心脏发挥正常功能依赖于其高度精细化的亚细胞结构。心肌细胞膜连接复合物(junctional membrane complexes，JMCs)偶联可兴奋细胞如骨骼细胞、心肌细胞、神经元等，细胞内外的信号通道，以实现细胞信号的自外向内的传导过程^[1]。在心肌细胞中，肌细胞膜上L型钙通道(L-type Ca²⁺ channels，LTCCs)向胞内的肌质网(sarcoplasmic reticulum，SR)的钙信号传导主要依靠JMC结构，即由连接型肌质网(junctional SR，jSR)同肌纤维膜内陷而成的T管膜并排而成的亚细胞结构^{[2, 3]}。Junctophilin-2蛋白(JPH2)主要表达于心肌组织，在JMC这一亚细胞结构的发育成熟与功能稳定上发挥关键作用^[4]。JPH2的功能缺失性基因变异、蛋白表达水平的下调以及胞内空间分布的紊乱，同肥厚性心肌病、心力衰竭、心律失常等疾病的发生发展关系密切^[5]。针对JPH2的进一步研究，有助于为这一系列疾病提供新的治疗靶点和分子干预手段。 1 JPH蛋白的发现及其分子结构 1.1 JPH蛋白的发现

心肌细胞通过兴奋收缩偶联的过程实现收缩和舒张。当心肌细胞兴奋时，动作电位激活电压门控L型钙通道，引起的钙内流会激活SR的钙释放通道——2型ryanodine受体(RyR2)，导致SR钙释放，这一过程即为“钙触发钙释放”(Ca²⁺ induced Ca²⁺ release，CICR)。释放入胞质的Ca²⁺即表现为钙瞬变(Ca²⁺ transient)，Ca²⁺和肌丝上钙结合蛋白相结合，触发肌肉收缩。只有在细胞膜和横管与SR的距离非常近的情况下，通过LTCCs流入的微小钙信号才能激活SR上ryanodine受体(RyRs)，而两个膜维持邻近距离的机制早期并不清楚^[6]。Franzini-Armstrong等^[7]认为是LTCC和RyR2钙通道相互作用的结果，但是在敲除LTCC和RyR2后小鼠骨骼肌JMC结构仍然存在。Suda等^[8]在中国仓鼠卵巢上皮细胞中转染LTCCs以及RyRs的cDNA，但是既没有发现膜去极化诱发的钙释放，也没有发现细胞膜与内质网(ER)膜的空间上结构邻近，这些结果提示JMC的形成依赖于其他的结构蛋白。2000年，Takeshima等^[9]利用单克隆抗体库技术在兔骨骼肌中发现了JPH蛋白，并证明它同时与内(肌)质网和细胞膜相互作用，使这两个膜保持一定的距离，以实现钙信号的有效传递。 1.2 JPH2蛋白的分子结构

目前已发现JPHs蛋白的4种亚型，JPH1主要分布在骨骼肌组织中^[10]，在心脏和脑中也有少量分布，JPH2主要分布在心肌组织，JPH3和JPH4则存在于神经组织中。JPH2蛋白从N端到C端依次是motif region (MORN)功能Ⅰ区、连接区、MORN功能Ⅱ区、α螺旋样区、可变区以及跨膜区^[9]。

MORN功能区因其对磷脂的高亲和力将JPH2锚定在质膜上，而连接区将MORN区域分隔为功能Ⅰ区和功能Ⅱ区，连接区被认为是胞质蛋白的结合区，调节JPH2与胞膜或者SR膜的结合能力^[9]。α螺旋样区的二级结构由多个α螺旋组成，大约延续100个氨基酸左右，α螺旋将细胞的质膜同ER/SR之间的间隙桥接起来，在心肌细胞收缩舒张过程中保证偶联结构的机械弹性^[9]。可变区的命名是因为其在各JPH亚型间的一级结构相对不保守性，预期不存在特定的生物学功能^[11]。JPH2的疏水性C末端构成跨膜区嵌入SR。 2 JPH2蛋白的生理和病理生理功能 2.1 T管发育及JMC形成

新生哺乳动物的心肌细胞T管系统发育不完善，但是随着其相对较大的表面积/体积的比值，和加上钠钙交换体(Na⁺-Ca²⁺ exchanger，NCX)表达水平及功能的提高，而且肌原纤维多靠近肌膜分布，还是能够为其提供足够的跨膜钙内流来激发ECC。但由于细胞体积的增大，出生后数天内必须依靠T管形成以来维持有效的ECC。

