原发性肝细胞癌(hepatocellular carcinoma,HCC)是一种受多因素影响、多基因调控的复杂疾病，病死率居恶性肿瘤第二位^{[1, 2]}。探讨HCC发生发展相关的因素及分子机制，有助于寻找肝癌早期诊断、转移和复发预测的生物学标记和治疗靶标，对于疾病的诊疗及预测预后具有重要的临床意义。

膜联蛋白(Annexins，ANX)是一类Ca²⁺依赖的磷脂结合蛋白，研究发现该基因家族中多个分子与包括肝癌在内的多种肿瘤的发生、发展密切相关^[3]。其中膜联蛋白 A7(ANXA7)在一些组织中表现出肿瘤抑制基因的活性^{[4, 5, 6, 7]}，但是其是否与肝癌的发生存在潜在的关联尚不清楚。本研究分析了ANXA7表达与肿瘤的相关性。通过筛选与ANXA7抗肿瘤相关的信号分子，进一步探讨了其调节机制，为进一步阐述HCC发生、发展机制及寻求HCC防治新方法提供新线索。

收集48对肝癌组织及其癌旁组织，新鲜冰冻，存放于液氮中。组织标本均来自第二军医大学东方肝胆外科医院，并获得患者的知情同意；人正常肝细胞L02与人肝癌细胞LM3、SMMC7721、Huh7、HepG2、MHCC97H均购自中国科学院细胞库。以上细胞用DMEM培养基(含10%胎牛血清，Gibco公司)，培养条件为5% CO₂、37℃，细胞培养至对数生长期备用。

以人正常肝细胞L02的cDNA为模板，经PCR法扩增获得胰岛素样生长因子结合蛋白2(IGFBP2)和含融合蛋白HA标签的人ANXA7的DNA片段，分别插入真核表达载体pcDNA3.0的多克隆位点BamH Ⅰ和XbaⅠ，构建重组载体pcDNA3-HA-ANXA7和pcDNA3-IGFBP2。测序法筛选鉴定阳性克隆。

采用Invitrogen公司Lipofectamine^TM 2 000试剂进行细胞瞬时转染，按试剂盒标准流程操作。脂质体-核酸复合物加入培养细胞5 h后更换含血清培养基，在37℃、5% CO₂条件下继续培养。

将pcDNA3-HA-ANXA7过表达质粒以及对照质粒pcDNA3.0分别瞬时转染人肝癌细胞系SMMC7721，分析ANXA7过表达对细胞增殖的影响。此外，也以siANXA7以及各自的阴性对照转染SMMC7721，分析ANXA7表达抑制对细胞增殖的影响。 细胞铺于96孔板，分别在转染后0、12、24、36和48 h，按每孔10 μL加入CCK-8试剂，继续培养2 h后，使用酶标仪测定450 nm光密度D₄₅₀，来分析细胞的增殖。

采用Thermo Scientific公司的ProFound^TM HA Tag IP/Co-IP Kit。将SMMC7721细胞铺于6孔板中，24 h后待细胞融合度达到90%左右时将质粒(pcDNA3-HA-ANXA7和pcDNA3-HA)按4 μg/孔的量转染细胞。转染后48 h加入细胞裂解液裂解细胞。细胞裂解采用温和的裂解条件，不能破坏细胞内存在的所有蛋白质-蛋白质相互作用，采用非离子变性剂Triton X-100,细胞裂解液中加入酶抑制剂混合物。将离心柱装入离心管中，并在离心柱中加入适量的细胞裂解液。 反复颠倒使含有抗HA标签的琼脂糖匀浆充分混匀。按照每离心管10 μL的量(含有5 μg anti-HA抗体)将琼脂糖匀浆加入离心管中，盖紧离心管盖，4℃孵育过夜。将收集管接于离心柱之下，短暂离心，弃滤液。按照每管0.5 mL的量将Tris生理盐水-吐温缓冲液 (TBST，10 mmol/L Tris-HCl,pH 7.5,150 mmol/LNaCl,0.05%Tween-20)溶液加入离心柱中。盖上盖子，轻柔颠倒混匀2～3次，短暂离心，弃去滤液。重复步骤两次。将离心柱装入一新的收集管中。加入25 μL2×非还原样品缓冲液，轻柔混匀。将离心柱置于95× 100℃热激5 min，13 500×g离心1 min。在收集的样品中加入2~3 μL 1 mol/L的二硫苏糖醇(dithiothreitol，DTT)，样品立即进行SDS-PAGE。考马斯亮蓝染色、观察、切胶、质谱分析。

