2015, Vol. 36
2. 第二军医大学长海医院口腔科, 上海 200433
2. Department of Stomatology, Changhai Hospital, Second Military Medical University, Shanghai 200433, China
头颈部鳞状细胞癌(head and neck squamous cell carcinoma,HNSCC)是一种非均质癌瘤，好发于口腔、咽部和喉部，其发病率和病死率都较高，5年总体生存率仍维持在50%~60%[1]。目前的研究表明，HNSCC的发生与感染人乳头状瘤病毒、吸烟和饮酒等因素有明显相关性[2]，但其发生、发展的分子机制尚不明确。
MicroRNAs(miRNAs)是一组广泛存在于真核生物中非编码的19到24个核苷酸长度的RNA，在翻译水平调控基因的表达[3]。miRNAs在个体发育、病毒感染及肿瘤的发病机制中均具有重要作用[4, 5]。研究表明，miRNAs 在肿瘤的发病机制中扮演了重要角色，大量的miRNAs起着促癌或抑癌作用[6]。
目前，已有多个miRNAs被证明在HNSCC的发生、发展中起着重要作用。如miR-99a在HNSCC中呈低表达，而过表达miR-99a则能抑制细胞增殖和诱导凋亡[7]；miR-375的表达下调与HNSCC的不良预后有相关性[8]；miR-133a则参与了HNSCC的侵袭和迁移等[9]。
miR-141在胰腺癌、卵巢癌和胃癌中能抑制肿瘤的生长和迁移[10, 11, 12]，但miR-141在HNSCC的作用目前却未见报道。本研究希望通过上调或抑制miR-141的表达水平来探究其在HNSCC发病机制中的作用，以期为抗肿瘤药物的研发提供可能的靶点。
1 材料和方法 1.1 标本收集2010年1月至2013年12月于第二军医大学长征医院手术切除并经病理确诊的HNSCC 19例，其中喉癌11例、口腔鳞状细胞癌8例；男性15例、女性4例，平均年龄(42±8)岁；所有患者术前均未接受放化疗。每例均取癌及癌旁正常组织(距癌组织边缘>2 cm，病理证实无癌细胞)各1块(约1.0 cm×0.5 cm)，－80℃保存。本研究经第二军医大学长征医院伦理委员会审批通过并备案，所有患者均签署知情同意书。
1.2 细胞培养HEK293、人喉癌细胞株(Hep-2)和人舌鳞状细胞癌细胞株(SCC-9)均购自中国科学院上海细胞库。细胞株置于含10% 胎牛血清的DMEM培养液中培养，并加入2 mmol/L 左旋谷酰胺以及100 μg/mL青霉素[生工生物工程(上海)股份有限公司]。具体培养方法参照Wu等[13, 14]的方法。
1.3 荧光实时定量PCR检测miR-141的表达miR-141的表达使用mirVanaTM qRT-PCR miRNA Detection Kit(Ambion，美国)，该引物由上海生物工程技术服务有限公司设计并验证。miR-141顺义链：5′-CGC CAG GAT AAA TTG ACG CAC CAT CTT TAC-3′;反义链：5′-CCG CCT TAA CAC TGT CTG GTA ATC GCC AGG ATA AAT TGA CGC A-3′; 阴性对照顺义链：5′-UUC UCC GAA CGU GUC ACG UTT-3′;反义链：5′-ACG UGA CAC GUU CGG AGA ATT-3′；内参miR-U6：5′-AUA UGG AAC GCU UCA CGA AUU-3′。在定量过程中以同一例患者的癌旁正常组织作为对照，并计算癌组织标本miR-141的相对表达水平。
1.4 MTT检测Hep-2和SCC-9细胞增殖细胞以5×103个/孔的密度接种于96孔板，经5 d培养后，用MTT法检测细胞增殖情况，光密度(D)值均由酶标仪读出。
1.5 miRNA mimics、miRNA反义寡核苷酸(ASO)转染miR-141 mimics以及miR-141 ASO购于GenePharma(中国)，miRNAs mimics、miRNA ASO以及阴性对照使用Lipofectamine 2000(Invitrogen,加拿大)进行转染，转染后48 h的细胞用于实验[15]。
1.6 生物信息学方法预测miR-141的靶基因采用TargetScanHuman(http://www.targetscan.org/vert_61/)预测miR-144的靶基因。
1.7 统计学处理统计分析使用SPSS 17.0软件。数据以 x±s 形式表示，当两组的平均值比较时使用双尾Student’s t检验，配对标本中miR-141水平的比较用秩和检验。检验水准(α)为0.05。
2 结 果 2.1 HNSCC组织和细胞中miR-141的表达水平通过qRT-PCR分析19例HNSCC组织标本miR-141的表达水平，结果显示，19例HNSCC肿瘤组织中的miR-141水平均低于相应的癌旁正常组织(图1A)。统计结果表明：19例HNSCC组织标本中miR-141的平均值低于癌旁正常组织中的miR-141的平均值，HNSCC组织中的miR-141的平均表达量约为正常组织中的37.4%(图1B，P＜0.05)。相对于HEK293细胞，miR-141在Hep-2和SCC-9细胞中均呈低水平表达(图1C，P < 0.05)。
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图 1 miR-141在头颈鳞状细胞癌(HNSCC)组织和细胞中的表达水平 Fig 1 Expression of miR-141 in head and neck squamous cell carcinoma(HNSCC)tissues and cells A: The relative expression of miR-141 in 19 HNSCC tissues and the matched tumor-adjacent normal tissues; B: The mean level of miR-141 in HNSCC tissues and the matched tumor-adjacent normal tissues; C: The miR-141 expressions in Hep-2,SCC-9 and HEK293 cells were assayed by qRT-PCR analysis. *P＜0.05 vs normal tissues; △P＜0.05 vs HEK293 cells group. n=3 in A,n=19 in B,n=3 in C; x±s |
