中老年部分雄激素缺乏综合征(partial androgen deficiency of aging male,PADAM)是一种与血清雄激素水平不足有关的生化综合征，由奥地利泌尿学会在1994年欧洲男科学研讨会上首次提出^[1]。它以睾丸激素水平低于3 ng/mL (12 nmol/L)和个体症状为诊断标准^[2]。Morales在国际老年男性学会(international society for the study for the aging male,ISSAM)上将这些个体症状归纳为精神神经症状、植物神经症状、心理障碍和性功能减退等4类^[3]，其中最常见的是心理症状、情绪异常和性功能减退，分别占51%、36%和13%^[4]。目前，国内外许多临床、动物和体外实验均证实睾酮补充疗法可以显著地改善上述症状^[5]，但对其存在的诸如引发良性前列腺异常增大等安全性问题仍没有明确的共识。研究已经表明电针可明显改善睾丸损害大鼠的精液质量^[6]以及对下丘脑-垂体-性腺轴有良性的调节作用^[7]，因此，我们建立PADAM大鼠模型，采用电针疗法作为干预手段，观察其对实验大鼠体内睾丸激素的作用效果。同时我们检测PADAM大鼠经电针治疗后肾脏中超氧化物歧化酶(superoxide dismutase,SOD)、丙二醛(malondialdehyde,MDA)含量，探讨其与疾病的内在关系。 1 材料和方法 1.1 实验动物

同批次清洁级SD雄性大鼠40只，2月龄、体质量80~220 g。购自重庆医科大学动物实验中心，许可证号：SCXK 2012-0001。所有动物在相同条件[温度(22±2)℃，湿度(45±5)%，12 h光暗周期]下正常饲养1周。 1.2 主要试剂及检测设备 总睾酮(total testosterone,TT)试剂盒(批号：23005318)和游离睾酮(free testosterone,FT)试剂盒(批号：23005320)购自上海沪尚生物科技有限公司；SOD试剂盒(批号：20130816)和MDA试剂盒(批号：20130813)购自南 京建成科技有限公司；环磷酰胺注射粉针，0.2 g/支， 批号H14023686，购自山西普德药业股份有限公司；丙酸睾酮注射液，25 mg/支，批号H31020524，购自上海通用药业股份有限公司。离心机(TOMY，日本)；生物显微镜(iMark-14047,上海)；一次性针灸针(规格：长5 cm，直径0.25 cm，苏州)；电针仪(6805-A，汕头)。 1.3 PADAM大鼠模型的建立

将40只大鼠随机分成2组：正常组(n=10)和模型组(n=30)，参考相关文献的造模方法^[8]，模型组腹腔注射环磷酰胺20 mg/(kg·d)，连续5 d，正常组腹腔注射与模型组等体积等天数的生理盐水。造模之后，与正常组比较，模型组大鼠体质量减轻、饮食饮水量减少、活动减少。参考章振宝等^[9]的方法，统计得出血清TT、FT水平较造模前有显著下降(P<0.01)，行为学部分改变(悬尾时间延长、强迫游泳时间缩短，P<0.01)。参考孙祥宙等^[10]的方法，统计出正常组大鼠血清TT、FT的99%可信区间下限分别为5.56 ng/mL和4.68 nmol/L,以此值为标准，凡是模型组大鼠血清TT和FT水平低于该标准值，则说明造模成功，最后共有28只大鼠造模成功，见图1。 1.4 穴位的定位

肾俞穴(BL23)：位于大鼠第二腰椎下两旁，旁开5.0 mm，左、右侧各一穴。关元穴(CV4)：位于大鼠脐下约25 mm处；辅助针刺点：位于关元穴所在经络近心端约2 mm处，因关元穴为独穴，故取辅助针刺点配对以形成局部电流回路，从而加强治疗作用^[11]。

图1

Fig 1

图 1 造模后模型组血清TT(A)、FT(B)的水平 Fig 1 Serum TT(A) and FT(B) levels in model group “— ·” was the 99% confidence interval of the rats in normal control group; “·” was serum TT and FT levels in the model group. TT and FT levels of rats significantly lower than the 99% confidence interval indicated a successful modeling.TT:Total testosterone; FT: Free testosterone

