乙型肝炎病毒(hepatitis B virus，HBV)慢性感染已成为全球重要的公共卫生问题。目前全球共有约3亿5 000万HBV慢性感染者，是造成肝脏疾病负担的最主要因素之一^[1]。世界范围内，30%的肝硬化(liver cirrhosis，LC)患者和53%的肝细胞癌(hepatocellular carcinoma，HCC)患者是由HBV慢性感染所致^[2]。我国大陆地区每年新发肝癌和死于肝癌患者均占到全世界的一半左右。单纯HBV慢性感染者的HCC发生率与非HBV感染者相比，在男性中为14.73倍，女性中为7.38倍^[3]。HBV慢性感染相关的不同疾病状态包括乙型肝炎病毒携带者(asymptomatic HBsAg carriers，ASC)、慢性乙型肝炎(chronic hepatitis B，CHB)、LC、HCC。

HBV是一种嗜肝性DNA病毒，全长约3.2 kb。HBV基因组共有4个开放阅读框，即P区、S区、X区、C区，编码：P聚合酶、S蛋白(L，M，S)、X蛋白和核心蛋白等。根据HBV基因序列差异率大于8%，共区分出8种乙肝病毒基因型(A～H)以及数目不等的亚型，其中我国大陆地区主要的流行株为B2亚型(27.3%)和C2亚型(58.0%)^[4]。HBV基因型以及亚型与疾病负担密切相关，如基因B型常引起急性感染，而C型常导致HBV的慢性感染，其中C2亚型是发生LC和HCC的主要危险因素。HBV复制过程中存在一个必不可少的反转录步骤，以细胞核中松弛环状共价键结合的HBV联合体(covalently closed circular DNA，cccDNA)为模板合成前HBV基因组RNA(pregenomic RNA，pgRNA)，然后由pgRNA为模板反转录成DNA，该步骤由于缺乏稳定的模板而导致HBV DNA相对不稳定。导致HBV基因组DNA的常规变异率介于RNA病毒和DNA病毒之间。同时由于HBV基因组4个开放阅读框高度重叠，相同基因片段常具有多个基因功能，某些突变可能会影响HBV相关基因的功能，而人体肝细胞中HBV产生速率每天可达10¹³，影响HBV复制的变异将不能被遗传下来，因此HBV变异常被局限在一定的范围内，形成了自己的特点。前期的研究工作表明：肝脏的炎症状态、高ALT(alanine aminotransferase)水平、HBV基因C型、高HBV DNA载量(≥10⁴ copies/mL)，以及相关基因突变是促使ASC/CHB向HCC转化的独立危险因素^{[4, 5]}。除病毒相关因素以外，宿主自身的遗传因素如人类白细胞抗原(human leukocyte antigen，HLA)的基因多态性，在HBV致HCC过程中也具有重要意义。

机体被乙肝病毒感染后，会通过各种免疫途径清除病毒，而HBV在逃避机体的免疫压力时，被动选择出适应于在“恶劣环境”中生存的HBV变异。HBV基因组的HBx和pre-S1/pre-S2/S区内相关基因突变通过降低CD8⁺T识别抗原表位数量来逃避免疫清除，而S区突变G145R，则改变了乙肝表面抗原(hepatitis B surface antigen，HBsAg)原有结构^[6]。由此可见，只有适应于机体免疫环境下的HBV病毒株才能够生存下来，而这些被机体选择出来的突变，进一步促使向LC或HCC恶性转化。发生于pre-S区和(enhancer Ⅱ/basal core promoter/precore，EnhⅡ/BCP/PC)区的相关基因突变不仅是发生HCC的独立危险因素^[5]，还可以为HCC的复发和预后提供指示作用^[7]。在慢性炎症微环境下，机体不仅促进HBV的基因突变，而且也会通过某些机制促使自身产生众多的体细胞突变。在生存选择和免疫选择压力下，机体选择出特定方向的体细胞突变，常表现为促癌基因的激活、抑癌基因的失活，加快癌症进程。因此，在人体内的HBV慢性感染状态下，病毒与机体的免疫系统存在一种相互“适应”的状态，表现为“变异-选择-适应”的进化过程。

