第二军医大学  2015, Vol. 36 Issue (2): 155-160   PDF    
引用本文
郭慧军, 叶辛, 顾海慧, 查占山, 臧艳, 钱宝华. 成人原发免疫性血小板减少症患者外周血Th9细胞的表达及其临床意义. 第二军医大学学报, 2015，36(2): 155-160  
GUO Hui-jun, YE Xin, GU Hai-hui, ZHA Zhan-shan, ZANG Yan, QIAN Bao-hua. Th9 cells in peripheral blood of adult patients with primary immune thrombocytopenia and its clinical significance. Academic Journal of Second Military Medical University, 2015,36(2): 155-160 (in Chinese with English abstract)  
成人原发免疫性血小板减少症患者外周血Th9细胞的表达及其临床意义
郭慧军, 叶辛, 顾海慧, 查占山, 臧艳, 钱宝华     
第二军医大学长海医院输血科, 上海 200433
2014-10-13 收稿, 2015-01-31 改回.
基金项目：国家自然科学基金(81401358,81400152),第二军医大学长海医院“1255”学科建设计划(CH125531500),第二军医大学优秀硕士生苗子培育基金.
作者简介：郭慧军,硕士,主管技师.E-mail:guohuijuns@163.com;叶辛,硕士生.E-mail:yexin0223@hotmail.com
通信作者(Correspondingauthor). 钱宝华，Tel：021-31162121，E-mail：qianbh1963@163.com
摘要：目的 观察Th9细胞及IL-9在成人原发免疫性血小板减少症(primary immune thrombocytopenia,ITP)患者中的表达,探讨其在ITP发病过程中的作用。方法 纳入新诊断的成人ITP患者25例及年龄性别匹配的健康对照患者25例,利用流式细胞术检测研究对象外周血Th9细胞比例,实时荧光定量PCR检测IL-9、TGF-β、PU.1和IRF4的相对表达量,ELISA法检测IL-9的表达情况,血细胞计数仪进行血小板(PLT)计数。结果 与健康对照组相比,ITP患者外周血Th9细胞比例增高,且PLT≤30×109/L的患者Th9细胞比例高于PLT>30×109/L的患者(P<0.05)。ITP患者IL-9 mRNA及蛋白水平均增高,且PLT≤30×109/L的患者IL-9 mRNA及蛋白水平高于PLT>30×109/L的患者(P<0.05)。与健康对照组相比,ITP患者Th9细胞发育的主要调控因子TGF-β、PU.1和IRF4水平增高(P<0.05)。ITP患者Th9细胞比例和IL-9蛋白水平均与PLT负相关(r=-0.428 1,P=0.032 8; r=-0.537 5,P=0.005 6)。随访11例患者,发现经有效治疗后,Th9和IL-9与治疗前相比均呈下降趋势(P<0.05)。结论 Th9的异常活化可能参与了成人ITP疾病的发生与发展,这为进一步理解ITP的免疫学发病机制及选择免疫调节治疗潜在靶点提供了新的线索。
关键词： 原发免疫性血小板减少症     Th9细胞     白介素9    
Th9 cells in peripheral blood of adult patients with primary immune thrombocytopenia and its clinical significance
GUO Hui-jun, YE Xin, GU Hai-hui, ZHA Zhan-shan, ZANG Yan, QIAN Bao-hua     
Department of Blood Transfusion, Changhai Hospital, Second Military Medical University, Shanghai 200433, China
Abstract: Objective To observe Th9 cells and IL-9 level in adult patients with primary immune thrombocytopenia(ITP), and to discuss their potential roles in the pathogenesis of ITP. Methods A total of 25 newly diagnosed ITP patients and 25 sex- and age-matched healthy controls were enrolled in the present study. The percentage of Th9 cells in the peripheral blood samples of the two groups were detected by flow cytometry, expressions of IL-9, TGF-β, PU.1 and IRF4 mRNA were analyzed by real time-RCR, and IL-9 protein level was examined by ELISA. The platelet count was recorded by sysmex XE-2100. Results Compared with the healthy controls, the ratio of Th9 cells was significantly increased in ITP patients(P<0.05); and the ratio of Th9 cells in patients with PLT≤30×109/L was significantly higher than that in patients with PLT>30×109/L(P<0.05). IL-9 mRNA and protein expressions in ITP patients were significantly higher than those in the healthy controls, and those in patients with PLT≤30×109/L were also significantly higher than those with PLT>30×109/L(P<0.05). Compared with healthy controls, the mRNA expressions of IL-9, TGF-β, PU.1 and IRF4 were raised significantly in ITP patients(P<0.05). The ratio of Th9 cells and IL-9 protein level were negatively correlated with PLT in ITP patients(r=-0.428 1, P=0.032 8; r=-0.537 5, P=0.005 6, respectively). Furthermore, follow-up study of 11 ITP patients found that both Th9 cells and IL-9 protein levels took a declining tendency after effective treatment(P<0.05). Conclusion Abnormal activation of Th9/IL-9 may participate in the occurrence and development of ITP disease, which provides new clues for further understanding of ITP pathogenesis and selecting potential therapeutic targets in immune therapy of ITP.
Key words: primary immune thrombocytopenia     Th9 cells     interleukin-9    

