.1 大鼠原代大脑皮质神经元鉴定

取培养至7 d的神经元，以神经元树突标记物MAP-2抗体对培养的细胞进行免疫荧光染色，并使用Hoechst 33258标记细胞核，以MAP-2阳性细胞占Hoechst 33258染色细胞的比例进行大脑皮质神经元的纯度鉴定。如图 1所示，Hoechst染色细胞为蓝色荧光，MAP-2染色细胞为绿色荧光，merge图的细胞纯度鉴定结果显示大脑皮质神经元纯度在95%以上。

图1

图 1 大鼠大脑皮质神经元鉴定 Fig 1 Identification of cultured rat cerebral cortical neurons MAP-2: Microtubule-associated protein-2. Original magnification: ×100

与对照组相比，氧糖剥夺12 h后细胞存活率下降[(42.8±1.6)% vs (100.0±2.9)%,P<0.01]，提示氧糖剥夺能够导致明显的大脑皮质神经元损伤；给予PNU-282987处理后，细胞存活率上升[(50.6±1.2)% vs (42.8±1.6)%,P<0.01]，表明PNU-282987对氧糖剥夺损伤的大脑皮质神经元具有保护作用。 2.3 PNU-282987降低氧糖剥夺损伤诱导的大脑皮质神经元培养上清LDH含量

氧糖剥夺12 h后，检测各孔培养上清中LDH，结果发现氧糖剥夺可导致大脑皮质神经元LDH释放增加 (1.92±0.18 vs 1.00±0.09,P<0.01)，而PNU-282987可抑制氧糖剥夺损伤神经元LDH的释放 (0.80±0.10 vs 1.92±0.18,P<0.05)。 2.4 PNU-282987降低氧糖剥夺损伤诱导的大脑皮质神经元凋亡率

AnnexinⅤ-FITC流式细胞仪分析结果(图 2)显示，与正常对照组相比，氧糖剥夺损伤12 h后凋亡细胞数明显增加[(27.70±8.50)% vs (6.30±0.83)%,P<0.01]，PNU-282987给药后可明显减少氧糖剥夺引起的细胞凋亡[(12.30±1.98)% vs (27.70±8.50)%,P<0.05]。结果表明经过PNU-282987处理后，大脑皮质神经元对氧糖剥夺的耐受性明显增强。

图2

图 2 PNU-282987降低氧糖剥夺损伤诱导的大脑皮质神经元凋亡率 Fig 2 PNU-282987 decreased the apoptosis rate in cerebral cortical neurons exposed to OGD Ctrl: Control; OGD: Oxygen-glucose deprivation: PNU: PNU-282987; PI: Propidium iodide

流式细胞术分析结果(图 3)显示，氧糖剥夺损伤可使大脑皮质神经元ROS产量增加 (1.24±0.02 vs 1.00±0.04,P<0.01)；PNU-282987可抑制氧糖剥夺损伤神经元ROS产量的升高 (0.99±0.03 vs 1.24±0.02,P<0.01)。

图3

图 3 PNU-282987降低氧糖剥夺损伤诱导的大脑皮质神经元ROS产量 Fig 3 PNU-282987 reduced OGD-induced ROS production in cerebral cortical neurons Ctrl: Control; OGD: Oxygen-glucose deprivation: PNU: PNU-282987; ROS: Reactive oxygen species

与对照组比较，氧糖剥夺后大脑皮质神经元HIF-1α蛋白表达增加(12.9±4.24 vs 1.00±0.04,P<0.05)，HO-1蛋白表达减少 (0.15±0.08 vs 1.00±0.01,P<0.01)。与氧糖剥夺组相比，PNU-282987给药后HIF-1α蛋白表达减少(1.4±0.09 vs 12.9±4.24,P<0.05)，HO-1蛋白表达增加 (0.47±0.07 vs 0.15±0.08,P<0.01)。结果表明PNU-282987可抑制氧化应激，对神经元具有保护作用。详见图 4。

图4

图 4 PNU-282987对氧糖剥夺损伤诱导的大脑皮质神经元HIF-1α(A)和HO-1(B)蛋白表达的影响 Fig 4 Effect of PNU-282987 on expression of HIF-1α (A) and HO-1 (B) protein in cerebral cortical neuron exposed to OGD Ctrl: Control; OGD: Oxygen-glucose deprivation; PNU: PNU-282987; HIF-1α: Hypoxia inducible factor-1α; HO-1: Hemeoxygenase-1