T管的发育以及JMC结构形成包括膜内陷、延伸和邻近两个膜结构锚定等精细协调步骤。研究发现多个蛋白参与JMC结构的发育过程，如Bin1蛋白(bridging integrator-1)通过其高磷脂亲和区域介导胞膜内陷，且同LTCC直接相连^[12]。小窝蛋白3(caveolin-3，Cav3)参与心肌细胞膜内陷形成小窝(caveolae)，Cav3同样参与LTCC及钾离子等多个离子通道的调节。研究表明JPH2同 Cav3存在相互作用，并且在T管的发育中发挥了重要作用^[13]。Han等^[14]利用RNAi技术干扰JPH2基因表达，发现心肌细胞出现了T管结构的破坏。另外有研究发现心肌JPH2低表达的小鼠出现出生后T管成熟障碍，而JPH2过表达的小鼠却在出生后8 d T管提前发育成熟^[15]。在T管的发育过程中，JPH2的表达同LTCC在空间上分布共定位，随后钙调控逐渐成熟，开始出现JMC结构^[16]。有研究者利用单分子超高分辨率显微镜观察大鼠心肌细胞，发现RyR2簇与同样呈簇状排列的JPH2距离非常近，在80%的部位两者表现为空间共定位^[17]。据此认为，T管的发育同JPH2蛋白的逐步表达可能存在时间相关性，JPH2蛋白通过与Cav3、LTCC或者RyR2之间的相互作用，参与调节T管的发育以及JMC结构形成。 2.2 原发性心肌病

原发性心肌病在临床上有着较高的发病率及死亡率。在扩张型心肌病 (dilated cardiomyopathy，DCM)和肥厚型心肌病(hypertrophic cardiomyopathy，HCM)的转基因小鼠模型中均发现JPH2蛋白表达水平的降低^[18]。临床患者心肌样本研究得出了类似的结论，左室流出道梗阻HCM患者心肌标本，JPH2的表达量下降，有些标本甚至检测不到JPH2的表达^{[15, 19]}。敲除JPH2的HL-1心肌细胞系出现了细胞的肥大，以及肥大相关生物活性因子上调，如肌动蛋白、心钠素、脑钠素等，并且出现了钙瞬变强度的降低^[19]。

针对临床诊断明确的HCM患者心肌标本进行JPH2基因突变筛查，发现S101R、Y141H以及S165F 3个位于MORN功能Ⅰ区或连接区位点的突变，且这些HCM患者均未检测到之前公认的HCM相关突变基因^[18]。在H9c2细胞系中过表达上述突变JPH2基因，出现CICR强度降低以及细胞超微结构的破坏，最终导致细胞肥大^[20]。在1个多代小家系中发现JPH2-E169K同HCM及AF的发病有关，而在1个北美白种人家系中，发现HCM先证者中存在JPH2-A405S突变^[4]。根据上述结果，JPH2的功能缺失性基因变异有可能是通过破坏CICR，影响了心肌细胞的正常收缩和舒张，使得心肌出现肥厚，甚至出现心力衰竭。但是由于HCM患者JPH2基因突变概率过低(<1%)，并且病例数不足，很难确定突变同疾病之间的因果关系，仍需要进行大规模基因检测或者构建表达JPH2突变的转基因模型来进一步确定。 2.3 心力衰竭

在心力衰竭的动物模型和心力衰竭患者中，均发现心肌细胞T管的病理性结构重构。JPH2表达的下调导致了病理性的心脏重构。JPH2的 mRNA水平下降同左室壁厚度的增加及收缩力的提高在时间上是一致的，表明JPH2的下调可能是在心力衰竭之前功能代偿期的早期反应^[21]。这种由JPH2下调介导的T管破坏可能是未来心衰进展的指标。JMC结构的破坏会导致RyR2再定位于非JMC区域，空间错位会导致钙释放单位(calcium release units，CRUs)的钙释放减少，钙瞬变延迟且幅度减小，以及RyR2钙火花及钙漏流的增多^[22]。 在离体培养的细胞实验中使JPH2沉默表达，心肌细胞出现CICR受损，钙瞬变幅度减弱，但SR单位钙释放量增加，其他钙调蛋白表达水平未见变化，可能是由于JMC功能尤其是RyR2功能改变所致^[23]。在鼠心肌组织进行免疫共沉淀发现RyR2与JPH2存在直接相互作用，JPH2可能参与调控RyR2开关，其表达下降导致ECC障碍及SR的舒张期钙漏流增多^[23]。

在心力衰竭等病理条件下，心肌细胞的收缩力降低，这其中CICR机制的调节起到了作用，CICR机制又是由LTCCs、RyR2以及两者之间的偶联关系这三方面的因素共同决定的。Gomez等^[24]发现心力衰竭过程中，即使LTCC和RyR2各自的性质没有改变，其兴奋-收缩偶联效率也会降低。这就提示在心衰过程中，两者之间的偶联关系发生了改变。综上所述，JPH2蛋白本身可能主要定位于jSR上，能够通过自身MORN结构域以及Cav3等相关蛋白的相互作用来实现对横管的结合。当JPH2表达减少，jSR上的JPH2密度变小，因而对于横管的结合力降低。当二者之间的结合力不足以维持JMC偶联结构时，横管与SR就会分开，出现脱偶联，最终导致了心肌内钙调控的紊乱和收缩功能的下降^[24]。 2.4 心房颤动(房颤)

