2015, Vol. 36
2. 第二军医大学长海医院肛肠外科, 上海 200433
2. Department of Colorectal Surgery, Changhai Hospital, Second Military Medical University, Shanghai 200433, China
结直肠癌(colorectal cancer，CRC)是我国常见癌症。在上海随着人口老龄化和饮食结构西化，CRC已经上升为男女恶性肿瘤发病率的第二位[1]。尽管患者对治疗的应答率和存活率都有所提高，但转移期患者的预后仍不乐观，是我国公共卫生问题。
1 炎症促进CRC进化发育持续性炎症是许多癌症共有的过程。肿瘤微环境中富集的免疫细胞与正常免疫细胞不同，它能维持炎症状态、新血管生成、促进癌症发生和转移。慢性炎症为癌症进化发育提供了微环境，其中包括NF-κB 等保守基因高表达造成的持续炎症状态、免疫细胞对病毒变异的选择以及氧化应激对“驱动”变异的选择等诸多进化问题[2]。炎症持续活跃是形成癌症的前提条件，NF-κB和信号转导和转录因子(STAT3)-转化生长因子(TGF)β1等炎症信号关键分子均参与致癌过程，而且癌前病变组织中炎症持续活跃能促进癌症干细胞 “变异-选择-适应”的进化过程。我们前期研究发现，CRC自身抗体可以在癌前病变如锯齿状腺瘤性息肉患者血清中高表达，为癌症早发现提供新指标[3]。从致癌因素暴露引发遗传损伤和持续炎症反应，继而导致表观遗传学改变、基因突变和免疫选择，经过一系列癌前变化最后发展到癌症乃至侵袭转移的整个过程代表了癌症的进化发育过程。
2 CRC癌前病变和侵袭的早期分子事件CRC有明确的癌前病变过程，除了5%～6%的病例为家族性CRC，大部分的CRC都是由环境与遗传因素共同作用导致的[4]。大量流行病学和实验室证据表明慢性炎症促进CRC的发生，其中受前列腺素E2(PGE2)调控的环氧合酶2(COX-2)在CRC发生过程中发挥了重要作用。长期使用非类固醇类抗炎药物如阿司匹林能够显著降低CRC的发生[5]。在炎症促进癌症进化发育过程中，癌前病变是炎症致癌的重要步骤。高危腺瘤是重要的CRC癌前病变，为肠镜筛查的重点。肠镜下息肉摘除可以显著降低5年内CRC发病风险，但对5年后CRC发病影响不大[6]。肠镜筛查后5年内发生CRC的癌组织中CpG 岛甲基化表型(CpG island methylator phenotype,CIMP)和微卫星不稳定(microsatellite instability,MSI)显著高于筛查5年后发生的CRC，提示CIMP和MSI在CRC迅速进化中的重要性[7]。有报道提出，CIMP高表达的CRC患者对氟尿嘧啶(5-FU)化疗的反应更好。5-FU化疗抗药性的主要机制是胸苷酸合成酶(tymidylate synthase，TYMS)的表达升高，并且TYMS的表观遗传调控可能与组蛋白乙酰化/脱乙酰化过程相关。因此，识别分子标志物诸如DNA甲基化生物标记在CRC早期诊断、发生、侵袭转移、预后和治疗等过程中都有指导意义。
2.1 关键炎症信号通路的作用Wnt信号通路的持续激活首先打破了正常肠上皮细胞“增生-分化-凋亡”的平衡状态，是促进肠腺瘤生成的主要信号途径。在癌症信号刺激下，腺瘤通过积累遗传变异逐渐发展成腺癌。克服衰老是腺瘤恶性转化的关键步骤，包括通过激活hTERT促进端粒酶稳定、通过ATM基因突变或p53和RB信号途径效应分子的失活导致DNA损伤修复系统的破坏、以及通过干扰一些重要信号途径如白细胞介素(IL)-6等发挥作用。腺瘤恶性转化表现为生长加速、分化紊乱、侵袭能力和新血管生成能力被激活，染色体不稳定性(chromosomal instability，CIN)大量增加。肠道微生物产物导致肠道炎症性损伤，激活炎症信号途径，其中免疫/炎症细胞浸润、IL-17信号途径促进腺瘤性息肉向CRC转化，而肿瘤间质髓样细胞产生的IL-23信号通路维持了CRC的进化[8]。Wnt/β-catenin信号途径的活化，刺激肿瘤起始细胞的增殖、分化，促进CRC的形成[9]。
CRC的侵袭是指癌细胞穿过基底膜进入下层基质，是CRC恶性表型的主要特征。该过程在肿瘤炎性微环境中出现类似于伤口修复的主要改变，即肿瘤特异性基质细胞激活和新血管生成。主要表现为侵袭相关基因(SPARC、DCN和PDGFRB)、新血管生成基因(EREG和COL15A1)、CIN相关基因(AURKA、C20orf24和TPX2)、分化相关基因(ADRM1和NUDT1)以及间质激活相关基因(SSSCA1、ID3和LUM)的表达，生长因子相关通路如磷脂酰肌醇3激酶(PI3K)信号通路活跃[10]。PI3K通路中PIK3CA基因突变可以改变PI3K通路活性，促进腺瘤向腺癌转化。
