胰腺癌起病隐匿，进展快速，治疗难度和死亡率都很高，并且近年来其发病率呈明显上升趋势^[1]。胰腺癌治疗中最有效的手段是早期根治性手术切除^[2]，但目前受诊断水平的限制，胰腺癌的手术切除率只有10%～20%，5年生存率仅为0.4%～3.4%^{[1, 3]}。因此，早期诊断从而早期治疗是改善胰腺癌预后的关键。超声造影增强(contrast-enhanced endoscopic ultrasound，CE-EUS)技术是一种能够对各种病灶进行“血池成像”的新技术^{[4, 5]}，与其他影像技术(如CT、 MRI等)相比，具有安全、无辐射、操作简单、观察实时和价格低廉等优势。CE-EUS通过静脉注射微泡造影剂，扫查界面回声声阻抗差，将病灶从组织中凸显出来，可以作为胰腺癌筛查的常规手段，已成为胰腺疾病诊断的研究热点之一^{[6, 7]}。由于普通的造影剂在胰腺组织中浓度整体偏低，半衰期短，较小的病灶会出现漏诊^[8]等，使得这项技术具有一定的局限性。

近年来，随着分子影像学的高度发展，靶向分子成像技术越来越受到研究者的重视。Hedgehog蛋白几乎在所有胰腺癌中高度表达，且高度表达状态在肿瘤病变早期已出现^{[9, 10]}，而Hedgehog蛋白在正常组织中分布有限，故制备一种能够靶向Hedgehog蛋白的超声造影剂对胰腺癌早期诊断具有重要的意义。聚乳酸-羟基乙酸共聚物[poly(lactic-co-glycolic acid)，PLGA]是经过美国FDA认证可以体内应用的生物降解材料，具有良好的生物相容性，可制备成多种药物的纳米级微粒载体^{[11, 12, 13]}。液态氟碳具有以靶向聚集为基础的超声增强显影性能，当液态氟碳造影剂微粒处于分散状态时，对超声敏感性非常弱，只有当微粒聚集到靶组织或细胞时，才在超声下显影，可作为纳米造影剂中的包裹药物^[14]。全氟溴辛烷(perfluoroctyl bromide，PFOB)是液态氟碳造影剂中的代表性化合物^[15]。本研究利用聚乙二醇(polyethylene glycol，PEG)修饰的PLGA作为液态PFOB的纳米级微粒载体，连接能够靶向早期胰腺癌细胞膜表面Hedgehog蛋白的单抗(Hedgehog mAb)，制备胰腺癌靶向的纳米级超声造影剂，并探讨其体外细胞靶向能力，旨在寻找一种理想的胰腺癌早期诊断的超声造影剂。

真空干燥箱(Binder公司，德国)；Mercury Plus 600 MHz超导核磁共振波谱仪(Varian公司，美国)；超声乳化仪(新芝生物科技有限公司，宁波)；高速离心机(Eppendorf公司，德国)；冷冻干燥机(Virtis公司，美国)；Zeta sizer ZS90电位粒径分析仪(Malvern公司，英国)；透射电镜 (JEM-2010，JEOL公司，日本)；全自动酶标仪(Thermo公司，美国)；气相色谱-质谱联用仪(GC-MS，由GC6890气相色谱仪和5973N质谱检测仪组成，Agilent公司，美国)；荧光显微镜(Leica公司，德国)；FACSCalibur流式细胞仪(BD公司，美国)；聚乳酸-羟基乙酸共聚物(PLGA-COOH，乳酸∶羟基乙酸=50∶50，LAKESHORE公司，美国)；双功能聚乙二醇(NH₂-PEG-COOH，平均相对分子质量5 000，嘉兴博美生物技术有限公司)；Hedgehog mAb(Abcam公司，英国)；香豆素-6(coumarin-6，Sigma-Aldrich公司，美国)；DMEM培养液、胎牛血清(FBS；Gibco公司，美国)，其他试剂均为分析纯。胰腺癌细胞株SW1990和CFPAC-1均购自美国ATCC公司。

将2 000 mg PLGA-COOH溶解在5 mL二氯甲烷中，向溶液中加入50 mg N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)、100 mg 1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐(EDC·HCl)，避光搅拌反应12 h，氮气吹干二氯甲烷，加入乙醚沉淀并洗涤，真空干燥得到PLGA-NHS。称取合成的PLGA-NHS 1 000 mg溶解在2 mL三氯甲烷中，加入300 mg NH₂-PEG-COOH，反应12 h后在甲醇中沉淀并氮气吹干得到PLGA-PEG-COOH。将500 mg PLGA-PEG-COOH溶解在2 mL二氯甲烷中，向溶液中加入15 mg NHS和25 mg EDC·HCl，充分反应后乙醚沉淀，并用乙醚洗去NHS和EDC，真空干燥得到制备纳米造影剂的材料PLGA-PEG-NHS。合成产物溶解于氘代氯仿(CDCl₃)中，利用300 MHz核磁鉴定。

