脊柱关节炎(spondyloarthritis,SpA)，也称血清阴性脊柱关节病或脊柱关节病，是以中轴和外周关节受累、具有家族聚集倾向、血清类风湿因子阴性以及与HLA-B27相关为特点的一组多系统受累的炎症性疾病。该组疾病包括强直性脊柱炎、银屑病关节炎、反应性关节炎、炎性肠病性关节炎、幼年特发性关节炎等。其发病原因及机制仍未明确，并且未有确切疗效的治疗措施。为研究SpA的发病原因、机制以及治疗措施，科研人员探索SpA相关动物模型的尝试从未间断过。其中，转基因SpA模型有HLA-B27转基因小鼠、HLA-B27/hβ2m双转基因大鼠；自发性SpA模型有ANKET小鼠、Ank/Ank小鼠；炎症驱动的模型有TNF^ΔARE小鼠；外源性抗原诱导的SpA模型有蛋白聚糖诱导的小鼠关节炎模型(proteoglycan-induced arthritis,PGIA)。不同的小鼠模型都部分表现出SpA相关特征性症状，但尚无一种动物模型能完全模拟SpA临床病理表型和免疫学特性。PGIA是目前唯一侵犯中轴骨系统的系统性自身免疫小鼠模型，已成为脊柱关节炎动物模型研究的热点。该动物模型是由人类关节软骨来源的蛋白聚糖(proteoglycan,PG)免疫BALB/c小鼠或 C3H 小鼠的某些亚系而产生的系统性自身免疫性SpA小鼠模型。该小鼠模型最先出现外周关节的滑膜炎，随后出现关节软骨的侵蚀，最后关节软骨异常增殖。表现为外周足踝、足趾关节的红肿，后期出现外周及脊柱关节的畸形、强直及功能受限^[1]。 1 PGIA动物模型的诱导及优化 1.1 小鼠种群及易感基因 最常用于诱导PGIA的是BALB/c小鼠，该品系小鼠对关节炎有基因易感性。BALB/c小鼠(H-2d单体)不同种群在发病率和发病的严重程度上均表现出差异，来自查尔斯河实验室和美国癌症研究所的BALB/c小鼠种群PGIA诱导率可达到98%~100%。如果不发生基因污染，一般BALB/c小鼠种群PGIA诱导率至少达到50%。研究发现雄性BALB/c小鼠在蛋白聚糖诱导后表现出较高的死亡率，故一般选择雌性小鼠用于诱导模型。而周龄在16~20周的小鼠与6~8周的小鼠相比，关节炎症状出现较早且症状更严重^[2]。现研究发现另外一种对PGIA易感的是C3H小鼠的亚系(H-2K单体型)，该小鼠不同种群在PGIA发病率上也表现出极大差异，C3H/ChR和C3H/HeJCr这两支种群对PGIA易感性较高，而C3H/HeJ 和C3H/BiDACr则对PGIA表现出一定的抵制效应(易感性低于10%)，而具体导致该差异的基因基础有待进一步探索^[3]。由于引起PGIA发病的基因背景十分复杂，研究人员在基因水平对差异易感性的原因进行了较多探索。通过对PGIA易感小鼠及PGIA抵抗小鼠杂交子代进行差异基因分析发现众多数量及质量性状相关位点。Adarichev等^[4]发现X染色体及5、10、17、18号染色体上的数量性状位点与PGIA发病相关，Glant等^[5]揭示3号染色体上的Pgia26a通过调控T细胞应答控制PGIA的发病，19号染色体上的Pgia23和Pgia12与 PGIA的低发病率相关。虽然研究发现众多与PGIA发病、严重程度相关的基因位点，但各组研究结果差异较大且未进行进一步验证，PGIA复杂的发病基因背景仍需要不断探索。 1.2 PGIA诱导抗原

关节软骨是一种无血管组织，不受自身免疫系统的监视。当软骨降解后能够暴露和释放独特的抗原分子物质，这些物质能够被自身免疫系统识别从而激发免疫反应。PGIA是关节软骨来源的蛋白聚糖注入小鼠腹腔后引发自身免疫反应而形成的关节炎模型，蛋白聚糖作为抗原在模型建立过程中至关重要。蛋白聚糖相对分子质量约2 000 000~3 000 000，由核心蛋白(相对分子质量220 000)以及连接在核心蛋白上的硫酸软骨素侧链(chondroitin sulfate,CS,相对分子质量20 000~30 000)和硫酸角质素(keratan sulfate,KS,10 000~20 000)侧链构成，而核心蛋白由G1、G2、G3以及KS、CS侧链附着部位共同组成。蛋白聚糖是细胞外基质的重要成分之一，可与细胞外基质中的胶原、纤粘连蛋白、层粘连蛋白及弹性蛋白结合构成具有组织特性的细胞外基质^[6]。