CRC的发生和侵袭表型特征是由功能基因表达所致。一般认为，单个基因甚至单个信号途径难以准确反映肿瘤形成机制，全基因组范围表达谱的差异能够从整体水平揭示肿瘤形成过程中基因表达的变化规律，进而发现起关键作用的基因、RNA、蛋白、关键分子调控功能网络和网络核心分子。我们应用系统生物学方法整合了目前公共数据库中CRC基因表达谱，建立了预后相关亚网络，发现网络核心分子GRB2、 PTPN11、 ITGB1和POSTN在癌细胞中表达差异能够指示CRC预后和化疗效果，对Ⅱ期CRC作用尤其明显[11]。
2.2 染色体遗传改变、先天遗传多态性和后天体细胞基因突变腺瘤恶性转化过程中最明确的遗传改变是MSI和CIN显著增加。腺瘤恶性转化中最具有特征性的染色体改变是染色体20q扩增，引起该染色体上的癌相关基因AURKA和TPX2表达增强。目前认为染色体20q扩增是腺瘤向腺癌转化的主要驱动分子，少量存在20q扩增的高危腺瘤更容易转化为癌症[12]。
在炎症性肠病向CRC转化过程中，CRC起始细胞的遗传易感性决定了在外界刺激条件下肠道炎症的持续性和CRC的发生。家族性腺瘤性息肉病(familial adenomatous polyps,FAP)是一种CRC癌前病变，由Wnt信号通路主要功能基因先天变异所致。研究发现，在能够调控细胞衰老的信号途径中，毛细血管扩张突变基因(ATM)-ATM和Red-3相关蛋白(ATR) DNA 损伤修复通路中的RNF43基因功能缺失型先天变异与多发性锯齿状息肉密切相关[13]。基因组关联性研究发现，位于染色体8q24的CRC相关单核苷酸多态性(single nucleotide polymorphism,SNP)位点rs6983267能够影响Wnt调节转录因子TCF4的结合能力，增强Wnt信号和癌基因Myc表达，并可改变转录因子TCF7L2与CTNNB1的结合能力，从而影响阿司匹林通过 Wnt/β-catenin信号途径对CRC的化学预防作用[14]。这些炎-癌转化信号通路上关键分子的遗传多态性可部分解释中国人CRC发生的遗传易感性。
CRC发生和发展是慢性炎症促进关键基因后天突变累积的过程。在锯齿状息肉发生早期就存在BRAF或K-RAS的变异，在CRC早期还存在PIK3CA变异。这些变异通过影响炎症信号途径如ERK/MAPK发挥促癌作用[15]。APC失去功能的变异和K-RAS获得功能的变异是腺瘤向腺癌转化过程中的常见变异。在溃疡性结肠炎发展到CRC的过程中，p53失活性突变是癌细胞克隆形成的必要突变，而K-RAS获得功能的突变是补充突变，这两种突变在CRC形成过程中起关键作用[16]。K-RAS变异可通过诱导上皮间质转化(epithelial-mesenchymal transition，EMT)而活化癌症起始“干”细胞，促进有APC变异的腺瘤发生癌变和侵袭。人类癌细胞中RAS变异与8-氧桥鸟嘌呤-7，8-二氢-2’-脱氧鸟苷(8-oxo-dG)特异性降解酶MTH1(Mut T Homolog 1)的表达水平正相关。MTH1表达对维持肿瘤细胞基因组稳定性和肿瘤“干性”特征至关重要。APC失活可启动β-catenin信号途径；K-RAS变异可通过诱导CD44、CD133和CD166表达，进一步促进“干性”肠癌的β-catenin信号途径的活化[17]。PI3K信号途径突变是近端结肠癌的特征性变异，其中PIK3CA外显子20突变和重要肿瘤抑制基因PTEN突变与无蒂锯齿状信号 途径(MSI-H/CIMP-H/B-RAF突变)有关，PIK3CA外显子突变与传统锯齿状信号途径(CIMP-L/K-RAS 突变)有关[18]。可见，PI3K信号途径是阻遏CRC发生和侵袭的重要治疗靶点。
2.3 表观遗传和非编码RNAs炎症促进癌症进化，各阶段均受表观遗传和遗传改变所驱动，且表观遗传变化比遗传改变更为普遍。目前公认CRC是由基因突变和表观遗传修饰累积的结果。表观遗传修饰的主要形式有基因组甲基化、组蛋白乙酰化、染色质重塑和非编码RNA(ncRNA)的异常。CRC中经常可以观察到异常的基因启动子甲基化。从正常肠上皮、腺瘤到侵袭性CRC进化过程中，CIMP具有明确的规律性：CIMP标志RUNX3最早出现CpG岛甲基化；在息肉增生期，CIMP标志NEUROG1和CACNA1G出现甲基化；在晚期腺瘤性息肉期，SFRP2和IGF2 DMR0高度甲基化；最后到CRC期，CIMP标志CDKN2A和hMLH1甲基化。DNA甲基转移酶3B(DNMT3B)表达水平在这个进化过程中逐渐升高。 一组 CIMP标志(NEUROG1、CACNA1G和CDKN2A)的甲基化与DNMT3B的表达水平显著正相关[19]。发生在近端结肠高度CIMP的CRC常因错配修复基因MLH1被甲基化后沉默导致MSI，常伴有BRAF突变；该类CRC常有染色质重塑基因CHD7和CHD8的突变，CHD7和CHD8是赖氨酸特异性去甲基化酶家族成员，这种突变与p53失活突变相反，提示CHD7和CHD8的突变与p53突变启动信号途径明显不同[20]。