利用乳化挥发法制备包裹PFOB的PLGA纳米粒，具体方法如下：称取50 mg PLGA-PEG-NHS溶解于2 mL 二氯甲烷中作为分散相，加入5 μL PFOB(约9.7 mg)和1 mg荧光染料香豆素-6，充分混匀后倒入10 mL 1%的胆酸钠溶液中，冰水浴下400 W超声乳化30 s，间隔10 s，重复3次。将所得纳米乳化液倒入盛有10 mL水的烧杯中，在室温下开口搅拌约3 h使二氯甲烷挥发，高速离心收集纳米粒。之后将纳米粒分散于5 mL PBS，加入1 000 μg Hedgehog mAb，避光搅拌反应6 h，高速离心收集纳米粒，洗涤3次后冻干即可得固态纳米粒(图1)。抗体连接比例利用酶标仪以BCA法测定抗体蛋白的含量后计算得到。

图 1 胰腺癌靶向纳米造影剂示意图 Fig 1 Diagrammatic sketch of pancreatic cancer-targeted nano-scale ultrasound contrast agent PLGA:Poly(lactic-co-glycolic acid);PFOB:Perfluoroctyl bromide;PEG:Polyethylene glycol; Hedgehog mAb:Hedgehog monoclonal antibody

将适量的靶向纳米造影剂溶液滴到覆盖有碳膜的铜网上，用滤纸吸干多余水分，白炽灯下进一步干燥后，利用透射电镜观察形态。另外分别取纳米造影剂溶液20 μL，加入PBS溶液稀释成1 mL，利用电位粒径分析仪测定纳米粒的粒径和电位，测定条件为25℃、固定角90°。

取纳米粒10 mg，加入5 mL水复溶，将纳米粒溶液置于超滤管(滤过相对分子质量为5 000)中5 000×g超滤离心20 min，再向超滤管中加入5 mL水后离心20 min，重复2次合并滤液，利用GC-MS法测定滤液中游离PFOB的含量。另取纳米粒10 mg，加入5 mL甲醇超声3 min破坏掉纳米粒，高速离心5 min后，取上清液利用GC-MS法测定纳米粒中总PFOB的含量。气相色谱条件为：DB-5MS UI色谱柱(30 m×0.25 mm×0.25 μm)，起始柱温60℃，以8℃/min的速率升至180℃，然后再以20℃/min的速率升至250℃，保持2 min，以排尽样品，进样口温度250℃，检测器温度280℃，载气为氦气，进样量1 μL。质谱条件为：EI离子源，离子源温度230℃，流量1.0 mL/min。进样之后溶剂的延迟运行时间为3.5 min。纳米造影剂的载药量和包封率按照以下公式计算：载药量(%)=(纳米粒中总PFOB量－游离PFOB量)/纳米粒总量×100%，包封率(%)=(纳米粒中总PFOB量－游离PFOB量)/投入的PFOB量×100%。

取20 mg 纳米粒，加入2 mL PBS溶解，装入透析袋中(MWCO 3 500)并封住袋口，透析袋随后放入100 mL的恒温(37℃) PBS中，PBS中加入1 mol/L的水杨酸钠溶液(由于PFOB在水中溶解度较低，加入水杨酸钠后可以增加PFOB的溶解度，以使释放满足漏槽条件)，在搅拌速率为100 r/min的条件下进行释放度测定。分别于0.5、1、2、3、6、9、12、18、24、36、48 h吸取1 mL PBS测定PFOB的释放量，并补加1 mL PBS。

采用Hedgehog高表达的人胰腺癌SW1990细胞株和Hedgehog低表达的人胰腺癌CFPAC-1细胞株对包裹PFOB纳米粒的体外靶向性进行评价，细胞培养液为添加10% FBS的DMEM培养液，培养环境为37℃、5% CO₂的孵箱。取对数生长期细胞按照每孔2×10⁵个的密度接种于6孔板，培养24 h使细胞贴壁。之后每孔加入100 μL纳米造影剂溶液(500 μg/mL)，37℃孵育1 h后，PBS润洗3次，利用荧光显微镜观察纳米造影剂的细胞摄取情况。之后利用胰酶将细胞消化，离心重悬至500 μL，利用流式细胞仪定量分析细胞对纳米造影剂的摄取。为进一步评价靶向Hedgehog抗体对纳米造影剂入胞的作用，细胞预先加入过量的Hedgehog mAb(10 μg)孵育30 min，封闭Hedgehog蛋白受体，然后每孔加入100 μL纳米造影剂溶液(500 μg/mL)，37℃孵育1 h后，分别通过荧光显微镜和流式细胞仪进行观察和检测。