房颤作为临床最常见的心脏节律紊乱，其发病率随着人口老龄化逐渐升高。根据最新指南定义，按照其发作时程的长短将其分为以下几种类型：阵发性房颤 (paroxysmal AF，pAF)、持续性房颤(persistent AF)、长程持续性房颤(long-standing persistent AF)以及永久性房颤(permanent AF)^[26]。另外指南单独规定了非瓣膜疾病相关的房颤(nonvalvular AF)，其定义为除外风湿性右房室瓣狭窄，生物瓣、机械瓣置换或瓣膜修补术后的房颤患者^[26]。不同类型房颤其发病具体机制存在显著差异，但钙稳态异常是房颤发生的一个共同的重要机制。 2.4.1 钙稳态异常

房颤需要快速异位起搏点以及折返环才能得以维持^[27]。折返需要心脏本身存在易感性基质，而最常见的异位自发放电活动就是后除极，包括完全复极后发生的延迟后除极(delayed afterdepolarization，DAD)和完全复极之前发生的早期后除极(early afterdepolarization，EAD)^[28]。DAD由内向的钠钙交换电流(INCX)引起，舒张期胞质内的钙浓度升高，Ca²⁺同胞外的Na⁺进行1∶3交换，产生阳离子的净内向移动。瞬时内向电流(transient inward current，Iti)特指引起DAD的跨膜电流，Iti达到产生兴奋的阈值后即产生自发性的动作电位。早期后除极发生于APD过度延长时，使得LTCC从失活状态恢复，Ca²⁺内流而导致细胞去极化。

大量研究提示RyR2通道稳定性下降同心律失常存在联系^[29]。在房颤患者心肌标本中，可见蛋白激酶A(PKA)和钙/钙调蛋白依赖的蛋白激酶(CaMKⅡ)分别作用于RyR2的S2808和S2814位点,使得RyR2超磷酸化，从而增大了RyR2通道的开放概率^{[30, 31]}。相反的，磷酸酶活性的调节异常，即磷酸酶抑制剂I-1的功能异常也可以导致心律失常患者的RyR2超磷酸化^[32]。无论是PKA的磷酸化作用还是遗传性的RyR2基因突变抑或RyR2复合物中的RyR2抑制性蛋白FKBP12.6的减少，均可增加心律失常易感性^{[33, 34]}。JPH2参与维持JMC的结构，也可能通过直接或者间接作用于RyR2通道门控调节，而对正常的心肌钙信号传导进行调控。 2.4.2 JPH2在调控RyR2稳态中的作用

最近研究发现，在1个HCM家系中，表现为青少年早发的阵发性房颤或者室上性心动过速的2例HCM患者均携带有JPH2-E169K突变，该突变导致了RyR2与JPH2的结合减少、RyR2释放钙火花频率以及钙泄漏的增多，从而诱发DADs^[4]，而DADs是房性心律失常最主要的作用机制。此外，动物实验表明总JPH2蛋白表达水平的高低同小鼠的AF发生率呈负相关并且发现将急性分离的JPH2低表达的小鼠心肌细胞，制备成可渗透态细胞后，导入小段JPH2-E169区域的含25个氨基酸的模拟多肽，可以稳定RyR2通道^[4]。 3 小 结

JPH蛋白家族对于可兴奋细胞的正常钙信号传导起到重要的作用，但其表达水平或者功能的改变同多种临床疾病关系密切。最初认为JPHs只是参与维持细胞的超微结构，后来发现JPH2也参与一系列钙调控相关蛋白的功能调节，是实现钙信号传导生理功能所必需的。JPH2的改变会导致胞内钙信号传导异常继而引起心力衰竭、心肌病、心律失常等一系列疾病。

目前认为JPH2蛋白的功能下调可能有以下3种机制：(1) 微小RNA-24(microRNA-24，miR-24)^[35]。在心肌肥厚及心衰动物模型中，可见miR-24上调，JPH2下调，而其他钙调节蛋白未变化，过表达miR-24可见CICR 及ECC的下降。超压力负荷动物模型施加miR-24抑制剂可以保护T管结构及钙调节能力^[36]。(2) 钙依赖酶解。胞内钙浓度持续升高，μ钙蛋白酶-calpain自水解激活，将JPH2水解而使之功能下调。在骨骼肌中，已经发现这种钙介导水解可导致ECC受损，而且在心脏缺血再灌注损伤中也发现calpain活性上调^[37]。 (3) 细胞骨架介导移位。心肌肥厚或心衰时可见微管稳定性且密度增加，可能同心肌收缩力下降有关^[37]。在心肌肥厚大鼠模型中，微管密度增大同T管重构和ECC下降有相互关系，JPH2蛋白表达水平不变却出现了位置的边缘化^[35]。应用微管抑制剂可干扰T管重构及JPH2异位，保障有效ECC，提示JPH2表达水平可能并未改变，其空间分布的异常也可能是导致生理功能改变的重要原因。针对JPHs蛋白结构及功能的研究，对于进一步了解心脏发挥其正常生理功能的内在机制以及心脏疾病发生发展的病理调控机制，具有重要的研究意义以及潜在的临床应用价值。