我国科学家最近发现了能够准确区分结直肠腺瘤和早期CRC的microRNAs(miRNAs)[21]。国外研究报道miRNA-141和miRNA-200c影响上皮分化，miRNA-145、miRNA-135a和miRNA-135b作用于Wnt信号通路[22]。另有研究发现与CRC侵袭过程相关的ncRNAs，包括miR-137、miR-30b和miR-224等[23, 24, 25]。
3 腺瘤-CRC-侵袭过程中的进化问题肠腺瘤是由多克隆细胞组成，在CRC炎-癌转化过程中，部分细胞发生体细胞突变，如APC、B-RAF、p53、K-RAS的变异和染色体5q、17p和18q的缺失[26]。在由溃疡性结肠炎发展成CRC的患者中，主要起始体细胞变异为p53变异，且在大多数CRC中均会发生；在此基础上，部分结肠炎患者发生K-RAS变异，这些体细胞变异赋予了肠上皮细胞无限增殖的能力，最终形成CRC。从进化角度来说，在炎症环境下只有发生了关键体细胞变异的克隆具有生长优势进而被选择出来，成为CRC主要克隆。同时，这些克隆表达Wnt/β-catenin的能力增强，引起炎症的持续活跃，进一步选择了具有转移潜能的“干性”CRC克隆，具备这些变异的克隆能够适应持续的炎症环境，成为CRC复发和转移的基本亚群。我们前期研究发现，一种位于细胞核内的神经元再生所必须的孤核受体NR4A2在炎癌转化中起重要作用[27, 28]。伴随NR4A2在腺瘤、癌旁组织和CRC组织中表达水平的逐渐增高，能够赋予CRC细胞化疗抵抗能力，而且NR4A2高表达的结肠癌患者生存期显著缩短，尤其是在接受化疗治疗结肠癌人群中更加明显[29]。我们还发现，在CRC中表达锌指蛋白148(ZNF148)增高预示CRC不良预后[30]。这些研究提示，在CRC组织中存在促进癌症进化的“干性”分子对CRC的预后有明显的指示作用。结肠癌和直肠癌基因组变异谱基本相同，如APC、p53、SMAD4、PIK3CA、K-RAS、ARID1A、SOX9基因发生变异，FAM123B，ERBB2和IGF2基因拷贝数改变，NAV2基因和Wnt通路分子TCF7L1基因融合以及Myc调控的转录激活或抑制，其中ERBB2和IGF2可以作为药物靶标[31]。炎性因子激活的胞苷脱氨酶(AID)促进肠上皮细胞的基因组不稳定，不但能促进CRC的发生，而且其相对应的人类APOBEC3G亚型还能促进CRC的肝转移[32]。CRC细胞克隆之间的基因组拷贝数变异、基因变异以及细胞生长优势的差异在化疗抵抗方面具有重要作用[33]。
4 研究展望在炎症或其他因素诱导的体细胞基因变异是癌症发生和侵袭的主要驱动力。少量的癌症起始细胞是癌症发生、复发、转移和耐药的关键[34]。癌症是突变积累的结果，以胞苷脱氨酶APOBECs家族为基础的突变基因簇是许多癌症共有的，在癌症体细胞变异的形成和进化中起关键作用[35]。国际癌症基因组联盟(International Cancer Genome Consortium,ICGC)开展的癌症基因组项目(Cancer Genome Project)，计划在5～7年内完成2 000～3 000 个癌症基因测序。 ICGC在中国发起4个新项目，主要针对CRC、食道癌、肝癌和鼻咽癌的驱动基因进行检测。此外，由美国癌症研究中心(National Cancer Institute)及人类基因组研究中心(National Human Genome Research Institute)为主共同构建的癌症基因组图谱(The Cancer Genome Atlas，TCGA)，绘制了各种常见和罕见的癌症基因组图谱。研究CRC的进化规律，尤其是研究体细胞变异的主要目的是明确这种变异影响了何种信号途径，而信号途径是目前探索早期CRC的有效干预方式和CRC靶向治疗的关键。
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