取合成的产物PLGA-PEG-NHS溶于CDCl₃，利用300 MHz核磁共振成像，图2显示的是合成的PLGA-PEG-NHS的谱图，其中峰1、2、5为PLGA的特征峰，峰4为PEG的特征峰，峰3为NHS的特征峰。核磁共振图谱表明所合成的材料为制备纳米粒所需的目标产物PLGA-PEG-NHS。

图 2 PLGA-PEG-NHS的核磁共振氢谱图 Fig 2 1H-NMR spectrum of the prepared PLGA-PEG-NHS 1,2,5: PLGA; 3: NHS; 4: PEG. PLGA: Poly(lactic-co-glycolic acid); PEG: Polyethylene glycol;NHS: N-hydroxysuccinimide

利用BCA法测得纳米造影剂的抗体含量，结果为每1 mg的纳米造影剂含有17.9 μg的抗体，抗体的连接比例为(17.9±3.1)μg/mg。将制得的靶向纳米造影剂于电子显微镜下观察，发现粒子为形态比较规则的圆球形，大小均匀，分散度好，没有出现粒子团聚的现象(图3A)。电位粒径分析仪测得靶向纳米造影剂的粒径在95～370 nm范围内呈正态分布(图3B)，平均粒径为198.9 nm，多分散系数PDI为0.26；靶向纳米造影剂的表面Zeta电位为－31.8 mV(图3C)。

图 3 靶向纳米造影剂的形态(A)、 粒径(B)和Zeta电位分布(C) Fig 3 The morphology (A),size (B) and Zeta potential distribution (C) of targeted nano-scale ultrasound contrast agent

GC-MS法测定PFOB含量的标准曲线为 y=12.609x +0.444 1 (R²=0.999 7)，日内精密度RSD为0.71%。纳米造影剂包封率测定结果为(63.7±3.9)%( n =3)，载药量测定结果为(14.3±0.9)%( n= 3)。

利用透析法考察靶向纳米造影剂的体外释药特性，对PFOB的释放进行拟合得到曲线：Y =16.52ln(t)+19.446(R²=0.997 1)，该曲线符合一级速率方程，即释放是按时间变化先多后少的非恒速释药。由图4可见，纳米造影剂中的PFOB释放可以分成3个阶段：第一阶段释放比较快，前3 h有一个突释，释放量占总药量的37.4%，这是纳米造影剂表层的PFOB从纳米造影剂脱离导致的快速释放；3 h后进入了一个平稳释放的状态，这是纳米造影剂内部的PFOB向表层扩散从而进入了释放液中，前24 h累计释放了73.2%；24 h后药物的扩散进入一个平衡状态，纳米造影剂中的PFOB释放减缓。前48 h PFOB累计释放了85.3%。

图 4 纳米造影剂中PFOB的体外释放曲线 Fig 4 Release curves of PFOB from targeted nano-scale ultrasound contrast agent PFOB: Perfluoroctyl bromide. n=3,x±s

利用荧光显微镜观察胰腺癌细胞对靶向纳米造影剂的摄取(图5)，可以发现高表达Hedgehog抗原的SW1990细胞对靶向纳米造影剂的摄取量比较多，绿色荧光在细胞内分布比较均匀，荧光强度明显高于非靶向纳米造影剂的对照组；而不表达Hedgehog抗原的CFPAC-1细胞对靶向纳米造影剂的摄取量没有明显增加，说明Hedgehog抗体修饰的纳米造影剂对表达Hedgehog抗原的胰腺癌细胞有靶向作用。利用过量的Hedgehog抗体封闭细胞表面的Hedgehog抗原后，SW1990细胞对靶向纳米造影剂的摄取量显著下降，表明在SW1990细胞对靶向纳米造影剂的摄取过程中，Hedgehog抗原-抗体介导的内吞途径发挥了重要作用。利用流式细胞仪对纳米造影剂摄取的定量研究发现，靶向纳米造影剂作用1 h后，SW1990细胞的平均荧光强度为1 463.9，而非靶向纳米造影剂作用的SW1990细胞平均荧光强度只有352.6，仅为前者的1/4，而利用抗体封闭Hedgehog抗原后，靶向纳米造影剂作用的细胞平均荧光强度下降为414.1，下降非常明显。而Hedgehog抗原低表达的CFPAC-1细胞的平均荧光强度与纳米造影剂表面是否连接抗体关联不大，靶向和非靶向纳米造影剂组的细胞平均荧光强度分别为389.7和205.6(图6)。