SDS-PAGE进行后凝胶用电泳法转至PVDF膜，室温下使用封闭液封闭2 h，TBST缓冲液洗涤10 min×3次，根据说明书所示的稀释比，使用抗体稀释液稀释一抗，一抗工作液在4℃条件下孵育过夜。免疫共沉淀结合蛋白免疫印迹的检测中，采用一抗为兔抗-IGFBP2 抗体(Santa Cruz公司)。在ERK1/2磷酸化水平的蛋白免疫印迹检测中，采用一抗为小鼠抗-β-actin 单抗，小鼠抗p-ERK1/2单抗和小鼠抗ERK1/2单抗(均购自Cell Signaling)。TBST洗涤10 min×3次，室温下使用封闭液进行二次封闭2 h，TBST洗涤10 min×1次，使用抗体稀释液稀释标记二抗，二抗工作液在37℃条件下孵育2 h，TBST洗10 min×3次。加入显色底物DAB暗处作用1 min，双蒸水终止显色。其中，β-actin作为蛋白定量的内参照。

采用QuikChange site-directed mutagenesis kit (Stratagene,Agilent Technologies,Palo Alto,CA)试剂盒，对已构建的包含人IGFBP2序列的pcDNA3-IGFBP2质粒中的RGD序列进行点突变。以pcDNA3-IGFBP2质粒为模板，进行突变链合成反应，反应体系如下：10×反应缓冲液 5 μL，dNTP mix ( 2.5 mmol/L each dNTP) 5 μL，质粒模板 (总量约5～50 ng) 0.5 μL，上下游引物各1.25 μL (10 μmol/L)，PfuTurbo DNA 聚合酶1 μL，双蒸水(ddH₂O) 补齐50 μL，混合物加入平头薄壁PCR管中，充分振荡混匀后，稍离心，然后按下列条件进行反应：95℃预变性30 s；循环条件为95℃变性30 s，55℃退火1 min，68℃延伸6 min，共18个循环。所得PCR产物取5 μL进行琼脂糖凝胶电泳，观察产物条带。剩余反应产物进行Dpn Ⅰ限制性酶切消化。感受态细胞转化、挑克隆、测序鉴定阳性突变质粒及突变位点。

通过荧光实时定量PCR检测48例肝癌患者的癌与癌旁组织中ANXA7 mRNA的变化，结果显示相较癌旁组织，ANXA7在癌组织中表达下调(0.87±0.56 vs 4.26±2.14，P<0.01)； ANXA7在5种肝癌细胞系LM3、SMMC7721、Huh7、HepG2、MHCC97H中mRNA水平均低于正常肝细胞L02(P<0.01，图 1)。

图 1 ANXA7 mRNA在不同肝细胞系中表达分析 Fig 1 ANXA7 mRNA expression analysis in different hepatoma cell lines **P<0.01 vs L02 liver cell line. n=3,x±s

结 果显示，转染36 h和48 h时pcDNA3-HA-ANXA7转染组较pcDNA3.0空载体转染组的CCK8检测值降低(P<0.05，图 2)，提示上调ANXA7表达能够抑制肿瘤生长,而下调ANXA7的表达促进肿瘤细胞增殖(P<0.01，图 2)。

图 2 ANXA7表达对人肝癌细胞SMMC7721增殖的影响 Fig 2 ANXA7 increased proliferative activity of hepatic cancer SMMC7721 cells *P<0.05 vs pcDNA3-HA；△△P<0.01 vs siRNA negative control. n=6,x±s

差异电泳条带分离后的结果显示，ANXA7能与IGFBP2结合。经重复实验，该蛋白特异性存在免疫共沉淀的结合蛋白组分中。通过蛋白免疫印迹法反向验证，结果进一步提示两者在肝癌细胞系SMMC7721中存在结合作用(图 3)。