本实验采用原代培养大鼠大脑皮质神经元，接近于体内细胞生物学特性，而氧糖剥夺模型是体外研究脑缺血性损伤的主要细胞模型，是细胞水平研究脑缺血性损伤的基本方法^[3]。近年来，脑缺血性损伤发病率逐年上升，给社会和家庭造成沉重的负担，因此研发神经元保护药物具有重要的临床意义。神经保护剂干预可阻断脑缺血性损伤的不同环节，起到神经保护作用^[4]。脑缺血性损伤涉及的级联反应包括兴奋性氨基酸毒性、梗死周围去极化、炎性反应、细胞凋亡等过程^[5]。脑缺血发生后，氧和葡萄糖供应减少，从而导致脑内氧化磷酸化过程发生障碍，能量减少甚至衰竭。而能量衰竭后又引起无氧糖酵解增加，产生的大量乳酸可引起组织酸中毒。LDH作为参与机体能量代谢的酶，当细胞受到损伤时，细胞膜破裂，LDH释放到细胞外，LDH浓度越高，说明机体受损伤的程度就越大。因此，LDH的活性改变可作为评价脑缺血程度的一个重要生化指标。有研究显示，神经元氧糖剥夺12 h时细胞凋亡明显^[6]，PNU-282987在氧糖剥夺条件下10 μmol/L为最佳浓度^[7]。本研究结果表明，在大脑皮质神经元细胞氧糖剥夺12 h后LDH含量增加，而PNU-282987能降低LDH含量。

脑组织作为代谢最为活跃的器官，其自身能量和氧储备很少，能量来源完全依赖于血液所提供的氧和葡萄糖的有氧代谢，因而对缺血缺氧损伤极为敏感。脑缺血发生后，产生的大量乳酸引起组织酸中毒，进而引起细胞死亡。Binienda^[8]研究证实，凋亡是神经元氧糖剥夺损伤后的重要死亡方式，并且凋亡率与氧糖剥夺损伤的程度在一定范围内呈正相关，因此抑制脑缺血性损伤后的凋亡能够降低神经细胞死亡率，减少受损神经元数量。本实验结果显示,氧糖剥夺可诱导神经元凋亡，PNU-282987预处理后，细胞凋亡率下降，说明PNU-282987能抑制氧糖剥夺诱导的神经元凋亡。

脑缺血性损伤导致细胞凋亡涉及多种病理环节，氧化应激是其核心环节。氧糖剥夺损伤引起神经元细胞内产生大量自由基，导致氧化应激，产生ROS。ROS作为细胞内重要的信使，可活化多种信号通路，进而导致细胞损伤，其中包括HIF-1α和HO-1信号通路^[9]。HIF-1α是氧化还原敏感的转录因子，它是异源二聚体结构，由缺氧性诱导亚基α和结构调节性亚基β组成；正常条件下HIF-1α的表达很少，缺氧时，α亚基作为主要的调节因子进入细胞核内与β亚基结合形成二聚体而活化，结合低氧效应元件发挥效应，调控下游基因的转录^[10]。HO-1作为HIF-1α靶基因，可参与细胞凋亡和增殖调控，其表达可以减少细胞死亡、蛋白质氧化及脂质过氧化，抵抗氧化应激对神经元的损害，抑制细胞凋亡，促进细胞增殖^[11]。本实验结果显示，氧糖剥夺损伤诱导大脑皮质神经元HIF-1α的表达增加，HO-1蛋白表达降低，PNU-282987可反馈性降低氧糖剥夺损伤诱导的大脑皮质神经元HIF-1α表达，增加HO-1蛋白表达。这提示PNU-282987可通过降低HIF-1α表达，增加HO-1表达，减少氧化应激损伤，从而对神经元起到抗凋亡的作用。

研究表明，应用α7nAchR激动剂可增加血肿区域小胶质细胞的数量，进而对脑内出血引起的损伤具有神经保护作用^[12]；Park等^[13]研究证实，激活α7nAchR可降低小神经胶质细胞的活性和减少脂多糖诱导的TNF-α的释放；另有研究证实，激活α7nAchR可减轻早期脑损伤^[2]。但激动α7nAchR对大脑皮质神经元的作用尚未见报道。本研究发现激活α7nAchR对氧糖剥夺损伤的大脑皮质神经元具有抗凋亡作用，同时降低氧化应激产生的ROS产量，调节HO-1与HIF-1α蛋白表达，以抵抗氧糖剥夺引起的氧化应激损伤，证实PNU-282987对神经元的保护作用至少部分通过抗氧化应激而实现，提示α7nAchR有望成为脑缺血性损伤研究的新靶点。