HBV感染人体后，受到机体的免疫压力选择，只有一部分的急性感染人群转为慢性感染。在没有HBV免疫的人群中，急性HBV感染在乙型肝炎e抗原(hepatitis B e antigen，HBeAg)阳性母亲所生的新生儿中易于发生向慢性感染状态的转变。这表明由于早期机体免疫功能尚未成熟，以母婴传播为主的HBV感染是导致发生慢性感染的重要危险因素。在我国大陆地区，成年人在感染HBV后，机体会产生免疫清除机制，8.5%的成年人在感染HBV后会发展为慢性携带者，而且C2亚型是急性乙肝慢性化的主要危险因素^[8]。乙肝病毒编码的蛋白如HBeAg，能够通过抑制机体内的免疫系统功能来促使HBV感染的慢性化。此外，不同HBV亚型的致病力有较大差别，如HBV B2亚型常引起急性感染，C2亚型与HBV慢性化相关，并且在HBV混合型感染中以C2亚型为主^[8]。其中部分HBV慢性携带者将会进一步发展成为CHB、LC和HCC等。

HBV是一种高度复制的DNA病毒，在慢性感染者体内，每天约产生10¹¹个病毒颗粒释放到外周血中^[9]。HBV的复制过程需首先形成cccDNA，转录为RNA后，再通过病毒自身基因编码的RNA聚合酶反转录成负链DNA，而该聚合酶没有校对功能，导致HBV在复制过程中出现点突变、缺失、插入等变异时，无法及时进行校对与更正。在HBeAg阳性的HBV感染者体内，HBV突变率4.57×10^-5核苷酸替换/(位点·年)^[10]。 除了病毒自身因素外，机体的免疫压力也会促使HBV变异的产生，如HBV基因组对多种载脂蛋白B mRNA编辑酶(APOBEC3s)的剪接作用比较敏感^[11]。在HBV感染的肝细胞系中，活化诱导的胞嘧啶核苷脱氨酶(activation-induced cytidine deaminase，AID)的表达会促使HBV基因组发生C-T和G-A的突变。炎症介质也可以通过氧化应激，促进病毒基因组不稳定产生突变。这些突变大部分由于功能缺陷等原因被机体免疫清除，只有极少部分的突变能够逃脱免疫而存活。被选择下来的相关HBV变异常能够起到增强病毒毒力、抵抗抗病毒治疗、促进细胞附着和改变抗原表位逃避机体免疫应答等作用^[12]。HBV的相对较高复制率和突变率，构成了HBV在机体内进化的基础。

人类的肝脏中富含大量的先天性和获得性免疫细胞及免疫分子，这些免疫细胞在炎症微环境中通过细胞因子/趋化因子形成一个动态的炎症网络^[13]。在HBV慢性感染者体内，外周血中病毒颗粒的半衰期为1.2 d，表明每天有将近一半的HBV病毒被机体的免疫系统所淘汰^[9]。HBV在机体内的清除方式主要有体液免疫和细胞免疫，如相关pre-S1/pre-S2/S区的突变，减少了CD8⁺T细胞的抗原识别位点，降低了被免疫细胞清除的可能^[14]。此外，在肝细胞中，“野生型”序列的HBV(HBcAg和HBeAg均阳性)易被细胞毒性T淋巴细胞(cytotoxic T lymphocyte，CTL)介导的细胞清除机制所清除，而由于突变导致HBeAg阴性的HBV则不易被清除^[15]。

由HBV的持续性感染导致机体CHB的发生，在病毒基因组发生突变后，炎症微环境对这些突变具有特定方向的选择作用。如pre-S删失、 C1653T、T1753V和A1762T/G1764A随着ASC、CHB、LC、HCC不同疾病状态的恶化，变异频率不断增加(P_trend<0.001)^[16]。但这些重要HCC相关变异如A1762T/G1764A，在初次感染过程中，却不易通过母婴传播传递给新生儿^[17]，表明了HBV在垂直传播后重新“进化”。此外G1896A、C1653T、A1762T/G1764A、T1753V、G2946A/C、C1T/A、A7C、pre-S删失等HBV变异的频率随年龄增大呈上升趋势(P_trend<0.05)^{[4, 17]}，进一步证明了机体对这些HCC相关变异的不断选择作用。