从造模成功的28只大鼠中随机选取24只平均分为3组：电针组、药物组和对照组。治疗时间为上午8:00~11:30之间(性激素的分泌具有节律性)，实验室的室温控制在20～22℃，湿度控制在45%～46%之间。连续治疗8周。电针组：大鼠四肢捆绑固定。每日针刺双侧“肾俞”穴，进针6 mm；针刺“关元”穴和辅助针刺点，进针3 mm，均采用连续波通电留针15 min，频率3次/s，强度以针柄颤动，但能使动物不挣扎嘶叫，保持安静为度。药物组：于大鼠腹部皮下注射丙酸睾酮，用量标准为7 mg/kg， 3 d注射1次，注射部位左右交替。然后四肢捆绑固定，正反各15 min。对照组：与药物组同期腹部皮下注射生理盐水，用量标准同药物组。然后四肢捆绑固定，正反各15 min。 1.6 大鼠悬尾实验

参考Steru等^[12]的方法。于造模前、造模后、治疗结束当天进行。将大鼠尾端2 cm的部位固定在水平木板上(木板离地1 m左右)，使大鼠呈倒挂状。悬挂两侧用木板隔开大鼠视线。大鼠为克服不正常体位而挣扎活动，但活动一定时间后，出现间断性“不动”，显示“失望”状态。计算6 min内不动时间，并同时观察大鼠挣扎幅度以及抑郁状态。本实验可一定程度上反映大鼠的肌力以及抑郁状态。 1.7 大鼠强迫游泳实验

参考Mcardle等^[13]的方法。游泳池规格为100 cm×60 cm×85 cm，水深保持在60 cm，使大鼠不能以尾撑池底休息为准，水温控制24～26℃。将大鼠置于游泳池，记录大鼠游泳力竭时间，力竭判断标准即游泳最后下沉，经10 s后仍不能返回水面为准。本实验是反映大鼠体力及衡量其是否疲劳的经典指标。 1.8 样品的处理及指标检测

于造模前和造模后全部大鼠采用目内眦取血法取血1.5 mL；各个实验组在治疗结束后次日上午，采用摘除眼球取血法取血3 mL，后用断颈法处死全部大鼠。血液采集后以 900×g离心15 min，分离血清，-20℃低温冰箱保存。解剖睾丸和肾脏，睾丸用4%多聚甲醛固定，2～4℃常温冰箱保存；肾脏置于冻存管中，-80℃超低温冰箱保存。采用酶联免疫吸附法(enzyme linked immunosorbent assay,ELISA)测定大鼠血清TT、FT的含量。将大鼠肾组织在冰水浴中分别制作成0.5%、10%的组织匀浆，采用羟胺法测定0.5%肾组织匀浆的SOD含量；采用TBA法测定10%肾组织匀浆的MDA含量。采用H-E染色，光镜下观察睾丸组织形态。 1.9 统计学处理

所有数据采用SPSS 19.0 统计软件进行分析。所有数据以 x±s 表示。多组治疗前后自身比较采用配对t检验；多组间均数差异的两两比较采用Least-Significant Difference(LSD)检验。检验水准(α)为0.05。

2 结 果 2.1 电针对PADAM大鼠模型行为学的影响

由表1可知：治疗之前，3组大鼠的悬尾时间和强迫游泳时间无明显差异(P>0.05)，故具有可比较性。治疗之后，电针组和药物组大鼠的悬尾时间和强迫游泳时间分别与治疗前相比差异有统计学意义(P<0.01)，并且与对照组大鼠相比差异也具有统计学意义(P<0.01)；电针组与药物组大鼠之间相比较，差异无统计学意义(P>0.05)。提示电针与丙酸睾酮一样，均能提高PADAM模型大鼠的肌张力和抗疲劳能力，并能改善其抑郁状态。

表1(Table 1)