图 3 免疫共沉淀法筛选及验证ANXA7相互作用蛋白 Fig 3 Identification and validation of binding protein with ANXA7 by co-immunopricipitation A: SDS-PAGE analysis of the ANXA7 binding protein with ANXA7 after co-immunopricipitation; B: Western blotting analysis of insulin-like growth factors binding protein 2 in co-immunopricipitation samples with ANXA7. Protein marker: Page Ruler Prestained Protein Ladder (Fermentas). M:Marker; 1: pcDNA3-HA; 2:pcDNA3-HA-ANXA7

结果突变组未能检测到IGFBP2的存在。结果提示，ANXA7可通过IGFBP2上RGD序列介导与IGFBP2结合(图 4)。

图 4 IGFBP2的RGD序列突变分析 Fig 4 Mutation analysis of RGD sequence in IGFBP2 IGFBP2: Insulin-like growth factors binding protein 2. A:Schematic diagram of mutation site in IGFBP2; B:Western blotting analysis of IGFBP2

结果显示，肝癌细胞中ANXA7与IGFBP2共表达的细胞比仅表达ANXA7细胞的磷酸化ERK1/2蛋白水平低，提示过表达ANXA7能抑制IGFBP2激活的ERK1/2的磷酸化水平；反之，ANXA7的特异性干扰则使IGFBP2活化ERK1/2的作用进一步增强(图 5)。

图 5ANXA7影响IGFBP2激活的ERK1/2磷酸化的蛋白免疫印迹分析 Fig 5 Effect of ANXA7 on IGFBP2 activated ERK1/2 phosphorylation as shown by Western blotting analysis IGFBP2: Insulin-like growth factors binding protein 2. A:SMMC7721 cells were co-transfected with IGFBP2 and ANXA7 expressing plasmids.B:SMMC7721 cells were co-transfected with IGFBP2 expressing plasmid and siANXA7. Non-specific siRNA was used as control

ANX是一类钙依赖的磷脂结合蛋白。其中某些成员的功能异常可引起肿瘤细胞增殖调控异常，结构缺失或改变影响肿瘤转移潜能；部分膜联蛋白还具有影响肿瘤凋亡和分化的功能^{[10, 11, 12, 13]}。ANXA7是最早被分离纯化出来的膜联蛋白，以往的研究发现ANXA7在一些组织中表现出抑制基因活性，其表达失调与肿瘤进展和预后密切相关^[14]。据报道，在4 061例包含多种肿瘤的组织芯片结果中发现ANXA7表达下调^[6]，这与本研究中病例样本和肝癌细胞中的结果一致。

本研究进一步通过免疫共沉淀实验发现ANXA7与IGFBP2能发生特异性结合，鉴于IGFBP2的RGD序列是与多种蛋白结合的关键位点，推测其与ANXA7结合也极有可能通过该位点介导。因此通过定点突变法得到IGFBP2的RGD位点突变质粒，采用免疫共沉淀结合蛋白免疫印迹的方法确定了ANXA7与IGFBP2的结合是通过IGFBP2中RGD序列介导的。

IGFBP2是一种在人的多种体液和组织中均有表达的分泌蛋白，属于IGF系统的组成成员，参与重要的网络调控，调节多种细胞过程^{[15, 16]}，激活ERK1/2、SAPK/JNK和p38途径^[8]，并且能升高ERK1/2、SAPK/JNK的磷酸化水平^[9]。其中，ERK的信号转导 (Ras-Raf-MEK-ERK)被多种生长因子、细胞因子及促分裂剂激活，在细胞的增殖和分化调控中发挥重要作用，是多种信号的交汇点或共同通路^{[17, 18]}。本研究发现，IGFBP2在肝癌中能够激活ERK1/2的磷酸化，在此基础上进一步分析了ANXA7是否通过IGFBP2参与了对ERK1/2磷酸化的调节作用。结果显示在IGFBP2存在的情况下，下调ANXA7表达能使ERK1/2的磷酸化水平升高，很好地解释了ANXA7抑制肝癌细胞生长的作用。我们后续将针对IGFBP2进行干预，观察其被干预后对肝癌细胞增殖的影响，进一步说明ANXA7与IGFBP2在功能上的相关性。