软骨中抗原的提取经历粗提、蛋白聚糖的纯化以及去糖基化等3个主要步骤。粗提是将磨碎的软骨放入含有蛋白酶抑制剂的盐酸胍溶液中进行萃取，软骨研磨前需将结缔组织以及血管剔除干净，研磨后软骨颗粒的大小直接影响着萃取的质量。提取液中一定量的蛋白酶抑制剂将有助于防止蛋白聚糖的降解。粗提的蛋白聚糖在去糖基化后可直接用于PGIA的诱导，在检测蛋白聚糖特异性B细胞和T细胞反应时，则需要对粗提的蛋白聚糖进一步纯化。氯化铯梯度离心法是较常用的纯化方法，相对分子质量较大的蛋白聚糖将沉积在离心管底。由于蛋白聚糖具有众多T细胞抗原表位的核心蛋白被100~120条糖胺聚糖侧链所掩盖，离心后的蛋白聚糖同样需要经过进一步去糖基化才能用于PGIA的诱导。软骨素酶ABC和β-内切半乳糖苷酶分别降解CS和KS侧链，从而暴露相应抗原表位，使得注入小鼠腹腔的抗原能够激发相应免疫应答反应，引发关节炎^[6]。

在PGIA动物模型的诱导实验中用作抗原的蛋白聚糖主要是从人、犬和猪的软骨中提取出来的，牛、羊软骨来源的蛋白聚糖也可用作抗原，但是诱导的发病率和严重程度都较低，而猫、鼠、兔、鸡等动物软骨来源的蛋白聚糖则无法诱导出关节炎模型^[7]。而最新研究显示商品化的牛软骨来源的蛋白聚糖可用于PGIA的诱导且诱导率较高^[8]。Glant等^[9]从胎儿、骨关节炎患者、风湿性关节炎患者以及正常人的关节软骨中分别提取蛋白聚糖用于PGIA的诱导，结果发现从骨关节炎患者软骨中提取得到的蛋白聚糖在作为抗原诱导PGIA时效率最高。其后研究显示胎儿、成人以及关节退行性病变患者的软骨其蛋白聚糖的分子组成是不同的。胎儿软骨蛋白聚糖相对成人软骨蛋白聚糖含有更多的CS侧链以及更少的KS侧链，此时的蛋白聚糖是相对完整的分子，免疫原性较弱。随着年龄的增长、软骨的退变以及炎症的影响，更多的金属酶更广泛地作用于蛋白聚糖核心蛋白，而核心蛋白暴露的抗原表位和部分降解的片段能够激发滑膜关节的免疫反应^[10]。重组的蛋白聚糖G1区域也被用于关节炎的诱导，产生的关节炎(proteoglycan aggrecan G1-induced arthritis，GIA)与PGIA相比临床表型相似，而特异的自身抗体是不同的^[11]。通过对PGIA抗原的进一步研究将有助于人类脊柱关节病潜在抗原的探索并为该类疾病的发病机制提供更多假说。 1.3 PGIA免疫佐剂的选择

佐剂是非特异性免疫增强剂，当与抗原一起注射或预先注入机体时，可增强机体对抗原的免疫应答或改变免疫应答类型。 弗氏佐剂(Freund’s adjuvants)是较常用的动物实验的佐剂，其中不完全弗氏佐剂(IFA)是液体石蜡与羊毛脂混合而成，在不完全佐剂中加入卡介苗或死的结核分枝杆菌，即为完全弗氏佐剂(CFA)。蛋白聚糖混合弗式佐剂注入机体后，可使抗原物质缓慢地释放，延长了抗原的作用时间，同时佐剂吸附了抗原后，增加了抗原的表面积，使抗原易于被巨噬细胞吞噬。在刺激机体免疫系统方面弗式佐剂可促进淋巴细胞之间的接触，增强辅助T细胞的作用，提高机体初次和再次免疫应答的抗体滴度并可以改变抗体的产生类型以及产生迟发型变态反应。弗式佐剂的缺点是在注射入腹膜腔后有形成肉芽肿的可能^[12]，这对小鼠的生理状态和实验结果可能有部分干扰。

为了研究新的更优良的佐剂，Hanyecz等^[13]使用双十八烷基二甲基溴化铵(dimethyldioctadecylammonium bromide,DDA)用于PGIA模型诱导，结果显示使用DDA作为免疫佐剂与弗式佐剂相比不仅在更短的时间出现小鼠关节炎表现，而且发病的严重程度更甚。随后Stoop等^[14]的研究结果显示两种免疫佐剂诱导的关节炎模型在发病率和疾病严重程度上并无差异，差异主要表现在诱导产生的T淋巴细胞比例上，即弗式佐剂诱导产生的T细胞以Th17为主而DDA诱导产生的T细胞以Th1为主。由于佐剂在诱导模型时能够影响免疫应答的类型及强度，在研究该模型发病机制时应注意佐剂潜在的影响。 2 PGIA临床表型及病理学鉴定

