还原型谷胱甘肽(GSH)是哺乳动物细胞内含量最丰富的低相对分子质量的多肽，由谷氨酸、半胱氨酸和甘氨酸残基组成。我们前期的研究显示，肝脏缺血再灌注(I/R)时，氧化应激导致的细胞线粒体能量障碍是细胞坏死和凋亡的关键环节^{[1, 2]}，而大部分的药物性肝保护措施均能提高组织GSH含量。肝脏I/R时，线粒体内钙超载是线粒体通透性转换孔(mitochondrial permeability transition pore，MPTP)开放的重要诱因^[3]。采用非穿透性Ca^2＋荧光分子探针，通过动态检测线粒体悬液的荧光强度，能敏感观察到已知浓度的外源性Ca^2＋刺激下线粒体外钙流的变化，并以此判断MPTP开放的时机，评价MPTP敏感性^{[1, 2]}。本研究拟在此基础上，研究大鼠肝脏缺血前GSH预处理对再灌注时肝细胞的保护作用及线粒体机制。

雄性SD大鼠，鼠龄8周，体质量220 g左右，购自上海西普尔-必凯实验动物有限公司[许可证号SYXK(沪)2012-0003]。饲养于第二军医大学实验动物中心,每日光照12 h,自由进食。于术前12 h开始禁食，不禁饮水。

GSH由重庆药友制药有限责任公司提供；Calcium green-5N 分子探针购自美国Invitrogen公司；原位末端标记法(TUNEL)检测试剂盒购自瑞士罗氏公司；GSH和氧化型谷胱甘肽(GSSG)检测试剂盒购自上海碧云天生物技术有限公司；其余试剂均为国产分析纯。

取大鼠60只，随机分为假手术组、I/R组和GSH组，每组20只。各组大鼠用1%戊巴比妥(30 mg/kg)腹腔注射麻醉后，腹部正中切口开腹。I/R组和GSH组大鼠用无损伤血管夹夹闭肝左叶和肝中叶入肝血管(相应肝叶的门静脉和肝动脉)，进行70%肝脏热缺血处理60 min，之后松开血管夹行再灌注^{[1, 2]}。缺血前5 min，GSH组大鼠经股静脉注射5 mg/kg GSH溶液(用生理盐水溶解)，I/R组给予同体积的生理盐水。假手术组不阻断血流，其余操作同I/R组。

于再灌注后6 h和24 h各取10只大鼠断头处死，迅速经心脏取血，并分离和获取血清样本。取各组大鼠新鲜肝脏组织，经4℃生理盐水漂洗后，于肝左叶取约3 mm×3 mm×5 mm的肝组织块，置入4%的中性甲醛固定，用于病理学检查。其余肝组织迅速置入液氮中保存，备检，肝右叶用于线粒体分离纯化。肝脏线粒体分离和纯化使用差速离心法^[2]。以牛血清白蛋白为标准，采用Bradford法进行线粒体蛋白定量。

将再灌注后6 h获取的大鼠血清样本经日立7600型全自动生化分析仪检测AST和ALT。

取再灌注后24 h各组大鼠固定后的肝组织样本，切成2 mm×3 mm×6 mm的肝组织块，脱水，石蜡包埋，切片，H-E染色，光镜(×100)下观察肝组织形态。TUNEL染色按照试剂盒方法操作，切片在光镜下(×400)观察，并随机选取10个视野，计数TUNEL阳性细胞。

将液氮中标本于冰浴中解冻后，加入PBS匀浆，离心后取上清，按GSH和GSSG检测试剂盒要求步骤检测。

取分离的线粒体蛋白2 mg，加入孵育介质[含70 mmol/L蔗糖、210 mmol/L甘露醇、10 mmol/L Tris-MOPS(3-吗啉丙磺酸)、5 mmol/L Tris-琥珀酸、2 μmol/L Tris-鱼藤酮、20 μmol/L Tris-EGTA(乙二醇四乙酸)、1 mmol/L KH₂PO₄，pH 7.4] 2 mL。在孵育介质中加入1 μmol/L Calcium green-5N分子探针，于25℃下孵育2 min后，每分钟向悬液中加入终浓度10 μmol/L CaCl₂脉冲，通过FlexStationⅡ荧光检测仪(美国Molecular Devices公司)动态检测线粒体悬液中荧光强度，激发和发射波长分别为500 nm和530 nm，直到出现持久性的线粒体外Ca^2＋浓度剧增，记录所需要的外源性钙脉冲的次数。计算驱动单位线粒体MPTP开放所需要的外源性Ca²⁺的摩尔量即为CRC。

用SPSS 10.0统计软件进行两因素方差分析，所有数据用 x±s 表示，组间两两比较采用LSD法。检验水准(α)为0.05。

再灌注后6 h，与I/R组比较，GSH组的血清AST和ALT水平均降低(P < 0.05),见图1。

图 1 再灌注后6 h各组大鼠血清ALT和AST水平的比较 Fig 1 Serum levels of ALT and AST 6 h after reperfusion in rats of each group I/R: Ischemia/reperfusion; GSH: Glutathione; ALT: Alanine aminotransferase; AST: Aspartate transaminanse. P < 0.05 vs I/R group. n=10,x±s