原发免疫性血小板减少症(primaryimmunethrombocytopenia，ITP)是临床上最为常见的出血性疾病，其特点为机体主要产生针对自身血小板膜糖蛋白GPⅡb/Ⅲa的自身抗体，导致血小板被自身单核巨噬细胞系统吞噬破坏[1]。临床表现以皮肤淤点淤斑、黏膜出血及内脏出血为特征，严重者可危及生命[2]。ITP是一种公认的自身免疫性疾病，其发病机制尚未完全阐明，因而导致难以根治。

国内外已有的研究多认为，T细胞免疫紊乱是ITP发病机制中的重要环节。如Th1/Th2细胞失衡，Th17、Treg细胞数量及功能异常均参与了ITP的发病[3]。Th9细胞是近年来新发现的一种辅助性T细胞亚群，以分泌IL-9为特点。Th9细胞的发育主要受TGF-β、PU.1(由Spi1基因编码)和IRF4信号的调控[4]。Th9细胞在多种自身免疫性疾病的发病中均发挥重要作用，如系统性红斑狼疮(SLE)[5]、炎症性肠病(IBD)[6]等，但其在ITP中的表达尚不明确。本研究旨在探讨新诊断的成人ITP患者外周血中Th9细胞的表达及其临床意义。 1 材料和方法 1.1 研究对象

本研究共纳入2012年7月至2014年6月间在第二军医大学长海医院新诊断的未经治疗的成人ITP患者共25例，其诊断均满足中华医学会血液学分会血栓与止血学组2012年制定的成人原发免疫性血小板减少症诊断与治疗中国专家共识[7]。其中男10例，女15例，平均年龄(41.32±13.70)岁。另纳入年龄、性别相匹配的25名健康者作为正常对照组，其中男11例，女14例，平均年龄(40.12±14.02)岁。同时根据参考文献[8]分析血小板(PLT)≤30×109/L患者和PLT＞30×109/L患者组间相应指标的差别。本研究经过长海医院伦理委员会批准，所有受试对象均签署知情同意书。 1.2 试剂与仪器

流式细胞仪(FACSCalibur，BD公司)；酶标仪(Thermo公司)；实时荧光定量PCR仪(ABI7500)；血细胞计数仪(SysmexXE-2100)；FITC标记的抗CD4抗体、PE标记的抗CD9抗体、固定与穿膜试剂盒(BD公司)；cDNA反转录试剂盒、血清IL-9ELISA检测试剂盒(R&D公司)。 1.3 标本收集

取3mL静脉血，使用枸橼酸钠抗凝。使用Ficoll密度梯度离心法分离外周血单个核细胞(PBMC)，留取血清用于后续ELISA分析，所得PBMC分装为两管，一管用于后续流式细胞术分析，另一管用于实时荧光定量PCR分析。 1.4 ELISA法检测血清中IL-9的表达

根据试剂盒说明书，采用ELISA法检测血清IL-9表达量。 1.5 流式细胞术检测PBMC中Th9细胞分类

使用RPMI1640培养液调整细胞密度为5×106个／mL，根据试剂盒说明加入丙二醇甲醚醋酸酯(PMA)、离子霉素、莫能菌素刺激，于37℃、5%CO2孵箱中孵育4h后取出，以PBS洗涤2次。将上述培养好的标本分别进行荧光抗体染色，每106个／mL细胞中加入5μLFITC-CD4，避光孵育30min。根据试剂盒说明固定、破膜后进行细胞内染色，加入10μLPE-IL-9，避光孵育30min。同步设定同型对照管及阴性对照管，PBS洗涤后，250×g离心5min，弃上清，重复洗2次，加入300μLPBS重悬，上机检测。定义CD4+IL-9+者为Th9细胞。 1.6 实时荧光定量PCR检测PBMC中IL-9、TGF-β、PU.1和IRF4的表达