图 5 荧光显微镜观察纳米造影剂的细胞摄取情况 Fig 5 Cellular uptake of nano-scale ultrasound contrast agent observed by fluorescence microscope T-UCA: Cells were treated with targeted nano-scale ultrasound contrast agent; UCA: Cells were treated with non-targeted nano-scale ultrasound contrast agent; T-UCA + Hedgehog mAb: Cells were pretreated with excessive Hedgehog monoclonal antibody before treated with targeted nano-scale ultrasound contrast agent. Original magnification： ×20

图 6 流式细胞仪检测SW1990细胞(上排)和CFPAC-1细胞(下排)对纳米造影剂的摄取情况 Fig 6 The cellular uptake of nano-scale ultrasound contrast agent determined by flow cytometry (The upper line for SW1990 cells and the lower line for CFPAC-1 cells) Control: The untreated cells; T-UCA: Cells were treated with targeted nano-scale ultrasound contrast agent; UCA: Cells were treated with non-targeted nano-scale ultrasound contrast agent; T-UCA + Hedgehog mAb: Cell were pretreated with excessive Hedgehog monoclonal antibody before treated with targeted nano-scale ultrasound contrast agent. **P < 0.01 vs other groups. n=3,x±s

近年来CE-EUS已成为胰腺癌诊断的首选方法，超声造影剂可以大大提高CE-EUS的敏感性。现有的超声造影剂主要为微泡造影剂，微泡的直径较大(多为2～6 μm)，存在无法穿透血管壁到达靶细胞、特异性不强、半衰期短等局限^[16]，易造成误诊或漏诊^[16]。而纳米级造影剂具有穿透血管内皮间隙使血管外靶组织显像的能力^[17]，因此靶向性、纳米级的造影剂成为近年来分子影像学的研究热点。

为克服传统微泡造影剂的缺点，本课题利用PLGA、双功能PEG和PFOB构建了一种能对胰腺癌特异性靶向的纳米级造影剂。PFOB的聚集成像性能克服了微泡造影剂的声影现象与背景噪声，从而提高成像的分辨准确度^[15]。PLGA是一种优良的纳米粒制备材料，但单独应用制备的纳米微粒会在体内清除迅速，PEG的修饰可以减少网状内皮系统(reticuloendothelial system，RES)对PLGA纳米微粒的清除，延长其在血液循环的存留时间，有利于纳米粒到达肿瘤部位^[18]，同时PEG有独特的亲水特性，桥接Hedgehog mAb后可使得后者分布于纳米粒表层，有助于单抗靶向功能的发挥。

本研究采用乳化挥发法制备纳米粒时，目标粒径为200 nm左右，本实验制得的纳米粒的平均粒径为198.9 nm，制得的靶向纳米造影剂稳定性好，粒径大小均匀，该粒径大小可以充分利用肿瘤的增强渗透滞留效应 (enhanced permeability and retention effect，ERP)，使纳米造影剂在肿瘤部位滞留和蓄积^[19]；靶向纳米造影剂的表面Zeta电位为-31.8 mV，Zeta电位的绝对值在30 mV以上时，纳米粒表面的净电荷足以让微粒间产生较大的静电斥力，使得纳米粒稳定性提高，保持粒径大小均匀，减少聚集现象^[20]。体外释放实验表明，纳米粒PFOB的释放符合一级速率方程，经3 h的突释后进入平稳释放状态，24 h后释放减缓，前48 h累计释放了85.3%。靶向纳米造影剂作为肿瘤特异性诊断试剂，需要在注射后靶向并富集到肿瘤部位，然后进行超声诊断成像，在体内这一过程需要一定时间才能实现，因此PFOB不能立即全部释放，但也不能释放太缓慢，而我们制得的纳米造影剂的释放特性可以满足这一条件。在体外寻靶实验中，靶向造影剂被高表达Hedgehog抗原的SW1990细胞大量摄取，而不表达Hedgehog抗原的CFPAC-1细胞未见特异性的摄取增强。利用抗体封闭Hedgehog抗原后，靶向纳米粒随着抗体浓度增高而与细胞的结合能力减弱，可进一步证明靶向纳米造影剂与SW1990细胞的特异性结合，即抗体导向的靶向纳米造影剂具有靶向结合胰腺癌细胞的能力。

综上所述，本研究选用PFOB包裹在PEG修饰的PLGA纳米微粒中得到纳米级超声造影剂，在表面连接Hedgehog单抗以实现胰腺癌的靶向性，体外评价表明具有成为胰腺癌靶向的新型造影剂的潜力，后期我们将进一步在动物体内验证其靶向性和超声造影增强效果。