表1 三组大鼠治疗前后行为学变化 Tab 1 Comparison of tail suspension experiments and swimming exhaustion tests between 3 groups n=8,x±s Group The duration of immobility t/s The duration of swimming exhaustion t/min Pre-treat Post-treat Pre-treat Post-treat Electro-acupuncture 189.45±7.03 179.24±1.19**△△ 21.58±1.46**△△ 26.68±1.49**△△ Androlin 186.58±4.41 179.61±1.19**△△ 20.91±1.15**△△ 26.63±1.37**△△ Blank control 187.81±3.92 189.34±1.66 20.47±1.26 20.58±1.35 **P<0.01 vs pre-treat；△△P<0.01 vs blank control group

表1 三组大鼠治疗前后行为学变化 Tab 1 Comparison of tail suspension experiments and swimming exhaustion tests between 3 groups

治疗之前，三组大鼠的血清TT、 FT含量无明显差异(P>0.05)，故具有可比较性。治疗之后，电针组和药物组大鼠的血清TT、FT含量分别与治疗前相比差异有统计学意义(P<0.01)， 并且与对照组大鼠相比差异也有统计学意义(P<0.01)；电针组与药物组大鼠之间相比较，差异无统计学意义 (P>0.05)。提示电针与丙酸睾酮一样，均能提高PADAM模型大鼠的血清睾丸激素水平。详见表2。

表2(Table 2)

表2 三组大鼠治疗前后睾丸激素变化 Tab 2 Comparison of testosterone levels before and after the therapy between the 3 groups n=8,x±s Group TT ρB/(ng·mL-1) FT cB/(nmol·L-1) Pre-treatment Post-treatment Pre-treatment Post-treatment Electro-acupuncture 2.87±0.32 5.57±0.59**△△ 3.33±0.13**△△ 4.82±0.54**△△ Androlin 2.92±0.41 5.44±0.36**△△ 3.49±0.21**△△ 4.82±0.62**△△ Blank control 2.98±0.41 2.84±0.22 3.57±0.23 3.51±0.71 TT: Total testosterone; FT: Free testosterone. **P<0.01 vs pre-treat; △△P<0.01 vs blank control group

表2 三组大鼠治疗前后睾丸激素变化 Tab 2 Comparison of testosterone levels before and after the therapy between the 3 groups

治疗后，电针组和药物组大鼠肾脏SOD含量高于对照组，差异有统计学意义(P<0.01)，且电针组大鼠肾脏SOD含量高于药物组，差异也具有统计学意义(P<0.05)；电针组和药物组大鼠肾脏MDA含量均低于对照组，差异有统计学意义(P<0.01)，而电针组和药物组之间没有明显差异(P>0.05)，见表3。

表3(Table 3)

表3 三组大鼠治疗后肾脏SOD、MDA含量比较 Tab 3 Comparison of renal SOD and MDA contents before and after the therapy between the 3 groups n=8,x±s Group SOD λB/(U·mg-1) MDAmB/(nmol·mg-1) Electro-acupuncture 93.218±4.78**△ 20.512±9.82** Androlin 79.401±4.92** 21.403±6.17** Blank control 48.919±5.21 37.195±4.19 SOD:Superoxide dismutase;MDA:Malondialdehyde. * *P<0.01 vs blank control group; △P<0.05 vs androlin group

表3 三组大鼠治疗后肾脏SOD、MDA含量比较 Tab 3 Comparison of renal SOD and MDA contents before and after the therapy between the 3 groups

运用Pearson相关性分析，电针组大鼠肾脏SOD、MDA含量与TT和FT水平存在高度相关性(|r|≥0.8,P<0.01;|r|>0.95,P<0.01)。 2.5 电针对PADAM大鼠模型睾丸组织学形态的影响

光镜观察睾丸H-E染色切片显示：电针组与药物组同对照组相比较，大鼠睾丸曲细精管管腔规则，管径较大，基膜完整，大鼠曲细精管之间间质组织增生，间质细胞数量增多，细胞核深染，而对照组大鼠曲细精管排列紊乱，生殖细胞脱落缺失,见图2。