再灌注后24 h，I/R组的肝组织汇管区血窦内见大量充血，血窦排列紊乱，肝细胞出现核固缩，空泡变性，呈现大片坏死; 而GSH组肝组织汇管区大部分肝细胞形态完好，无明显充血，汇管区远端有局灶坏死(图2)。TUNEL染色显示，GSH组肝细胞凋亡减少(图2)，阳性细胞比例为(17.3±4.1)%，低于I/R组的(33.3±6.0)%，差异有统计学意义(n=10，P < 0.05)。

图 2 再灌注后24 h各组肝组织H-E染色和原位末端转移酶标记染色结果 Fig 2 H-E and TUNEL staining 24 h after reperfusion in rat liver of each group I/R: Ischemia/reperfusion; GSH: Glutathione. Original magnification: ×100 (H-E),×400 (TUNEL)

再灌注后6 h，假手术组肝组织GSH/GSSG比值为(8.74± 0.66)；与I/R组(3.89±0.96)比较，GSH组肝组织中GSH/GSSG比值(6.22± 1.24)升高(n=10，P < 0.05)。

再灌注后6 h，与I/R组比较，GSH组肝细胞线粒体在外源性Ca^2＋脉冲诱导下的耐受性增加(P < 0.05):使用琥珀酸为能量底物时，对线粒体悬液施加单次10 μmol/L CaCl₂脉冲，假手术组线粒体接受的脉冲次数最多，CRC也最高，为(73.2±12.6) nmol/mg； GSH组为(54.2±17.3) nmol/mg；而相同反应条件下，I/R组的耐受性最差，为(31.4±3.3) nmol/mg，与GSH组相比较CRC降低(n=10,P < 0.05)。 提示再灌注后6 h，GSH预处理能降低I/R时MPTP对外源性Ca^2＋刺激的敏感性，抑制其开放。

I/R损伤是临床常见病理过程，其机制复杂，主要包括微循环障碍、间质水肿、炎症细胞浸润、免疫调节障碍、实质细胞功能障碍、细胞坏死和凋亡等。在一些手术如体外循环、肝切除、肝移植术等中,I/R损伤不可避免，并直接影响手术疗效和患者预后。因此，如何减轻I/R损伤一直是临床面临的重要任务。目前，大量的研究致力于药物性缺血预处理以期减轻I/R损伤。理想的预处理药物应该能模拟人体生理保护作用，对I/R损伤的产生机制具有拮抗作用，同时对机体无或仅有较小不良反应^[4]。目前临床上尚无能符合上述条件的药物。

GSH是哺乳动物细胞内自然合成的，含量最丰富的，由谷氨酸、半胱氨酸和甘氨酸组成的低相对分子质量的多肽。药理研究表明，GSH在人体内作为一种还原剂，具有清除体内氧自由基、抗氧化、解毒等重要生理活性^{[5, 6, 7]}。前期研究显示，肝脏I/R损伤时细胞内GSH生物合成能力降低，含量下降^{[1, 2]}。本研究发现使用外源性GSH预处理可以减轻I/R后的肝组织细胞损伤，降低血浆AST和ALT水平，并在远期起到保护肝组织作用，减少肝细胞凋亡。机制研究显示，GSH预处理能增加再灌注早期肝线粒体CRC，抑制MPTP开放。我们认为该作用可能与GSH的强还原性特性、减少了活性氧(reactive oxygen species，ROS) 等过氧化物的产生、阻断了MPTP开放的瀑布级联，从而进一步抑制了后续的线粒体相关细胞坏死和凋亡有关。

线粒体是真核生物进行氧化代谢的部位，在维持组织器官功能稳定及细胞结构完整中起到至关重要的作用^[8]。I/R时，由于细胞外Ca^2＋超载、氧化应激反应产物增加，线粒体外膜对蛋白质的通透性增高，以致可溶性的膜间蛋白从线粒体释放出来；同时线粒体内膜的膜电位下降^{[9, 10, 11]}，导致线粒体膜通透性改变，直接引发线粒体破坏，细胞坏死，同时诱导Bcl-2及Caspase家族活化，引起细胞凋亡的级联反应，并导致细胞凋亡^{[12, 13]}。因此，稳定线粒体膜电位、保护线粒体功能、抑制线粒体参与的细胞坏死和凋亡途径能有效改善I/R损伤^{[8, 9, 10, 11, 12, 13]}。结合我们以往的研究发现，I/R损伤后，由于ROS产生增加，对氧化反应十分敏感的线粒体膜通透性升高，线粒体功能受损，并进一步诱发细胞凋亡，加重细胞损伤^[14]。因此，理论上采用抗氧化药物直接抑制ROS产生可以有效改善线粒体功能。GSH是一种强还原剂，可以减少体内ROS和超氧化物歧化酶的产生^[15]，本研究进一步证实了GSH通过抑制MPTP开放引起的细胞坏死和凋亡，从而起到肝保护作用。本实验结果为临床肝切除或肝移植手术中使用GSH进行肝保护提供了理论依据。