在机体免疫压力的选择下，具有生存优势的HBV变异被保留下来，这些变异常具有增强病毒复制、上调HBV自身表达等作用。其中HCC相关的HBV变异在炎性微环境中由不完整的免疫选择出来，转而进一步促使向HCC恶性转化^[18]。研究表明，位于pre-S区和EnhⅡ/BCP/PC区的基因突变与LC或HCC密切相关。经过多因素回归分析，发现A2964C、T3116C、A1762T/G1764A、T1768A、A1846T等突变是LC的独立危险因素^[19]，而A2962G、C2964A、C3116T、pre-S1删失、pre-S2起始密码子突变、T53C、C1653T、T1674C/G、T1753V、A1762T/G1764A等突变是HCC的独立危险因素^{[5, 19]}。 这些突变的组合和HBeAg阳性在HBV慢性感染者的体内，对LC或HCC有更明显的促进作用。其可能机制为; HBV基因组全长中的相关突变在人肝细胞和癌细胞中，通过激活E2F1转录子上调S期相关蛋白激酶2(S-phase kinase-associated protein 2，SKP2)的表达，下调细胞周期抑制素，加速了细胞增殖分化^[20]。与pre-S区的“野生型”相比，“突变型”更容易使病毒保留在细胞内，从而促进细胞恶性转化。BCP区中的C端截短型HBx蛋白，失去了其抑制细胞增殖和转化的能力，但却可以结合p53基因，减弱DNA修复和p53介导的凋亡作用，有助于癌症的形成^[21]。而A1762T/G1764A与T1753A、T1768A的组合突变可下调p21的表达，上调细胞周期蛋白E(cyclin E)和SKP2的表达，加快细胞周期，促进HCC进程。因此，失衡的免疫反应、宿主DNA的损伤、HBV pre-S区和EnhⅡ/BCP/PC区的基因突变以及病毒与宿主的交互作用都是导致HBV相关非可控性炎症向HCC转化的重要原因。

HBV致HCC的慢性过程中，肝脏的慢性炎症微环境起到了至关重要的作用。炎症细胞和炎症因子作用下的氧化应激状态使体细胞的基因组表现出不稳定性。如AID的异常表达会导致p53和β-catenin等基因发生突变的频率升高^[18]，而慢性炎症肝脏组织中AID常过高表达。针对HBV相关的HCC患者全外显子深度测序发现，在331个非同义突变中，主要的突变方式为C-G突变为A-T、T-A转换为A-T^[22]。此外，HBV慢性感染所诱导的体细胞突变，在慢性炎症状态下也时常发生。上述现象提示，炎症微环境是导致大量体细胞突变的关键因素，而出现突变的肝细胞也被自身免疫和生存竞争所“选择”。

正常肝细胞转变为HCC细胞时，除了HBV的直接作用外，肝细胞自身的突变也具有关键作用。在炎症微环境中，具有一定的生存优势的与HCC相关的变异被机体选择下来。基于肝癌细胞和癌旁细胞的基因组或外显子深度测序发现了众多癌症相关的体细胞突变。如HCC相关的突变主要集中于p53/RB通路、Wnt通路、RAS/PI3K通路等。综合分析得出，在HCC细胞中，MYC、MET、CCND1等基因表达上调，而TP53、CDKN2A、RB1等基因表达缺失^[23]。染色质重塑基因ARID1A的突变率在HBV相关的HCC细胞中达到13%，该基因具有明显的抑癌作用，故这些突变导致了抑癌功能的丧失。HCC相关的体细胞基因改变常与染色质的重塑相关，集中于Wnt和TP53通路，如在Wnt通路中，AXIN1和APC的失活率分别达到15.2%和1.6%，而TP53失活率达到20.8%^[24]。这些被选择出来的体细胞突变在炎症微环境下具有“生存”优势，进一步促使肝细胞向HCC细胞恶性转化。

HBV慢性感染导致相关LC或HCC的形成，除病毒与体细胞共同进化外，不同宿主自身的遗传背景差异也起到了重要作用。如HBV致HCC的过程中，常伴随着信号转导及转录激活因子3(STAT3)的高表达^[25]。STAT3重要位点的单核苷酸多态性(single nucleotide polymorphism，SNPs)会影响信号转导后STAT3的表达与活化，对炎性疾病和癌症有重要意义。另外，人类白细胞抗原(HLA)在抑制HBV感染的免疫反应中扮演着重要角色。其中HLAⅠ类分子复合物参与CD8⁺T细胞对HBV抗原的识别与清除作用。HLA Ⅱ类分子可分为3种类型：HLA-DR、HLA-DQ和HLA-DP。他们在基因相关位点的多态性导致了免疫细胞抗原提呈表位的先天差异性，在T淋巴细胞对HBV抗原的识别、结合等过程中起到关键作用。