图2

Fig 2

图 2 大鼠睾丸形态学变化 Fig 2 Changes of rat testicular morphology in different groups A,D： Electro-acupuncture group； B,E： Androlin group； C,F： Blank control group； A,B： There were abundant Sertoli cells well arranged in the seminiferous tubules,with large diameter and intact basement membrane； C： Sertoli cells accompanied with swollen seminiferous tubules； D,E： Leydig cells had more inerratic histological patterns with hyper chromatic nuclei； F： Leydig cells’ nuclei had nuclear division. Original magnification: × 100(A-C); × 400(D-F)

PADAM是指中老年男性随着年龄的逐渐增长、体内雄激素伴随性下降而出现的一系列部分雄激素缺乏性综合征。环磷酰胺是一类双功能烷化剂，作为细胞周期非特异性药物，可有效治疗多种恶性肿瘤；但因其无选择性的杀伤作用，环磷酰胺在抑制肿瘤细胞增殖分化的同时，对生殖系统特别是男性睾丸具有明显的毒性损伤。现有研究表明，环磷酰胺能够损伤睾丸、造成生精功能和睾酮合成障碍、诱导染色体畸变^[8]。本实验结果显示，环磷酰胺造模后，与正常组比较，模型组血清TT、FT水平下降且低于正常组血清值99%可信区间，行为学部分改变(悬尾时间延长、强迫游泳时间缩短)，与PADAM病理变化类似，表明运用环磷酰胺复制PADAM大鼠模型是可行的。

雄激素(睾酮)的合成和分泌受到下丘脑-垂体-睾丸轴(hypothalamus-pituitary-testicular axis,HPTA)的严格调控，HPTA的结构和功能的异常均能引起睾酮的合成或分泌障碍。在对电针促进吗啡戒断雄性大鼠性行为的恢复研究中发现，电针可以使给药后大鼠明显下降的血清TT水平明显上升，甚至高于正常大鼠的水平，并且电针的这种明显促使血清TT水平升高的能力有助于性行为的尽快恢复，电针的这种作用机制可能是升高血清TT进而升调节内侧视前区(medial preoptic area,MPA)中的一氧化氮合成酶来促进性交能力的提升^[14]。本实验也证实了电针能够促进环磷酰胺致PADAM大鼠体内雄激素水平的显著升高，其作用效果与丙酸睾酮相当。

哺乳动物体内的雄激素有95%是由睾丸间质细胞(Leydig 细胞)所分泌，但随着中老年男性年龄的不断增加，其Leydig 细胞合成分泌雄激素的能力也逐渐下降，其可能的原因是随着年龄的增长，Leydig 细胞的数量逐渐减少以及功能出现改变。电针衰老大鼠发现，电针后衰老大鼠的睾丸生精细胞分层数明显增加，体内TT水平明显上升，其可能的机制在于电针能够通过盆腔神经丛局部反射直接促进睾丸间质细胞分泌雄激素^[15]。本实验也证实了电针后大鼠睾丸曲细精管管腔规则，管径较大，基膜完整，曲细精管之间间质组织增生，间质细胞数量增多，细胞核深染，体内雄激素水平明显升高。

在目前衰老机制的相关研究当中，自由基学说日益受到人们的重视。SOD、MDA是自由基相关系统的特异性指标。研究表明，电针老年大鼠能明显升高其机体内SOD水平而降低MDA含量^[16]，从而起到抗衰老作用。现在对于PADAM的发病机制还没有一个明确的认识，而其作为中老年过渡期疾病，其发病是否也与自由基系统相关？本实验检测了电针刺激后PADAM模型大鼠肾脏SOD、MDA含量，结果表明：与对照组相比较，电针组大鼠SOD含量明显升高(P<0.01)而MDA水平显著降低(P<0.01)，且与血清TT和FT水平存在高度相关性(|r|≥0.8,P<0.01；|r|>0.95,P<0.01)。本实验在一定程度上证实了电针治疗PADAM与其改善体内自由基相关系统具有一定相关性。

据本研究结果，电针与丙酸睾酮疗效相当，可以作为替代疗法治疗PADAM；电针治疗PADAM与其改善体内自由基相关系统具有一定关联性。

4 利益冲突

所有作者声明本文不涉及任何利益冲突。