诱导PGIA模型常用的方法是将相应剂量的抗原和免疫佐剂混合后，分别在第0周、第3周、第6周分3次注入小鼠腹腔。在第3次抗原注射结束后2周左右可观察到外周关节红、肿等关节炎表现。根据小鼠关节炎症状的严重程度(无任何炎性肿胀为0分，一个脚趾受累表现出肿胀为1分，大于1个脚趾受累为2分，足趾僵直失去关节功能为3分，踝关节肿胀僵直为4分^[1])，对模型小鼠的四肢进行评分，总评分在0~16之间。外周关节表型评分体系可直观地评价该模型的炎症及骨化进展，并为评判干预措施的效果提供较为直观的指标。中轴关节炎症及骨化的累及无明显临床表型，需借助病理及影像学方法来进行观察。

组织病理学分析显示PGIA模型病变关节主要表现为淋巴细胞的浸润和组织水肿，并伴有关节间隙多型核细胞的浸润以及滑膜巨噬细胞和成纤维样细胞的增殖，而同时存在的关节软骨腐蚀以及软骨细胞增殖最终导致关节的强直。中轴关节的累及最早可见于第3次抗原注射后8周，首先是骶髂关节受累，接着病变影响到腰椎、胸椎以及颈椎。 模型小鼠脊柱大体上表现为椎间盘间隙的消失和骨赘的形成。在脊柱关节病的急性阶段大量浸润的单核细胞导致椎间盘变形，病变及重吸收的纤维环使得髓核突出压迫脊髓。脊柱病变主要通过组织病理切片进行观察，表现为椎间盘的炎性细胞浸润和骨化^[1]。小鼠颞下颌关节亦出现骨关节炎样软骨破坏^[15]，这也使得该模型可用于下颌关节炎的研究。PGIA脊柱的炎症及骨化相关病理学特性使得该模型成为研究脊柱关节炎炎症、骨化及两者关系的良好载体，是目前唯一侵犯中轴骨系统的系统性自身免疫小鼠模型。 3 PGIA免疫学特性 3.1 B细胞应答 PGIA是外源性物质注入小鼠体内通过一系列自身免疫反应而引起的关节炎模型。免疫反应在疾病发病进程中至关重要。核心蛋白在各个物种之间具有高度的一致性，加之糖胺聚糖侧链的掩盖，使其B细胞抗原性相对较弱，但核心蛋白的降解产物作为新的抗原在自体和异体都具有较强的免疫原性。注射入小鼠腹腔的人核心蛋白特异性抗体在免疫后2周即可检测到，而小鼠蛋白聚糖特异性自身抗体直到4周左右才能检测到，该类抗体通过促炎性因子的释放以及基质金属蛋白酶的激活在PGIA关节炎的发生以及发展阶段都有重要作用^[16]。另外，Brennan等^[17]发现CS、KS特异性B淋巴细胞是一种高效的抗原提呈细胞，与普通抗原提呈细胞相比能够显著提高PG抗原提呈进程。Hamel等^[18]使用去B淋巴细胞治疗方法干预，显示出B淋巴细胞可通过加强效应性T细胞活性以及抑制调节性T细胞效应来调节炎性反应。另外，B淋巴细胞上可诱导共刺激分子(inducible costimulator，ICOS)的表达是活化效应T细胞所必需的，抑制ICOS的表达可显著抑制各类炎性因子的产生^[19]。综上，可以认为B淋巴细胞在整个PGIA发病进程中起着重要的辅助作用。 3.2 T细胞应答及相关细胞因子 相对于较弱的B淋巴细胞激活作用，蛋白聚糖能够引发强烈的T淋巴细胞免疫反应。蛋白聚糖分子包含有一条2 200个氨基酸的骨干(核心蛋白)以及连接在骨干上的100~120条带负电荷的糖胺聚糖侧链。大约共有143个抗原表位存在于核心蛋白上，其中121个存在于球形区域，22个存在于侧链连接区域。在BALB/c小鼠中仅有27个抗原表位可引发T细胞免疫应答，而C3H小鼠中也仅有21个^{[20, 21]}。Buzás等^[20]研究发现仅有4个基因位点和关节炎的发生有较明确的关系，其中3个位于G1区，一个位于G3区。完整的蛋白聚糖分子由于抗原表位被糖胺聚糖侧链所掩盖，是一种较弱的抗原，在活体中新陈代谢、老化以及炎症作用下蛋白聚糖分子的完整性受到破坏，T细胞抗原表位的暴露将引起强烈的T淋巴细胞反应，体外实验时利用相关的酶消化糖胺聚糖侧链能够达到相同的效果^[7]。进一步研究显示T细胞抗原表位的瓜氨酸化可改变T细胞免疫识别及应答反应^[22]。