用miR-141 mimics转染Hep-2和SCC-9细胞48 h后,Hep-2和SCC-9细胞中miR-141的表达水平上调(图2A、2B)。MTT检测细胞增殖实验结果显示,上调miR-141表达3 d时能抑制Hep-2和SCC-9的细胞增殖(P＜0.05,图2C、2D)。
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图 2 转染miR-141 mimics后促进Hep-2和SCC-9细胞中miR-141表达及抑制Hep-2和SCC-9细胞增殖 Fig 2 Transfection of miR-141 mimics enhanced the miR-141 expression in Hep-2 and SCC-9 cells and inhibited the proliferation of Hep-2 and SCC-9 cells A,B: 48 h after miR-141 mimics transfection,the miR-141 expressions in Hep-2 and SCC-9 cells were assayed by qRT-PCR analysis; C,D: The cell proliferation was assayed by MTT analysis at the indicated time points. miR-NC: Negative control miRNA. *P＜0.05 vs miR-NC group. n＝3, x±s |
通过转染miR-141 ASO 抑制miR-141的表达，结果表明转染miR-141 ASO 48 h后，在Hep-2和SCC-9细胞中，miR-141的表达水平下调(图3A、3B)。MTT检测细胞增殖实验结果表明,抑制miR-141的表达3 d能促进Hep-2和SCC-9细胞的增殖(P＜0.05,图3C、3D)。
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图 3 转染miR-141 ASO后抑制Hep-2和SCC-9细胞中miR-141表达及促进Hep-2和SCC-9细胞增殖 Fig 3 Transfection of miR-141 ASO down-regulated the miR-141 expressions in Hep-2 and SCC-9 cells and promoted the proliferation of Hep-2 and SCC-9 cells A,B: 48 h after miR-141 ASO transfection,the miR-141 expressions in Hep-2 and SCC-9 cells were assayed by qRT-PCR analysis,the miR-141 expression in normal tissue was arbitrarily defined as 100%; C,D: The cell proliferation was assayed by MTT analysis at the indicated time points. ASO: Antisense oligonucleotide; NC ASO: Negative control miRNA ASO. P＜0.05 vs NC ASO group. n＝3,x±s |
通过生物信息学算法发现，miR-141能够与ZEB1 3′UTR的3个位点结合(图4)。据此，我们推测miR-141可能通过ZEB1抑制HNSCC的生长。
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图 4 ZEB1基因与miR-141的3个结合位点 Fig 4 Putative targeted genes of miR-141 were predicted by Target Scan Human and the three binding sites |
肿瘤是一类复杂的基因突变疾病。在肿瘤中，由于主要信号通路的缺失或改变，失控的细胞失去自然有序的稳态。绝大多数的 HNSCC 发生于口腔、口咽、喉咽以及喉部。尽管目前在手术、放化疗方面取得了进展，但 HNSCC 晚期患者的5年生存率只有50%~60%[1]。目前，已有越来越多证据表明 miRNAs 在多种人类肿瘤细胞中异常表达，并且参与肿瘤细胞的增殖、分化及凋亡等，其在人类肿瘤中的基因突变、缺失或异常表达已成为研究的热点之一[6, 7, 8, 9]。
近期的研究发现miR-141在多种肿瘤的发生、发展中起到重要作用，如miR-141在胰腺癌中通过MAP4K4抑制细胞增殖和侵袭[16]； miR-141可作为判断卵巢癌预后的重要指标[17]； miR-141能抑制胃癌的生长和迁移[18]。但miR-141在HNSCC发生、发展中的作用一直未见报道。本研究表明，HNSCC组织的miR-141表达水平低于癌旁正常组织； 上调miR-141的表达能够抑制Hep-2和SCC-9细胞的增殖，而抑制miR-141的表达可以促进Hep-2和SCC-9细胞的增殖。
通过生物信息学算法发现，miR-141能够与ZEB1 3′UTR的3个位点结合。而有研究表明，ZEB1基因能促进肿瘤发生发展[19]。因此，我们认为miR-141可能通过ZEB1基因，抑制HNSCC的生长。要证实这一点，我们计划在下一步的研究中，首先分析ZEB1 mRNA或蛋白在HNSCC 的表达水平，并考察ZEB1的表达水平与miR-141的表达水平是否具有相关性，然后通过双荧光报告基因的方法证实miR-141是否能靶向抑制ZEB1。
此外，生物信息学算法还显示，除了ZEB1还有其他基因，如TGF-β2、cyclin D2等。TGF-β2[20]和cyclin D2[21]在肿瘤的发生、发展过程中发挥了重要作用。 但是TGF-β2和cyclin D2在HNSCC中的作用还不清楚。我们计划在下一步的研究中，首先分析TGF-β2和cyclin D2 mRNA或蛋白在HNSCC的表达水平，并试图寻找TGF-β2和cyclin D2的表达水平与miR-141的表达水平是否具有相关性，然后通过双荧光报告基因的方法证实miR-141是否能靶向抑制TGF-β2和cyclin D2。
在本次研究中，我们仅证明了miR-141在HNSCC中能够抑制细胞增殖，miR-141是否还参与细胞凋亡及调控细胞周期仍需要进一步证明。
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