在PBMC中加入TRIzol试剂，按照试剂盒操作说明提取总RNA，然后进行反转录反应，制备cDNA，使用SYBRgreen法进行实时荧光定量PCR，引物序列见表 1。扩增条件：95℃30s；95℃5s；60℃20s，72℃30s，进行40个循环。使用GAPDH为内参基因，根据2-ΔΔCt法(其中ΔΔCt=ΔCt,Q-ΔCt,C。ΔCt,Q为疾病组靶基因的Ct值与管家基因Ct值之差；ΔCt,C为对照组靶基因的Ct值与管家基因Ct值之差)计算两组标本IL-9、TGF-β、PU.1和IRF4的相对表达量。

表 1 IL-9、TGF-β、PU.1和IRF4的引物序列 Tab 1 Primer sequences for IL-9，TGF-β，PU.1,and IRF4
1.7 外周血PLT计数

所有受试对象取静脉血2mL置于EDTA抗凝管中，通过血细胞计数仪(SysmexXE-2100)进行PLT计数。 1.8 随访

随访11例患者至治疗结束并达到完全缓解，即治疗后PLT计数≥100×109/L，且无出血症状[7]。这11例患者接受的治疗方案均为地塞米松(40mg/d)连续治疗4d，治疗结束后采集标本分析相关指标的变化情况。其余患者中有6例未达到完全缓解标准，8例患者未能获取治疗后标本。 1.9 统计学处理

使用SPSS17.0软件进行统计分析。计量资料以 x±s 表示，两组间差异的比较采用Mann-WhitneyU检验，相关性分析采用Spearman相关分析。检验水准(α)为0.05。 2 结 果 2.1 ITP患者一般情况

25例患者病程(根据患者主诉发病起始时间)为1~26个月，平均(10.20±7.16)个月，治疗前PLT为(34.48±21.63)×109/L，对照组PLT为(193.12±52.03)×109/L，两组比较差异有统计学意义(P<0.05)。其中随访的11例患者治疗前PLT为(31.36±21.72)×109/L，治疗后PLT为(182.27±26.06)×109/L，治疗后PLT明显升高(P<0.05)。 2.2 ITP患者细胞比例分析

与健康对照组相比，ITP患者外周血Th9细胞比例增高[(0.99±0.40)%vs(0.25±0.11)%，P<0.05]，且在PLT≤30×109/L的患者(n=13)中Th9细胞比例也高于PLT＞30×109/L的患者(n=12)[1.21±0.36)%vs(0.77±0.32)%，P<0.05]，见图 1。 2.3 ITP患者外周血IL-9mRNA和蛋白的表达

与 健康对照组相比，ITP患者外周血IL-9mRNA和蛋白水平均增高(P＜0.05)，且在PLT≤30×109/L 患者中IL-9mRNA和蛋白水平均高于PLT＞30×109/L的患者(P＜0.05)，见表 2。

表 2 ITP患者和对照组IL-9mRNA和蛋白的表达 Tab 2 IL-9 mRNA and protein expressions in ITP patients and healthy controls

图 1 ITP患者Th9细胞百分比分析 Fig 1 ercentages of Th9 cells in peripheral blood of ITP patients ITP：Primary immune thrombocytopenia；HC：Healthy control; PLT: Platelet.*P＜0.05.n=25 for ITP and HC n=13 for ITP patients with PLT≤30×109/Landn=12for ITP patients with PLT ＞30×109/L
2.4 ITP患者外周血TGF-β、PU.1和IRF4mRNA的表达

与健康对照组相比，ITP患者TGF-β (3.15±1.10vs1.00±0.20)、PU.1(4.05±0.80vs1.00±0.18)和IRF4(2.87±0.58vs1.00±0.18)水平增高，差异均具有统计学意义(P＜0.05)，见图 2。

图 2 ITP患者TGF-β、PU.1和IRF4mRNA相对表达量分析 Fig 2 mRNA expressions of TGF-β,PU.1,and IRF4 in peripheral blood of ITP patients ITP：Primary immune thrombocytopenia；HC：Healthy control *P＜0.05.n=25,x±s
2.5 ITP患者Th9细胞和IL-9蛋白与PLT的相关性

在ITP患者中，Th9细胞比例和IL-9蛋白水平均与患者PLT计数负相关(r=-0.4281，P=0.0328；r=-0.5375，P=0.0056)，见图 3。