PGIA小鼠淋巴器官及病变关节均能够检测到自身反应性T细胞，初始时认为迁移至关节部位的T细胞是关节炎起始以及进展的主要影响因素，后研究发现在抗原特异性T细胞协助下产生的自身抗体是PGIA发生及进展的主要因素^[23]。T细胞受体(T cell receptor,TCR)转基因BALB/c小鼠对PGIA易感性显著增高，高周龄纯合子TCR TgA小鼠则出现自发关节炎的表现，并且TCR信号强度的大小影响着自体T细胞的活化和凋亡，也关系到PGIA的发病和严重程度^[24]。反应性T淋巴细胞中以CD4⁺T细胞较活跃，而更以Th1细胞占主导地位。脾脏以及关节组织匀浆中都检测出极高的Th1细胞因子(IFN-γ)，中和IFN-γ治疗能够抑制关节炎的恶化。IFN-γ^-/-小鼠诱导PGIA时与野生型相比不仅发病时间延迟，严重程度也明显较轻。Finnegan等^[25]发现在关节炎发病前用Th2反应相关细胞因子进行干预能够防止关节炎的发生，显示出将Th1反应转为Th2反应有益于控制关节炎症。IL-4是Th2反应的重要炎性因子，该因子通过抑制促炎性因子的表达来调控巨噬细胞活动，进而进一步影响IL-12和 TNF-α等炎性因子的产生。在PGIA诱导早期阶段，IL-4的干预能有效预防外周关节炎的发生，而IL-4不足小鼠PGIA发病时间明显缩短，严重程度也较对照组高^[26]。

关于IL-17在PGIA发病中的作用，Doodes等^[27]在IL-17缺陷鼠上诱导出与野生鼠相同的PGIA，故认为IL-17在PGIA诱导过程中无相关作用。进一步研究发现IL-17缺陷时，过量分泌的IFN-γ弥补了IL-17分泌的不足^[28]，并且中和IL-17治疗对模型鼠有一定作用^[29]，这些都显示出IL-17在PGIA发病中的作用。Rodeghero等^[30]发现不同抗原注射部位对炎性因子的分泌亦有影响，腹腔注射时以IFN-γ分泌为主，而皮下注射时IFN-γ和 IL-17均有分泌，故一般认为IL-17和IFN-γ在PGIA发病过程中有协同作用。IL-23被认为在皮下注射抗原时参与疾病的进展过程，而腹腔注射诱导的该模型疾病进程无IL-23的参与^[31]。综上所述，PGIA是细胞、体液免疫以及各类细胞因子共同作用下产生的复杂的自身免疫性疾病。 4 PGIA骨化通路相关研究

Wnt信号通路和Dickkopf (DKK)-1是最近发现的与骨化发生密切相关的因素。Wnt信号通路是促骨化因素，在正常个体及关节炎进程中均具有重要作用，是维持骨形成及骨破坏稳态的重要通路^[32]；而DKK-1是Wnt信号通路的抑制剂，它可以抑制骨化进程，阻断DKK-1可促进骶髂关节的融合^[33]，相关研究也显示强直性脊柱炎患者体内DKK-1失衡^[34]。对于PGIA小鼠的骨化相关因素研究发现该模型中Wnt信号通路抑制剂DKK-1和SOST的表达较正常组显著降低^[35]。因此PGIA小鼠Wnt信号通路的进一步探索将有助于揭示骨化相关机制，并且为脊柱关节炎患者骨化的预防及治疗提供新的思路。 5 结论及展望

脊柱关节炎是一组慢性炎症性自身免疫疾病，具有特定的病理生理、临床、放射学和遗传特征，目前发病机制仍不清楚。动物模型是研究人类疾病的重要工具，然而目前尚无任何一种动物模型能完全模拟脊柱关节炎的发病过程和临床表现。关节及脊柱的骨化强直是脊柱关节病中强直性脊柱炎后期的特征性临床表现，骨化与炎症的关系以及骨化自身的病理机制都是亟待解决的难题。PGIA小鼠是目前唯一侵犯中轴骨系统的系统性自身免疫小鼠模型，后期出现外周和中轴关节的骨化强直使得该模型成为研究骨化机制的良好载体，对脊柱关节炎的基础研究具有极为重要的意义。然而用于诱导PGIA的蛋白聚糖提取过程烦琐、市场价格昂贵并且模型诱导周期较长，这在一定程度上限制了PGIA小鼠模型的普及推广。未来基因及免疫学方面的研究将有助于进一步了解该小鼠模型的发病机制，从而为人类脊柱关节炎疾病的诊断和治疗提供依据。