STAT3 基因位于17号染色体，是JAK/STAT通路中主要的节点分子。一些细胞因子和生长因子如IL-6、肝细胞生长因子可激活STAT3，后者以二聚体的形式转入核内，调节基因表达。STAT3通路的异常活化，会促使癌症进程，如HBV编码的HBx蛋白可持续激活STAT3。而且突变型的HBx较野生型能更加显著提高STAT3活化程度。我们对STAT3的多态性研究发现，rs2293152突变型(CG和GG)与T1674C/G、A1762T/G1764A的形成显著相关，提示该突变型对HBV变异的选择作用。rs1053004 TC基因型与T1674C/G的交互作用以及rs4796793 GG基因型与pre-S2起始密码子突变的交互作用，均可显著增加致HCC的患病风险^[26]。此外，另一节点分子STAT4单核苷酸位点rs7574865的G等位基因，是HBV致HCC的独立危险因素(P_meta=2.48×10^-10，OR=1.21)^[27]。

研究表明，HLA-DR基因的多态性会影响机体的免疫反应以及众多疾病的结局，因此在HBV慢性感染过程中也起到了作用。其中，HLA-DR*01位点的等位基因会增加机体对HBV的清除率，而HLA-DR*03位点的等位基因易导致HBV慢性感染状态的形成。HLA-DQ rs9275319位点的主要基因型与HBV慢性感染正相关，显著增加了促进HCC风险的pre-S1起始位点变异；而HLA-DQ的 rs2856718位点的低频基因型显著增加C型HBV慢性感染者发生LC的风险，但显著降低了发生 HCC的风险，可能与rs2856718低频基因型显著增加1种增加LC危险性、降低HCC-风险的HBV变异有关。在C型HBV慢性感染者中rs2856718低频基因型(AG+GG)与增加HCC危险的病毒变异T1753V交互作用显著降低LC风险(OR=0.26,95% CI=0.09~0.78)；而rs2856718低频基因型(AG)与增加LC风险的病毒变异C1673T显著增加HCC危险(OR=2.80,95% CI=1.02～7.66)^[28]。HLA-DPA1和HLA-DPB1区的多个位点多态性与HBV在体内的慢性感染以及清除相关。其中rs3077、rs3135021和rs9277535的变异型均降低HBV感染的慢性化，而变异型rs2281388会增加慢性感染的风险。进一步研究基因型与HBV变异的交互作用发现，T1674C/G、G1719T和rs9277535 GG基因型的交互作用在基因型C的患者体内会显著增加患HCC的风险^[29]。由此可见，相关HBV变异对LC和HCC的促进作用，取决于HLA-DR、HLA-DQ和HLA-DP等宿主基因多态性的遗传背景。

从HBV急性感染转化为慢性感染状态，再到促使肝脏疾病状态的恶化，是一个常在机体内维持几年到几十年的慢性过程。HBV在机体慢性感染状态下，每天会产生大量的病毒颗粒释放到血液中去，而绝大部分的病毒颗粒又被机体免疫清除。只有那些改变病毒抗原位点、影响病毒毒力的HBV变异株，才能逃避机体的免疫压力。病毒的高复制率和较高的突变率，以及机体相应的免疫清除与选择，构成了HBV在体内“进化”的基础。这些被选择出来的突变可在体内不断复制，进一步促使肝脏疾病的恶性进展，如HCC的发生。

由于病毒的嗜肝性，HBV的慢性感染者常伴随着肝脏的慢性炎症，而炎症微环境又成为了HCC形成的基础。在炎症细胞和炎症因子的长期刺激下，机体基因组也发生相应的基因突变，被动地选择出适应细胞生存的基因变异，常表现为原癌基因的激活、抑癌基因的失活。而这些功能性的体细胞突变，加速了癌症的发生与转移。因此，HBV和机体基因组在特定环境下均发生了“变异-选择-适应”的进化过程。不同个体之间的遗传背景差异，如STAT通路和HLA的相关基因多态性与相关疾病进程密切相关。由此可见，HBV与体细胞基因组共同进化，以及相关遗传背景共同导致了HBV相关HCC的发生，这对我们认识癌症的发生与防治提供了一个新的思路。