图 3 ITP患者Th9、IL-9与血小板计数的相关性分析 Fig 3 Correlation analysis of Th9 and IL-9 with PLT count in ITP patients ITP：Primary immune thrombocytopenia；PLT：Platelet
2.6 治疗后ITP患者Th9细胞和IL-9水平的变化

随访11名ITP患者，经有效治疗后，患者Th9细胞比例和IL-9水平均呈下降趋势(P＜0.05)，见图 4。

图 4 ITP患者治疗前后Th9细胞比较和IL-9水平的变化趋势 Fig 4 Change of Th9 and IL-9 expressions in ITP patients before and after treatment ITP：Primary immune thrombocytopenia *P＜0.05.n=11,x±s
3 讨 论

Th9细胞是最新被发现的一种Th细胞亚群，尽管IL-9最初被认为是一种典型的Th2型细胞因子，但在近来的研究中已经确定IL-9主要由Th9细胞亚群产生[9,10]。Th9细胞主要由IL-4和TGF-β信号诱导而分化产生，其IL-9的产生同样由多种细胞因子及转录因子调节，包括PU.1、GATA-3和IRF4等[4]。其中PU.1对IL-9产生的调控作用尤为重要，使用TGF-β刺激T细胞可产生PU.1，PU.1可直接结合在IL-9基因的启动子区域，与组蛋白乙酰转移酶GCN5组成复合体，从而激活IL-9启动子[11]，PU.1是控制Th9细胞分化的关键因素之一，同时可负向调控Th2细胞的分化[12]。本研究发现与健康对照组相比，成年ITP患者Th9细胞比例以及IL-9mRNA和蛋白水平均增高(P＜0.05)，且PLT≤30×109/L的ITP患者Th9细胞比例以 及IL-9mRNA和蛋白水平均高于PLT＞30×109/L 的ITP患者(P＜0.05)，同时ITP患者中调控Th9/IL-9的重要因子TGF-β、PU.1和IRF4均增高(P＜0.05)。这些结果表明成年ITP患者中Th9/IL-9信号异常活化，且在病情较重的患者中Th9/IL-9调节紊乱现象更为严重，提示Th9/IL-9在ITP的发病机制中可能发挥重要作用，且可能是由于上游转录因子和细胞因子紊乱所导致的。其具体的调控机制仍待进一步研究。

Th9与其分泌的细胞因子IL-9在多种自身免疫性疾病中均有重要作用，如系统性红斑狼疮[5]、系统性硬化[13]和自身免疫性脑脊髓炎[14]等。研究表明，给小鼠注入Th9细胞可诱导更严重的实验性变态反应性脑脊髓炎(EAE)症状及中枢神经系统损害[15]，使用抗IL-9单抗或IL-9受体缺陷，可能通过减轻髓鞘少突胶质细胞糖蛋白(MOG)激活的Th1和Th17反应，从而显著减轻EAE的症状[16]。IL-9可促进Th17和Treg细胞的存活并激活STAT3和STAT5信号通路，使用IL-9抗体阻断IL-9信号通路后，使Treg细胞功能下降，使用重组IL-9后Treg细胞的抑制功能加强[17]。上述研究表明，Th9/IL-9可能作为自身免疫性疾病治疗的潜在靶点。

本研究发现在成年ITP患者中，Th9/IL-9与PLT计数相关，这进一步证实了Th9/IL-9参与ITP的疾病进展，并提示Th9/IL-9可能作为评估疾病严重程度的指标。Th9/IL-9可能通过促进Th17和Treg细胞的功能，从而加剧ITP患者免疫紊乱。通过进一步随访11例ITP患者，发现经有效治疗后，患者Th9/IL-9均呈下降趋势。有研究表明，ITP患者使用糖皮质激素治疗，可以纠正Th细胞亚群失衡[18]。本研究发现，经有效治疗后，ITP患者Th9/IL-9也有恢复正常的趋势，该结果同样表明，Th9/IL-9可能与ITP的疾病进程密切相关。

综上所述，本研究发现成年ITP患者Th9细胞、IL-9水平增高，在PLT≤30×109/L的患者中Th9/IL-9异常活化程度更为严重，且其与患者血小板计数显著相关，提示Th9/IL-9的异常活化可能参与了疾病的发生与发展，这为进一步理解ITP的免疫学发病机制及免疫调节治疗潜在靶点的选择提供了新的线索。 4 利益冲突

所有作者声明本文不涉及任何利益冲突。

参考文献
[1] McKenzie C G, Guo L, Freedman J, Semple J W. Cellular immune dysfunction in immune thrombocytopenia (ITP)[J]. Br J Haematol, 2013, 163:10-23.
[2] Kuhne T. Update on the Intercontinental Cooperative ITP Study Group (ICIS) and on the Pediatric and Adult Registry on Chronic ITP (PARC ITP)[J]. Pediatr Blood Cancer, 2013, 60 (Suppl) 1:S15-S18.
[3] Semple J W, Provan D. The immunopathogenesis of immune thrombocytopenia: T cells still take center-stage[J]. Curr Opin Hematol, 2012, 19:357-362.
[4] Gerlach K, Hwang Y, Nikolaev A, Atreya R, Dornhoff H, Steiner S, et al. TH9 cells that express the transcription factor PU.1 drive T cell-mediated colitis via IL-9 receptor signaling in intestinal epithelial cells[J]. Nat Immunol, 2014, 15:676-686.
[5] Ouyang H, Shi Y, Liu Z, Feng S, Li L, Su N, et al. Increased interleukin9 and CD4+IL-9+ T cells in patients with systemic lupus erythematosus[J]. Mol Med Rep, 2013, 7:1031-1037.
[6] Nalleweg N, Chiriac M T, Podstawa E, Lehmann C, Rau T T, Atreya R, et al. IL-9 and its receptor are predominantly involved in the pathogenesis of UC[J]. Gut, 2014 Jun 23. pii: gutjnl-2013-305947. doi: 10.1136/gutjnl-2013-305947.
[7] 中华医学会血液学分会血栓与止血学组. 成人原发免疫性血小板减少症诊断与治疗中国专家共识(2012年版)[J]. 中华血液学杂志, 2012, 33:975-977.
[8] Dolasik I, Birtas Atesoglu E, Tarkun P, Mehtap O, Keski H, Dogru A, et al. Decreased serum heat shock protein 60 levels in newly diagnosed immune thrombocytopenia patients[J]. Platelets, 2014 Apr 21.
[9] Kaplan M H. Th9 cells: differentiation and disease[J]. Immunol Rev, 2013, 252:104-115.
[10] Raphael I, Nalawade S, Eagar T N, Forsthuber T G. T cell subsets and their signature cytokines in autoimmune and inflammatory diseases[J]. Cytokine, 2014 Oct 30. pii: S1043-4666(14)00539-0. doi: 10.1016/j.cyto.2014.09.011.
[11] Goswami R, Kaplan M H. Gcn5 is required for PU.1-dependent IL-9 induction in Th9 cells[J]. J Immunol, 2012, 189:3026-3033.
[12] Chang H C, Sehra S, Goswami R, Yao W, Yu Q, Stritesky G L, et al. The transcription factor PU.1 is required for the development of IL-9-producing T cells and allergic inflammation[J]. Nat Immunol, 2010, 11:527-534.
[13] Yanaba K, Yoshizaki A, Asano Y, Kadono T, Sato S. Serum interleukin 9 levels are increased in patients with systemic sclerosis: association with lower frequency and severity of pulmonary fibrosis[J]. J Rheumatol, 2011, 38:2193-2197.
[14] Murugaiyan G, Beynon V, Pires Da Cunha A, Joller N, Weiner H L. IFN-gamma limits Th9-mediated autoimmune inflammation through dendritic cell modulation of IL-27[J]. J Immunol, 2012, 189:5277-5283.
[15] Jager A, Dardalhon V, Sobel R A, Bettelli E, Kuchroo V K. Th1, Th17, and Th9 effector cells induce experimental autoimmune encephalomyelitis with different pathological phenotypes[J]. J Immunol, 2009, 183:7169-7177.
[16] Li H, Nourbakhsh B, Ciric B, Zhang G X, Rostami A. Neutralization of IL-9 ameliorates experimental autoimmune encephalomyelitis by decreasing the effector T cell population[J]. J Immunol, 2010, 185:4095-4100.
[17] Elyaman W, Bradshaw E M, Uyttenhove C, Dardalhon V, Awasthi A, Imitola J, et al. IL-9 induces differentiation of TH17 cells and enhances function of FoxP3+ natural regulatory T cells[J]. Proc Natl Acad Sci U S A, 2009, 106:12885-12890.
[18] Li J, Wang Z, Hu S, Zhao X, Cao L. Correction of abnormal T cell subsets by high-dose dexamethasone in patients with chronic idiopathic thrombocytopenic purpura[J]. Immunol Lett, 2013, 154:42-48.